離體大鼠海馬神經元自發(fā)放電活動一般特征的研究

1、離體大鼠海馬神經元自發(fā)放電活動一般特征的研究                        作者：楊潤生，潘盛武，方穎，楊盛昌【摘要】  觀察離體大鼠海馬錐體細胞的生理電發(fā)放模式。在腦脊液孵育下，將玻璃微電極插入到離體大鼠海馬腦片錐體細胞附近，進行胞外電脈沖記錄，微機記錄并保存電信號。共觀察到海馬部神經元自發(fā)放電主要呈5種特征，分別為不規(guī)則發(fā)放、單波規(guī)則發(fā)放

2、、緊張發(fā)放、陣發(fā)排放及周期排放型等形式。說明神經元的生理電發(fā)放模式可能與細胞的排列次序、生理應答呈一定的相關性。 【關鍵詞】  大鼠海馬；微電極；腦片；自發(fā)放電    Abstract：To study the general characters of the rat hippocampus of the spontaneous electric activity of the ex-vivo pyramidal cells. We recorded the electrophysiology near the hippocampal pyramida

3、l cells of the rat limbic system by capillary glass microelectrode with continous perfusion of the artificial cerebrospinal fluid(ACSF).Results showed that five characters of spontaneous were recorded by the rat hippocampal cells,they were un-regulation release,single wave regular release,intension

4、release,paroxysm release and period release.It proves that the characters of the rat hippocampus of the spontaneous electric activity may connect with the arrangement of the cells,and the respondence of the stimulants.    Key words：Rat hippocampus；Microelectrode；Brain slice；Spontaneou

5、s discharge    1  引  言    邊緣系統(tǒng)是大腦皮層內側皮質包裹的部分腦區(qū)之一，其主要組成包括了海馬結構 (hippocampal)1。依據細胞的特性、分布和傳入的不同，將海馬分為四個區(qū)，即CA1、CA2、CA3和CA4。目前認為，海馬組織主要參與學習和記憶，是學習和記憶的通道,神經元的信息傳導功能主要是通過以電信號的形式進行的，因此，微電極電生理記錄技術對揭示神經元的工作狀態(tài)有很重要的研究價值。目前，用腦薄片技術研究哺乳類海馬錐體細胞的自發(fā)放電活動國內尚未有相關報道，本研究使用大鼠海馬部作為腦薄

6、片研究材料，用玻璃微電極進行細胞外電信號引導，微機記錄波形及電脈沖聲音，觀察神經元自發(fā)放電特點。    2  材料和方法    2.1  材料    本實驗選用1月齡左右的大白鼠60只，雌雄不限。    2.2  實驗方法    在乙醚麻醉下快速斷頭，取出大腦，置于人工腦脊液（ACSF）的小燒杯中降溫1 min，然后在冰臺上用刀片進行修整，保留所需部位，再用502膠水將其固定在振動切片機的推進臺上，固定好后迅速向切片

7、槽內倒入充有95%O2+5%CO2的ACSF,深度以浸沒腦薄片為宜，切好后用平板小勺子將腦薄片移入孵育槽內的尼龍網上并立即進行灌流。腦脊液灌流速度為23 ml/min。孵育12 h后可進行實驗。    采集電極為玻璃微電極，尖端阻抗為46 M，內充3 mol/L的NaCl，在微電極推進器的幫助下，插入到海馬的CA1區(qū)進行記錄，微機保存所得數據并同時進行監(jiān)聽放電情況。    3  主要儀器設備及灌流液    TCL微機；HSS-1（B）型恒溫浴槽（成都儀器廠）；微電極拉制器（三菱公司，日本）；SW

8、F-2W微電極放大器（成都儀器廠）；RM6240BD型多道生理信號采集處理系統(tǒng)（成都儀器廠）；體視顯微鏡（麥克奧迪，廈門）；步進式微電極操縱器（NARISHIGE,日本）；氧氣瓶；江灣V-4型振動切片機（上海第二軍醫(yī)大學）。    人工腦脊液 (artificial cerebrospinal fluid, ACSF)的配方2為（mmol/L）：NaCl124, KCl4、MgSO4·7H2O2、CaCl22、NaHCO3 26、NaH2PO4·2H2O1.25、Glucose10和蒸餾水，pH值在7.2左右，現配現用。  

