變形鏈球菌表面粘結(jié)素與唾液受體結(jié)合特異性的初步研究

1、    變形鏈球菌表面粘結(jié)素與唾液受體結(jié)合 特異性的初步研究        【摘要】目的研究變形鏈球菌表面粘結(jié)素與唾液受體間的對(duì)應(yīng)結(jié)合關(guān)系。方法采用3H標(biāo)記的變形鏈球菌（簡(jiǎn)稱變鏈）競(jìng)爭(zhēng)性粘附抑制實(shí)驗(yàn)及自行設(shè)計(jì)的間接酶聯(lián)免疫受體結(jié)合實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)純化唾液受體與純化變鏈表面粘結(jié)素間的結(jié)合特異性及其強(qiáng)度。結(jié)果唾液IgA降解片段和相對(duì)分子質(zhì)量為13 000的酸性蛋白僅促進(jìn)變鏈粘附，唾液淀粉酶具有促進(jìn)粘附及抗粘附雙重作用。相對(duì)分子質(zhì)量為127 000的變鏈表面粘結(jié)素及GTF組分分

2、別可競(jìng)爭(zhēng)抑制變鏈對(duì)IgA降解片段及淀粉酶的粘附，蛋白質(zhì)P1和相對(duì)分子質(zhì)量為117 000的粘結(jié)素可同時(shí)競(jìng)爭(zhēng)抑制變鏈對(duì)此二種唾液組分的粘附；間接酶聯(lián)免疫受體結(jié)合實(shí)驗(yàn)表明各變鏈粘結(jié)素不與IgA降解片段有效結(jié)合。結(jié)論變鏈在牙面的粘附是多種粘結(jié)素與唾液受體共同作用的結(jié)果。【關(guān)鍵詞】鏈球菌，變異受體，免疫 A study on the conjugation of Streptococcusmutans adhesins and its salivary receptorsZHAN Ling,LIU Tianjia，F(xiàn)U Mingde, et al.School of Stomatology, West

3、 China University of Medical Sciences, Chengdu 610041【Abstract】ObjectiveTo investigate the conjugation specificity of Streptococcus mutans' adhesins and their salivary receptors. MethodsInclude purified salivary receptor or adhesin competitive bacteria adhesion inhibition test and enzyme linked

4、immuno-receptor assay (ELIRA) on S. mutans WD9463A. ResultsSalivary amylases can both enhance and competitively inhibit the adhesion of the strain to HA, while IgA degraded fragments and MW=13 000 protein only promote its adhesion. P1 and a 117 000 surface protein of WD9463A both inhibit adhesion of

5、 the strain to IgA degraded fragments and salivary amylases. An 127 000 protein of WD9463A and a kind of GTFase inhibit its adhesion to IgA degraded fragments and salivary amylases respectively. No conjugation was found between IgA degraded fragments and the adhesins, while reaction between amylases

6、 and the adhesins had basically accordance with adhesion inhibition test. ConclusionThe adhesion of S. mutans is a result of reaction between multireceptors and multiadhesins.【Key words】Streptococus，mutans Receptors，immunologic變形鏈球菌（血清型C，以下簡(jiǎn)稱變鏈)對(duì)牙面的粘附是其表面粘結(jié)素與牙面唾液獲得性膜(salivary acquried pellicle, SAP)

7、受體的特異性結(jié)合，了解其結(jié)合的特異性，可為特異性地抑制該菌在牙面的粘附、控制菌斑形成及防治齲病的發(fā)生提供理論基礎(chǔ)。目前，對(duì)變鏈牙面粘附機(jī)理的研究已成為國內(nèi)外齲病研究的熱點(diǎn)，但有關(guān)粘附受體配體結(jié)合特異性的研究卻很少1，2。我們通過對(duì)純化變鏈表面粘結(jié)素及其SAP受體對(duì)變鏈粘附的競(jìng)爭(zhēng)抑制實(shí)驗(yàn)和酶聯(lián)免疫受體粘附實(shí)驗(yàn)，探討了變鏈粘附受體配體結(jié)合的特異性，以期深入認(rèn)識(shí)變鏈在牙面粘附初始階段的分子機(jī)理。材料和方法一、變鏈SAP受體、表面粘結(jié)素的來源及鑒定變鏈SAP受體從實(shí)驗(yàn)性SAP中純化，變鏈表面粘結(jié)素從細(xì)菌培養(yǎng)上清中純化，二者分別經(jīng)PAGE、SDS-PAGE、IEP-PAGE確認(rèn)為單一蛋白質(zhì)組分。此外還采

8、用淀粉酶活性測(cè)定、GTF活性測(cè)定、免疫雙擴(kuò)散實(shí)驗(yàn)、氨基酸組分分析以及細(xì)菌粘附或粘附競(jìng)爭(zhēng)抑制實(shí)驗(yàn)鑒定、篩選受體或粘結(jié)素。我們選用了8種變鏈SAP受體和4種變鏈粘結(jié)素成分3進(jìn)行研究，其組分名稱及成分見表1、2。表1游離SAP組分對(duì)細(xì)菌粘附的競(jìng)爭(zhēng)抑制實(shí)驗(yàn)結(jié)果(，cpm)包被成分包被成分組成陰性對(duì)照陽性對(duì)照實(shí)驗(yàn)組抑制率(%)SAG1D1非糖?；矸勖?842 0411 37149SAG2糖?；矸勖?842 1681 07473SAG3糖?；矸勖?842 627637100SBG1D1IgA降解片段5011 2881 08925SBG2D1IgA降解片段5011 4061 3635SBG3D1糖?；?/p>

