固體脂質(zhì)納米粒的研究及應(yīng)用

1、固體脂質(zhì)納米粒的研究及應(yīng)用劉春喜1，張娜1*（1.山東大學(xué)藥學(xué)院，濟(jì)南 250012；）摘要自Müller 等人首次提出固體脂質(zhì)納米粒(solid lipid nanoparticles, SLN) 以來，SLN作為一種新型的脂質(zhì)藥物傳輸載體而備受關(guān)注。SLN用生理相容性的脂質(zhì)或類脂質(zhì)等常用的藥劑輔料制備而成，綜合了其他微粒傳輸系統(tǒng)如聚合物納米粒、脂肪乳和脂質(zhì)體的種種優(yōu)點(diǎn)，包括物理穩(wěn)定性高；防止藥物降解，提高藥物穩(wěn)定性；緩釋性能好，耐受性強(qiáng)等等。此領(lǐng)域的研究表明，在最佳條件下，SLN可適用于疏水或親水性藥物的傳遞，從而實(shí)現(xiàn)最佳微粒載體系統(tǒng)的要求。本文將綜述SLN在基因傳遞、蛋白多肽類

2、藥物非注射給藥、難溶性藥物增溶及靶向給藥系統(tǒng)中的研究和應(yīng)用。關(guān)鍵詞：固體脂質(zhì)納米粒；基因傳遞；蛋白多肽類藥物非注射給藥；難溶性藥物增溶；靶向給藥系統(tǒng)Studies and applications on Solid lipid nanoparticlesLIU Chun-xi1, ZHANG Na1*(1. School of Pharmaceutical Science, Shandong University, Jinan 250012, China)Abstract Since their first description by Müller et al., solid li

3、pid nanoparticles (SLN) have attracted increasing attention as an efficient and non-toxic alternative lipophilic colloidal drug carrier prepared with common pharmaceutical excipients such as physiological fatty substance or lipid. Solid lipid nanoparticles combine the advantages of polymeric nanopar

4、ticles, lipid emulsions and liposomes, such as physical stability, protection of incorporated labile drugs from degradation, controlled release, excellent tolerability and so on, while simultaneously avoiding their disadvantages.The research work developed in the area confirms that under optimized c

5、onditions, they can be produced to incorporate hydrophobic or hydrophilic molecules and seem to fulfill the requirements for an optimum particulate carrier system. In this article, the applications of SLN in gene delivery, non-injection system for protein and polypeptide, solubilizaion and targeted

6、drug delivery system will be reviewed. Key words: solid lipid nanoparticles, gene delivery, non-injection system for protein and polypeptide, solubilizaion, targeted drug delivery system固體脂質(zhì)納米粒( solid lipid nanoparticles, SLN) 是新型的亞微粒膠體給藥系統(tǒng)，其研究始于20 世紀(jì)90 年代1。SLN是一種以室溫下為固態(tài)的天然或合成的脂質(zhì)或類脂，如卵磷脂、三酰甘油等為基質(zhì)，將藥

7、物包裹于類脂核中制成粒徑約為50-1000nm的固體脂質(zhì)粒子給藥體系。SLN主要適合于難溶性藥物的包裹，用作靜脈注射或局部給藥，還可以作為靶向定位和控釋作用的載體2。相對于常見的藥物載體，如脂肪乳、脂質(zhì)體、聚合物納微粒等存在的熱力學(xué)不穩(wěn)定、毒副作用大和易被單核吞噬細(xì)胞系統(tǒng)所消除等問題3，SLN作為藥物傳遞系統(tǒng)載體，具有無毒、生物相容性好、可生物降解、載藥能力強(qiáng)、可延緩體內(nèi)成分對藥物的破壞、延長藥物療效、物理化學(xué)存儲(chǔ)穩(wěn)定、對靶器官有特異趨向性、成本低和利于大規(guī)模的生產(chǎn)等多種優(yōu)點(diǎn)。因此，SLN又稱為固體脂質(zhì)體，是微乳、脂質(zhì)體、聚合物納米粒的替代品。近年來，國內(nèi)外越來越多的研究人員對SLN用于藥物載