9、  4  實驗結果     本實驗中，我們選擇在活性較好的海馬腦薄片標本上CA1區(qū)處，共記錄到120個進針位點的自發(fā)放電活動，根據其放電形式和特征，大致可歸納出以下幾種類型：    4.1  不規(guī)則發(fā)放    此類單位的數量為33/120，占27.5%。電信號單位出現的頻率、幅度及持續(xù)時間都不是很穩(wěn)定，單個發(fā)放與陣發(fā)夾雜進行，最大峰峰值在1 600 V左右，不規(guī)則發(fā)放是本實驗中能觀察到的細胞放電類型中出現頻率較多的一類（見圖1）。 4.2  單波規(guī)則發(fā)放 

10、   此類單位的數量為50/120，占41.7%。電信號單位出現的頻率、幅度及持續(xù)時間都比較穩(wěn)定，其峰峰值是幾種類型發(fā)放中最大的一種。本實驗記錄中最大幅度可達8 000 V，一般的發(fā)放也可達到1 5001 800 V。本類電發(fā)放幅度均一，頻率穩(wěn)定，是本實驗能觀察到的細胞放電類型中幅度最大，且出現頻率最多的一類波形（見圖2）。    4.3  緊張發(fā)放型    該型單位發(fā)放數量為16/120，占13.3%。其發(fā)放特點是放電極為迅速，發(fā)放頻率相當高，可達0.02 ms。幅度則較低，平均約1 000 V（見圖3

11、）。    4.4   陣發(fā)排放型    此類單位的數量較少，只有5/120，占4.1%。其特點是暴發(fā)期間隔很長，一般在37 s發(fā)放一次，最長間隔可達120 s以上，最大峰峰值在1 300 V左右。最密集的單次陣發(fā)排放可達60個波形以上（見圖4）。    4.5  周期排放型    本實驗中觀察到，以此類型發(fā)放的單位所占比率不高，為16/120，占13.3%。其發(fā)放特點有明顯的周期性且呈串式發(fā)放，每串的放電為1124個波形，不同單位的發(fā)放周期不盡

12、相同，從幾秒到數十秒不等，每個單位的發(fā)放周期比較穩(wěn)定，每一周期內可明顯地劃分為放電期和休止期，放電期的總脈沖數沒有一定的，放電幅度一般在1 500 V左右（見圖5）。5  討  論    海馬神經元放電類型中的不規(guī)則發(fā)放型、單波規(guī)則發(fā)放、緊張發(fā)放型、陣發(fā)排放型及周期排放發(fā)等特征在海馬錐體細胞部是比較常見的電活動方式，究其原因，可能與錐體細胞的特征有關。海馬錐體細胞的胞體呈錐形，細胞排列整齊而緊密，其間只有少量的神經細胞（如籃細胞、間隙細胞和門區(qū)細胞等）散布在各錐體層中，而CA1區(qū)的錐體細胞的頂樹突上的樹突棘結構較簡單，當微電極所處的位置合適時，

13、電信號就有可能發(fā)生諧振或減振等物理現象，從神經元的應答方面分析，不同的電信號則很有可能代表某種生理信息的表達。    據報道，在腦的許多結構如大腦皮層2-3、下丘腦4、海馬3,5-6等存在KATP通道，但由于所采用細胞的發(fā)育水平不同和所用的記錄方式不同，所報道的KATP通道在激活條件、單通道電導、通道的整流特性、藥物作用等方面存在著很大的差異。其中，不規(guī)則連續(xù)放電、慢速放電、陣發(fā)性排放、周期性排放等四種基本類型與大鼠下丘腦薄片室旁核神經元7，蟾蜍視頂蓋腦薄片神經元自發(fā)放電的形式基本相似8，因動物種類、腦薄片部位等因素的差異而呈現不同的電發(fā)放特征，這些差異主要表現在

14、放電持續(xù)的時間、頻率、幅度以及潛伏期等方面?！尽?#160; 1孫久榮.神經解剖生M.北京大學出版社,2004：226-227.2Ashford MLJ,Sturgess NC,Trout NJ et al.Adenosine-5-triphosphate sensitive ion channels in neonatal rat cultured neuronsJ.Pflugers Arch,1988,214:297-304.3Ohno-Shosaku T,Yamamoto C.Identification of an ATP-sensitive K+ channel in rat cul

15、tured cortical neuronsJ.Pflugers Arc,1992,422:260-266 4Ashford MLJ,Boden PR,Treherne JM.Glucose induced excitation of hypothalamicneurones is mediated by ATP-senditive K+ channelJ. Pflugers Arc,1990,415:479-483.5Politi DMT,Rogawski MA.Glyburde senditive K+ channels in cultured rat hippocampal neuron

16、s:activation by cromakalim and energy depleting conditionsJ.Mol Pharmacol,1991,40:308-315.6Zawar C,Plant TD,Schirra C，et al.Cell-type specific expression of ATP-sensitive potassium channels in the rat hippocampusJ.J Physiol(Lond),1999,514:327-341.7邪寶仁.5-HT對大鼠下丘腦腦薄片室旁核神經元自發(fā)放電活動的作用J.生理學報，1990，42：202-2

