螢光是一種光放射現(xiàn)象,當一個適當波長的光照射具有螢光性質(zhì)的分

1、螢光是一種光放射現(xiàn)象，當一個適當波長的光照射具有螢光性質(zhì)的分子，分子會吸收光的能量而被激發(fā)至高能量狀態(tài)，並在極短時間(10-8-10-4秒)內(nèi)，分子即回復低能量狀態(tài)，同時以放光的形式將多餘能量釋出，此即為螢光。依照所使用的激發(fā)光源可區(qū)分為傳統(tǒng)光源激發(fā)螢光及雷射激發(fā)螢光兩種。傳統(tǒng)光源激發(fā)螢光(Conventional Lamp Induced Fluorescence)最早於1981年由Jorgenson和Lukacs提出，當用的傳統(tǒng)光源有汞、氘等電弧燈，首先以濾光片自發(fā)射光帶中分離出所需的波長，再經(jīng)過聚焦來波發(fā)分子，產(chǎn)生螢光，由於傳統(tǒng)光源皆為連續(xù)波長發(fā)射的光源，故必需利用濾光皮或單光器來分離特

2、定的波長，大幅降低激發(fā)光的入射光強度而同時也就限偵測的靈敏度質(zhì)偵測極限一般在10-5-10-8M左右。雷射激發(fā)螢光(Laser Induced Fluorescence, LIF)與傳統(tǒng)光源比較，以雷射為激發(fā)光源的靈敏度較高，因為雷射具有高強度，帶寬窄及同調(diào)性的特點，所以容易以透鏡聚焦，其單位面積上的強大能量，能有效提高靈敏度，些種偵測方式稱為雷射激發(fā)螢光，文獻上曾報導目前電射激發(fā)螢光的最低偵測極限可達10-21mol。代表性光學光路1.非相干光源CE螢光檢測器光束入射單色儀之前先通過紅外輻射濾波器 (水柱) ，用於吸收紅外輻射，保護單色儀不至因過熱受損。該螢光檢測器使用了雙單色儀，輸出波長可

3、在200nm和800nm之間連續(xù)可調(diào)。因此，可根據(jù)需要選擇波長，是它的一大優(yōu)點。此外，雙單色儀比通常採用的濾光片可選擇更窄的帶寬，減少散射光。但和雷射光源相比，其光強較弱，激發(fā)效率低。2.共焦型LIF檢測器共焦結(jié)構(gòu)的特點是將樣品和狹縫精確地放在高數(shù)值孔徑(Numerical Aperture, N.A.) 物鏡的兩個焦點上，把樣品區(qū)帶的螢光成像在狹縫上，精確地調(diào)整狹的位置和大小，就可以有效地剔除管壁的螢光干擾。3.雷射誘導螢光顯微鏡採用前照明微鏡結(jié)構(gòu)，通過同一物鏡收集螢光發(fā)射，採用二向色反射鏡分離螢光和反射光。4.軸向激發(fā)CCD成像檢測的LIF檢測器用CCD作CE的LIF檢測有許多優(yōu)點，與最好

4、的PMT相比，它的內(nèi)電流低，量子效率高，更主要的是它有兩維模式。但是，CCD的讀取速率低，在通常的CE檢測中有可能漏峰或不能作定量分析。為了提高CCD檢測靈敏度，同時避免漏峰檢測，採用軸向激發(fā)和CCD的時延遲積分模試式具有一定優(yōu)越性。雷射從毛細管出口端聚焦入射，照明2cm區(qū)段，在此區(qū)段的分離組被激發(fā)產(chǎn)生螢光，收集後成像在CCD上。激發(fā)波長選擇波長的選擇必須與待測樣品的吸收光譜匹配。如果用同一衍生試劑標記，就可選擇到最佳波長，對常規(guī)光源，可用激發(fā)濾光片或單色儀來選擇波長，雷射的波長選擇範圍有限，除了可調(diào)諧的染料雷射外，一般雷射只輸出固定的一個波長或分立的幾個波長，這是激光光源不足之處。因此，在L

5、IF情況下，就需要從雷射可能輸出波長和化合物衍生試劑的吸收波長兩個方面來考慮，作出恰當?shù)倪x擇。樣品的螢光標記螢光檢測有很高的靈敏度?？上?，大多數(shù)物質(zhì)的螢光量子產(chǎn)額很低，或不發(fā)螢光，特別是感興趣的一些生物分子，如氨基酸和多數(shù)蛋白質(zhì)等。因此，需要借助衍生(derivatization)或標記(labeling)技術(shù)，對不發(fā)螢光的樣品進行螢光標記。一些常用的螢光衍生試劑如下表所示：試劑激發(fā)和發(fā)射波長反應(yīng)物螢光素異硫氰酸鹽(FITC)(fluorescein isothiocyanate)ex490nmem519nm氨基酸、多肽、蛋白質(zhì)螢光胺(fluorescamine)ex390nmem450nm伯

6、氨基酸9-芴基甲基氯甲酚酯(FMOC)(9-fluorenylmethyl chloroformate)ex260nmem305nm鄰苯二醛(OPA)(o-phthaldialdehyde)ex350nmem450nm氨基酸、多肽、蛋白質(zhì)、胺3-(4-羧基甲酰基)-2奎寧羰醛(CBQCA)3-(4-carboxybenzoyl)-2-quinolineex456nmem552nm氨基酸、多肽萘二醛衍生物(NDA)(naphthalene-2, 3-dicarboxyaldehyde)ex442nmem490nm4-chloro-7nitrobenz-2-oxa-1, 3-diazoleex470nmem530nm