8、體所產(chǎn)生的良好效果產(chǎn)生了濃厚的興趣，并做了大量的研究工作。本課題組也在SLN方面進(jìn)行了研究，本文將對其在大分子藥物如基因，多肽等以及小分子藥物如抗癌新藥托氟啶和抗風(fēng)濕藥物阿克他利的研究進(jìn)行綜述。1 固體脂質(zhì)納米粒用于基因傳遞作為生物大分子的載體，SLN可以用于口服、注射、肺吸入等多種途徑，適合多肽與蛋白質(zhì)、DNA等各類治療藥物。對于口服或肺吸入途徑而言，改善納米粒的粘膜粘附性質(zhì)有助于改進(jìn)有效性和延長作用時(shí)間4。對于基因治療，納米粒不僅穩(wěn)定地包合基因，防止基因的不穩(wěn)定性，還能夠同時(shí)包合某些導(dǎo)靶片斷及其它輔助成分，可提高靶向性、提高基因細(xì)胞穿透性或者提高細(xì)胞內(nèi)吞作用5等。基因治療中，裸露的外源基因

9、DNA容易被機(jī)體或細(xì)胞降解，難以實(shí)現(xiàn)準(zhǔn)確的表達(dá)，因此就需要基因載體，基因治療的成功很大程度上依賴于開發(fā)出安全高效的基因載體6。研究表明非病毒載體的安全性較優(yōu)于病毒載體，且能夠包裹較大的核酸分子，可大規(guī)模生產(chǎn)和無免疫原性等優(yōu)點(diǎn)，因而研制非病毒基因載體成為重要發(fā)展方向。常用非病毒載體包括脂質(zhì)體和陽離子多聚物。但二者存在的自身毒性和穩(wěn)定性差極大限制了其臨床應(yīng)用。鑒于現(xiàn)有非病毒載體的不足，近年人們逐漸將目光投向了對納米載體系統(tǒng)的研究。在諸多納米基因載體中， SLN憑借其優(yōu)勢成為新一代具有良好發(fā)展前景的新型給藥系統(tǒng)。基因載體的粒徑和帶電性質(zhì)是影響其細(xì)胞毒性和轉(zhuǎn)染效率的重要因素7-8。本課題組分別構(gòu)建了陽

10、離子型和陰離子型SLN作為基因載體，控制載體粒徑以增強(qiáng)細(xì)胞的內(nèi)吞作用，并設(shè)法調(diào)整其帶電性質(zhì)和帶電量以降低其細(xì)胞毒性，提高最終的轉(zhuǎn)染效率。1.1 陽離子型固體脂質(zhì)納米粒陽離子脂質(zhì)體是目前較成熟的非病毒型基因載體，并且已經(jīng)有多種商品化轉(zhuǎn)染試劑上市9。但是陽離子脂質(zhì)體穩(wěn)定性相對較差，與質(zhì)粒DNA的相互作用難以控制，往往導(dǎo)致大量聚集物形成，并且體內(nèi)應(yīng)用時(shí)轉(zhuǎn)染效果還取決于給藥途徑。與陽離子脂質(zhì)體相比較，陽離子SLN具備陽離子脂質(zhì)體的特性，并具有更好的體內(nèi)外穩(wěn)定性，易于工業(yè)化大生產(chǎn)10。與其他陽離子型基因載體類似，陽離子SLN能與帶負(fù)電的DNA通過靜電引力結(jié)合成SLNs-DNA復(fù)合物，增加DNA穩(wěn)定性，易

11、與帶負(fù)電的細(xì)胞膜結(jié)合，促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)吞，最終將DNA導(dǎo)入胞內(nèi)11。本課題組首次利用雜合納米技術(shù)向陽離子SLN體系中引入毒性小，生物相容性好的Ca2+。Ca2+能夠誘導(dǎo)陽離子載-DNA復(fù)合物中部分縮合的DNA分子進(jìn)行再縮合，從而使陽離子CTAB的用量控制在細(xì)胞可耐受范圍內(nèi)，從而解決了陽離子SLN由于自身電正性所引起的細(xì)胞毒性問題12。體外基因轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)表明，陽離子SLN能夠?qū)⒕G色熒光蛋白基因成功遞送到細(xì)胞內(nèi)，雖在24h內(nèi)的表達(dá)效率較lipofectamine低，但隨著時(shí)間延長，到48h時(shí)表達(dá)綠色熒光強(qiáng)度增強(qiáng)，與商品化陽離子脂質(zhì)體24h轉(zhuǎn)染效果相當(dāng)，證明了陽離子SLN用作基因遞送載體的可行性(如圖1所示