17、06.8楊盛昌,潘盛武.蟾蜍視頂蓋細胞自發(fā)活動特性腦片灌流研究J.廣西師范大學學報(版),1994，12(1):87-93. 1             4  實驗結果     本實驗中，我們選擇在活性較好的海馬腦薄片標本上CA1區(qū)處，共記錄到120個進針位點的自發(fā)放電活動，根據其放電形式和特征，大致可歸納出以下幾種類型：    4.1  不規(guī)則發(fā)放    此類單位的

18、數量為33/120，占27.5%。電信號單位出現的頻率、幅度及持續(xù)時間都不是很穩(wěn)定，單個發(fā)放與陣發(fā)夾雜進行，最大峰峰值在1 600 V左右，不規(guī)則發(fā)放是本實驗中能觀察到的細胞放電類型中出現頻率較多的一類（見圖1）。 4.2  單波規(guī)則發(fā)放    此類單位的數量為50/120，占41.7%。電信號單位出現的頻率、幅度及持續(xù)時間都比較穩(wěn)定，其峰峰值是幾種類型發(fā)放中最大的一種。本實驗記錄中最大幅度可達8 000 V，一般的發(fā)放也可達到1 5001 800 V。本類電發(fā)放幅度均一，頻率穩(wěn)定，是本實驗能觀察到的細胞放電類型中幅度最大，且出現頻率最多的一類波形（見圖

19、2）。    4.3  緊張發(fā)放型    該型單位發(fā)放數量為16/120，占13.3%。其發(fā)放特點是放電極為迅速，發(fā)放頻率相當高，可達0.02 ms。幅度則較低，平均約1 000 V（見圖3）。    4.4   陣發(fā)排放型    此類單位的數量較少，只有5/120，占4.1%。其特點是暴發(fā)期間隔很長，一般在37 s發(fā)放一次，最長間隔可達120 s以上，最大峰峰值在1 300 V左右。最密集的單次陣發(fā)排放可達60個波形以上（見圖4）。 

20、   4.5  周期排放型    本實驗中觀察到，以此類型發(fā)放的單位所占比率不高，為16/120，占13.3%。其發(fā)放特點有明顯的周期性且呈串式發(fā)放，每串的放電為1124個波形，不同單位的發(fā)放周期不盡相同，從幾秒到數十秒不等，每個單位的發(fā)放周期比較穩(wěn)定，每一周期內可明顯地劃分為放電期和休止期，放電期的總脈沖數沒有一定的，放電幅度一般在1 500 V左右（見圖5）。5  討  論    海馬神經元放電類型中的不規(guī)則發(fā)放型、單波規(guī)則發(fā)放、緊張發(fā)放型、陣發(fā)排放型及周期排放發(fā)等特征在海馬錐體細

21、胞部是比較常見的電活動方式，究其原因，可能與錐體細胞的特征有關。海馬錐體細胞的胞體呈錐形，細胞排列整齊而緊密，其間只有少量的神經細胞（如籃細胞、間隙細胞和門區(qū)細胞等）散布在各錐體層中，而CA1區(qū)的錐體細胞的頂樹突上的樹突棘結構較簡單，當微電極所處的位置合適時，電信號就有可能發(fā)生諧振或減振等物理現象，從神經元的應答方面分析，不同的電信號則很有可能代表某種生理信息的表達。    據報道，在腦的許多結構如大腦皮層2-3、下丘腦4、海馬3,5-6等存在KATP通道，但由于所采用細胞的發(fā)育水平不同和所用的記錄方式不同，所報道的KATP通道在激活條件、單通道電導、通道的整流特

22、性、藥物作用等方面存在著很大的差異。其中，不規(guī)則連續(xù)放電、慢速放電、陣發(fā)性排放、周期性排放等四種基本類型與大鼠下丘腦薄片室旁核神經元7，蟾蜍視頂蓋腦薄片神經元自發(fā)放電的形式基本相似8，因動物種類、腦薄片部位等因素的差異而呈現不同的電發(fā)放特征，這些差異主要表現在放電持續(xù)的時間、頻率、幅度以及潛伏期等方面?！尽?#160; 1孫久榮.神經解剖生M.北京大學出版社,2004：226-227.2Ashford MLJ,Sturgess NC,Trout NJ et al.Adenosine-5-triphosphate sensitive ion channels in neonatal rat cultured neuronsJ.Pflugers Arch,1988,214:297-304.3Ohno-S