長雙歧桿菌BBMN68抗膽鹽脅迫反應(yīng)機(jī)制及雙組分系統(tǒng)在膽鹽脅迫應(yīng)答中的作用

1、長雙歧桿菌BBMN68抗膽鹽脅迫反應(yīng)機(jī)制及雙組分系統(tǒng)在膽鹽脅迫應(yīng)答中的作用雙歧桿菌是人體腸道常見的共生微生物, 一些雙歧桿菌具有良好的益生保健功效 , 作為益生菌廣泛應(yīng)用于發(fā)酵乳制品的生產(chǎn)。雙歧桿菌經(jīng)口攝入后 , 最終定植于含有 0.05%-2.0%膽鹽的大腸中。膽鹽具有殺菌作用 , 能夠破壞細(xì)菌的細(xì)胞膜結(jié)構(gòu), 進(jìn)而引起蛋白質(zhì)錯誤折疊和 DNA氧化損傷等危害 , 因此耐受生理?xiàng)l件下的膽鹽脅迫是雙歧桿菌在人體發(fā)揮益生作用的必要條件。本研究采用轉(zhuǎn)錄組學(xué)和蛋白組學(xué)技術(shù)相結(jié)合的手段, 篩選了 Bifidobacterium longum BBMN68膽鹽脅迫反應(yīng)中的差異表達(dá)基因和蛋白質(zhì),并對其中部分基

2、因進(jìn)行了功能驗(yàn)證, 研究結(jié)果揭示了 B.longum BBMN68的膽鹽脅迫應(yīng)答機(jī)制 , 研究內(nèi)容如下： (1) B. longum BBMN68 膽鹽脅迫條件下轉(zhuǎn)錄組和蛋白組圖譜的建立。以含有 0.075%牛膽鹽 (ox-bile)的培養(yǎng)基模擬人體腸道環(huán)境的膽鹽脅迫條件 , 應(yīng)用基于第二代高通量測序的RNA-Seq方法篩選了 236 個轉(zhuǎn)錄水平顯著變化( 3.0 倍 ,p<0.001)的基因 , 同時利用 2-DE 和質(zhì)譜鑒定分離了44 個胞內(nèi)可溶性差異表達(dá)蛋白 ( 1.6 倍,p<0.01),其中 15 個基因的表達(dá)在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平同時上調(diào)或下調(diào) , 結(jié)果表明

3、B. longum BBMN68的膽鹽脅迫應(yīng)答是一個復(fù)雜的代謝調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。 (2) 生物信息學(xué)分析揭示B. longum BBMN68 的抗膽鹽脅迫反應(yīng)機(jī)制。通過 GO和 COG聚類分析顯示膽鹽脅迫條件下的差異表達(dá)基因和蛋白參與菌體生理代謝的各個方面 , 進(jìn)而利用 NCBI、UniProt 和 KEGG數(shù)據(jù)庫對差異表達(dá)基因和蛋白質(zhì)的功能進(jìn)行分析, 提出了雙歧桿菌的抗膽鹽脅迫反應(yīng)機(jī)制。一是膽鹽抗性機(jī)制 , 包括膽鹽水解酶、膽鹽泵出轉(zhuǎn)運(yùn)體系以及一些阻止膽鹽入侵的膜蛋白；二是膽鹽適應(yīng)機(jī)制 , 涉及普遍脅迫應(yīng)答、 多個中心代謝途徑 ( 例如雙歧支流糖代謝、氨基酸、核苷酸和脂肪酸的合成) 、跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)、基因

4、轉(zhuǎn)錄和翻譯進(jìn)程、以及菌體的分裂增殖等。(3) 膽鹽作為腸道環(huán)境信號促進(jìn) B. longum BBMN68 與宿主間相互作用。 B. longum BBMN68感應(yīng)膽鹽信號 , 提高分選酶 (sortase A) 的表達(dá) , 分選酶促進(jìn)菌毛結(jié)構(gòu)和一些表面蛋白錨定于細(xì)胞壁上 , 可能與菌體的粘附特性相關(guān)。菌體自聚集和細(xì)胞粘附實(shí)驗(yàn)表明 , 膽鹽脅迫條件下 BBMN68菌體自聚集程度下降 , 同時對 HT-29 細(xì)胞的粘附能力提高了 5 倍, 結(jié)果證實(shí)膽鹽能夠促進(jìn) BBMN68對人體腸道的粘附定植。同時, 自誘導(dǎo)劑 -2(AI-2)的合成受膽鹽誘導(dǎo) , 促進(jìn)了 B.longum BBMN68與其他腸道

5、細(xì)菌的相互作用。此外 , 氨基糖苷核苷轉(zhuǎn)移酶的上調(diào)表達(dá)賦予了B. longum BBMN68對氨基糖苷類抗生素的抗性 , 有利于其在長壽老人腸道中的長期定植。(4) 雙組分系統(tǒng)SenX3-RegX3在 B. longum BBMN68膽鹽脅迫反應(yīng)中的調(diào)控作用。利用細(xì)菌單雜交和MEME分析工具預(yù)測了響應(yīng)調(diào)節(jié)蛋白RegX3的 DNA識別位點(diǎn) GARRACY,通過 Target Explorer 篩選了 9 個 SenX3-RegX3的靶基因 , 進(jìn)一步用體外 EMSA驗(yàn)證了該雙組分系統(tǒng)對 pstS 基因的調(diào)控；利用乳酸乳球菌 NICE表達(dá)系統(tǒng)異源超量表達(dá) pstS, 重組菌株的膽鹽耐受能力顯著提高。 結(jié)果表明雙組分系統(tǒng) SenX3-RegX3能夠感應(yīng)膽鹽脅迫信號 , 并激活 pstS 基因的表達(dá) , 通過提高 Pi攝取以加速體內(nèi)ATP的積累 , 從而賦予菌體更高的抗膽鹽脅迫水平。綜上所述 , 本研究首次采用了轉(zhuǎn)錄組學(xué)和蛋白組學(xué)相結(jié)合的方法, 全面分析了 B. lo