12、)。1.2 陰離子型載基因三元復(fù)合納米粒本課題組構(gòu)建的陽離子SLN/ DNA復(fù)合物由于正電性限于肺部等局部給藥方式，不適合靜脈注射給藥，因此我們制備陰離子型SLN，以期克服陽離子載體的上述不足。利用FDA已批準(zhǔn)可供臨床使用的魚精蛋白（protamine）作為聚陽離子對DNA進(jìn)行縮合，不僅能使DNA伸展的長鏈得以壓縮，提高其抵抗劇烈外力的能力13，且魚精蛋白還可作為核定位信號(hào)促進(jìn)內(nèi)吞體逃逸，增強(qiáng)基因的體內(nèi)外轉(zhuǎn)染效率14，然后將該復(fù)合物包裹于SLN，制得載魚精蛋白-DNA復(fù)合物的SLN，包封率高達(dá)86.5±5.28%，其獨(dú)特的“核殼”結(jié)構(gòu)以及魚精蛋白與DNA緊密結(jié)合致使DNA釋放緩慢，具

13、有明顯長效緩釋能力15。在此基礎(chǔ)上，我們以制備陰離子型載基因SLN為目的，設(shè)計(jì)三元復(fù)合荷DNA納米粒16。選用粒徑在150-200nm的魚精蛋白-DNA二元復(fù)合物作為內(nèi)核支撐，20nm小粒徑陰離子型SLN作為可吸附物，分子自組裝制備陰離子型荷基因三元納米復(fù)合物（圖2）。體外轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)結(jié)果（圖3）顯示，48h的轉(zhuǎn)染量接近Lipofectamine組，并明顯高于二元復(fù)合物組。三元復(fù)合納米粒在綜合了包封型SLN優(yōu)點(diǎn)同時(shí)，具有更明顯的穿越生理屏障的功能優(yōu)勢：由于外層SLN和魚精蛋白pDNA二元復(fù)合物內(nèi)核的粒徑能夠被嚴(yán)格控制，因此三元復(fù)合納米粒的粒徑大小更適合于細(xì)胞內(nèi)吞；外層SLN通過靜電作用吸附于內(nèi)核表

14、面，其作用力較弱，在內(nèi)吞體酸性環(huán)境下易于分離，從而順利釋放內(nèi)核；隨著外層吸附物的剝離，內(nèi)核中存在的強(qiáng)陽正電荷促使內(nèi)吞體逃逸，進(jìn)入胞漿；魚精蛋白的核定位能力發(fā)揮作用，促進(jìn)攜帶基因進(jìn)入細(xì)胞核，并表達(dá)目的蛋白。本課題組構(gòu)建的陰離子型載基因三元復(fù)合納米粒是對陰離子型SLN作為基因載體研究的完善和補(bǔ)充，拓展了該類載體在基因轉(zhuǎn)染方面的應(yīng)用，其相關(guān)研究在國內(nèi)外尚未見報(bào)道。圖1不同載體攜帶pEGFP在COS-7細(xì)胞中體外轉(zhuǎn)染結(jié)果Fig1. Gene transfection of pEGFP in COS-7 cells(×400)(A) (B): The transfection results

15、in 24h and 48h of naked DNA; (C) (D): The transfection results in 24h and 48h of Lipofectamine; (E) (F): The transfection results in 24h and 48h of SLNs-pDNA圖2 三元復(fù)合納米粒示意圖Fig2. Scheme of anionic ternary nanoparticles圖3不同基因載體攜帶質(zhì)粒pEGFP基因在A549細(xì)胞中的表達(dá)情況(×200)。基因表達(dá)時(shí)間分別為24h和48h。Fig.3 Fluorescent micros

16、copy of A549 cells transfected by plasmid encoding enhanced green fluorescence protein (EGFP) with different carriers. Gene expression was examined after 24 h and 48 h post transfection, respectively.2 固體脂質(zhì)納米粒用于多肽和蛋白質(zhì)類藥物非注射給藥系統(tǒng)2.1 口服給藥系統(tǒng)開發(fā)多肽和蛋白質(zhì)類藥物的口服給藥系統(tǒng)成為世界各國多領(lǐng)域科學(xué)家積極研究的主要方向之一17-19。研究發(fā)現(xiàn)微粒給藥系統(tǒng)的組成及結(jié)構(gòu)

17、，對于多肽的吸收起著非常重要的作用。SLN用于口服給藥，可以控制藥物在胃腸道內(nèi)的釋放，并可保護(hù)多肽藥物免受降解，增加藥物的生物利用度20-21。胰島素作為型糖尿病的一線降糖藥物，口服易在胃腸道降解，且難以通過生物膜吸收，通常以注射方式給藥22。胰島素的納米?；夹g(shù)給藥，旨在提高藥物的穩(wěn)定性，增加非注射給藥的生物利用度，實(shí)現(xiàn)藥物的體內(nèi)緩釋23、長效24，解決長期連續(xù)注射造成患者順應(yīng)性差的問題。本課題組制備包載胰島素的SLN(Insulin-SLNs)，并利用可特異性識(shí)別細(xì)胞膜糖脂或糖蛋白糖鏈上不同糖基的麥胚凝集素(WGA)作為定位因子，對Insulin-SLNs進(jìn)行修飾，促進(jìn)胰島素的口服吸收。小

18、鼠和大鼠灌胃給予SLNs實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明Insulin-SLNs能夠促進(jìn)胰島素的口服吸收，具有一定的降血糖效果。而WGA 修飾顯著促進(jìn)了胰島素吸收，證實(shí)了凝集素的靶向作用和吸收促進(jìn)作用。但其相對生物利用度仍較低，WGA 修飾SLNs 作為生物大分子藥物口服給藥系統(tǒng)尚需進(jìn)一步研究。2.2 肺吸入給藥系統(tǒng)近年來，藥物通過肺吸入給藥已成為一個(gè)新的研究熱點(diǎn)，尤其是多肽和蛋白質(zhì)類藥物25-27。2006年初，美國FDA首次批準(zhǔn)了Nektar/輝瑞/賽諾菲-安萬特公司聯(lián)合開發(fā)的胰島素粉霧吸入劑ExuberaTM上市，是糖尿病治療史上的里程碑。然而肺吸入給藥還存在著許多嚴(yán)峻的挑戰(zhàn)，如吸入劑的形式及其穩(wěn)定性和控制

19、吸入粒子大小等28-29。SLN憑借其粒徑小，生物相容性好，易于肺深部沉積等優(yōu)勢，成為比其他的藥物載體更適用于肺部的藥物傳遞系統(tǒng)30。本課題組采用噴霧冷凍干燥方法將胰島素SLN（INS-SLN）混懸液制備成肺吸入粉霧劑（圖4）。糖尿病大鼠肺部給藥的藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，肺部給予2IU/kg、8IU/kg INS-SLN后，初始降血糖速度不如對應(yīng)溶液組快，但血糖值回升速度較為平穩(wěn)，作用時(shí)間分別長達(dá)24h和36h，較溶液組顯著延長；而且相對生物利用度分別高達(dá)36.96%、44.40%。SLN包裹胰島素可顯著提高其肺部給藥的生物利用度，可作為藥物載體肺部給藥。 Ins-SLN DPI of Ins-S

20、LN圖4 胰島素SLN的透射電鏡照片和其肺干粉吸入劑的掃描電鏡照片F(xiàn)ig4. Transmission electron photomicrographs of Ins-SLN and SEM photomicrographs of DPI of Ins-SLN3 固體脂質(zhì)納米粒用于難溶性藥物增溶SLN作為一種極有發(fā)展前景的新型給藥系統(tǒng)載體，不僅在大分子藥物如基因，蛋白質(zhì)多肽類藥物的傳遞中發(fā)揮著舉足輕重的作用，在小分子藥物傳遞研究中的地位也不容忽視，并日益受到重視。作為新一代亞微給藥系統(tǒng)，SLN廣泛用于口服片劑、靜脈注射劑、透皮吸收等劑型中，尤其在解決腫瘤多耐藥性的問題中有很大的發(fā)展?jié)摿?1，

21、如用于促進(jìn)藥物溶解、改善吸收、提高靶向性從而提高療效32。難溶性藥物的口服制劑的吸收及其注射劑的制備都是藥劑難題。改善難溶性藥物的口服吸收是納米混懸劑的首選用途33。SLN可用噴霧干燥或冷凍干燥法制成粉末添加到片劑基材中，制備丸劑時(shí)，SLN分散體可作為壓模時(shí)的潤滑劑，也可直接填充于硬膠囊或軟膠囊中34。SLN 的口服劑型包括水性分散體和含SLN 的傳統(tǒng)劑型，如片劑、丸劑、膠囊、軟膠囊和粉劑等35。通過優(yōu)化乳化劑和脂質(zhì)種類和劑量，可得到在胃腸道中穩(wěn)定的SLN。SLN 口服后，利用納米粒的黏附性可增加載藥粒子在藥效部位或藥物吸收部位的停留時(shí)間和接觸面積，提高生物利用度，減少不規(guī)則吸收。本課題組選擇

22、的模型藥物托氟啶（TFu）為正在開發(fā)的新藥，該藥的劑型研究尚未見報(bào)道。動(dòng)物試驗(yàn)結(jié)果顯示有極佳抑瘤作用，但由于其難溶于水而口服生物利用度較差36。個(gè)體間吸收差異大、給藥劑量難以控制，同時(shí)可能增大機(jī)體毒性；而且不適合靜脈注射給藥。通過改進(jìn)劑型來提高TFu的口服生物利用度是本課題的研究宗旨。所制得的TFuSLN可以有效提高藥物的生物利用度，小鼠口服TFu-SLN相對于口服TFu水混懸液的生物利用度為209.2%，為開發(fā)新型的納米給藥系統(tǒng)奠定良好的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)37。細(xì)胞膜外側(cè)荷負(fù)電的蛋白質(zhì)殘基使上皮細(xì)胞表面帶有負(fù)電，陽離子SLN可以與細(xì)胞膜表面的荷負(fù)電物質(zhì)發(fā)生靜電結(jié)合，進(jìn)一步增加吸收，提高藥物的生物利用度

23、38-39。基于以上設(shè)想，本課題組構(gòu)建了托氟啶陽離子SLN體系（TFu-SLNs）。體外生物利用度試驗(yàn)結(jié)果表明，小鼠口服TFu-SLN相對于口服TFu水混懸液的生物利用度為206.7%，此項(xiàng)課題還在進(jìn)一步的研究當(dāng)中。4 固體脂質(zhì)納米粒用于靶向給藥系統(tǒng)鑒于其被動(dòng)靶向特點(diǎn)，SLN制成膠體溶液或凍干粉針后靜注給藥，可延長藥物在靶部位滯留時(shí)間40，如制備靶向于脾臟的SLN將有利于抗炎藥物更好的發(fā)揮療效。阿克他利(Actarit)是一種新型非甾體類免疫調(diào)節(jié)劑，對遲發(fā)型過敏反應(yīng)有抑制作用，可增強(qiáng)白介素2作用，活化患者T淋巴細(xì)胞，主要用于類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的治療，由于水溶性較差，臨床上只有口服制劑。本課題組以生物

24、內(nèi)源性物質(zhì)硬脂酸、卵磷脂作為載體材料，采用乳化蒸發(fā)-低溫固化法制備了Actarit-SLN。與溶液組相比，Actarit-SLN具有顯著的脾靶向性，靶向效率分別由6.31%增加到16.29% (p < 0.01). 組織分布結(jié)果表明，Actarit-SLN可成功靶向于脾和肝等RES器官中，降低在其他器官中的濃度，減小腎毒性，從而降低毒副作用，增強(qiáng)抗風(fēng)濕療效41。5 總結(jié)與展望SLN作為一種極富希望的新型載體系統(tǒng)，目前還處于研究階段，其突出的優(yōu)點(diǎn)是載體材料安全從而克服了聚合物納米粒由于材料緩慢降解而造成蓄積毒性的缺陷；制備過程快速有效；易大批量生產(chǎn)等；同時(shí)在靶向和緩控釋方面顯示出非常大的吸

25、引力。但也存在著載藥量相對較低；多種膠體粒子(如微膠粒、脂質(zhì)體、混合微膠粒、納米藥物結(jié)晶等) 共存；類脂物理狀態(tài)復(fù)雜(如有不同構(gòu)型間的轉(zhuǎn)變、過冷熔化物的現(xiàn)象出現(xiàn)等)；貯藏和給藥過程中的穩(wěn)定性差(如出現(xiàn)SLN 凝膠化、粒徑增大、藥物滲漏等)等缺點(diǎn)，另外，與普通納米粒類似，其在體內(nèi)對單核巨噬細(xì)胞的趨向性使之較多地分布于網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)(RES)，體內(nèi)循環(huán)時(shí)間短，因而其應(yīng)用仍然受到限制。隨著對SLN研究的日益深入，人們試圖通過調(diào)控載體結(jié)構(gòu)來優(yōu)化其綜合性能。隨著對SLN研究的日益深入、全面，SLN將可由實(shí)驗(yàn)室進(jìn)入工業(yè)化大生產(chǎn)，相信它的發(fā)展和完善必將會(huì)使人類傳統(tǒng)用藥發(fā)生一場全新的變革。參考文獻(xiàn)1 WISSI

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