9、淀粉酶6842 0401 06672SBG4糖?；矸勖?841 264601100*SBG3D2酸性蛋白（13 000）5019339600*注：SAP：唾液獲得性膜；抑制率（%）=1-（實(shí)驗(yàn)組-陰性對(duì)照組）/（陽性對(duì)照組-陰性對(duì)照組）×100%；*當(dāng)實(shí)驗(yàn)組<陰性對(duì)照組時(shí)，抑制率為100%；*當(dāng)實(shí)驗(yàn)組>陽性對(duì)照組時(shí)，抑制率為0 表2變鏈表面粘結(jié)素對(duì)其與SAP受體粘附的競(jìng)爭(zhēng)抑制實(shí)驗(yàn)抑制成分抑制成分組成粘附抑制率（%）SBG1D1SBG2D1SBG3D1SAG1D1SAG3SBG4陽性對(duì)照組人血清白蛋白000000MD3S1127 000糖蛋白73694432435MD3S

10、2P1757791998181MD3S3GTF475994756134MD5S1117 000蛋白875095915370二、細(xì)菌粘附實(shí)驗(yàn) 1. 細(xì)菌的培養(yǎng)及標(biāo)記：將變鏈(C)地方株WD9463A接種于含370 MBq/L3H-胸腺嘧啶核苷的TPY培養(yǎng)基中，微需氧(80%N2、10%CO2、10%H2)37培養(yǎng)18小時(shí)，離心收集菌細(xì)胞，KCl緩沖液洗3次，將菌細(xì)胞懸浮于含5 g/L人血清白蛋白的KCl緩沖液中，550nm調(diào)A=0.62。2 純SAP組分對(duì)細(xì)菌粘附的競(jìng)爭(zhēng)抑制實(shí)驗(yàn)：用純化的SAP組分(0.1 g/L)包被HA，洗3次，加人血清白蛋白封閉，后加入80 l菌懸液和20 l純化SAP組分

11、(0.5 g/L)，陽性對(duì)照組則加入菌液和20 l 人血清白蛋白 (0.5g/L)37旋轉(zhuǎn)1小時(shí)，洗3次后進(jìn)行液閃計(jì)數(shù)，陰性對(duì)照組用KCl緩沖液包被HA，其余步驟同陽性對(duì)照組。實(shí)驗(yàn)均用雙孔法。3 變鏈表面粘結(jié)素對(duì)細(xì)菌粘附的競(jìng)爭(zhēng)抑制實(shí)驗(yàn)：用純化SAP組分包被HA，人血清白蛋白封閉后加入純化變鏈表面粘結(jié)素100 l(0.5 g/L)，37旋轉(zhuǎn)1小時(shí)，對(duì)照組加100 l 人血清白蛋白，洗3次，加菌懸液100 l，處理1小時(shí)，洗滌后進(jìn)行液閃計(jì)數(shù)。陽性對(duì)照及陰性對(duì)照分別用全唾液和KCl緩沖液包被HA。實(shí)驗(yàn)均用雙孔法。三、間接酶聯(lián)免疫受體結(jié)合實(shí)驗(yàn)（ELIRA）此方法根據(jù)ELISA實(shí)驗(yàn)原理建立，用于直接測(cè)定

12、變鏈表面蛋白與唾液受體間的結(jié)合。實(shí)驗(yàn)組、陰性和陽性對(duì)照組分別用100 l 純化SAP組分（2.5 mg/L）、包被緩沖液或純化變鏈表面粘結(jié)素（10 mg/L），4過夜，洗3次，1%牛血清白蛋白37封閉1小時(shí)，洗3次，前兩組加入100 l與陽性對(duì)照組一致的純化變鏈表面粘結(jié)素，陽性對(duì)照組加入洗滌液，37保溫1小時(shí)，洗3次后加入100 l兔抗變鏈表面蛋白粗純品血清（1:200）37保溫2小時(shí)，洗滌, 加入100 l HRP-羊抗兔IgG(1:5 000) 37保溫2小時(shí)，洗5次, 加入底物液反應(yīng)30 min，2 mol/L硫酸終止反應(yīng)，以波長(zhǎng)492 nm進(jìn)行比色。結(jié)果一、純SAP組分對(duì)變鏈粘附的競(jìng)爭(zhēng)

13、抑制實(shí)驗(yàn)結(jié)果由表1可見，游離唾液淀粉酶組分可不同程度抑制變鏈粘附，其中SAG3和SBG4幾乎可完全阻斷變鏈粘附；而IgA降解片段及相對(duì)分子質(zhì)量為13 000的酸性蛋白的作用很弱。二、變鏈表面粘結(jié)素對(duì)變鏈粘附的競(jìng)爭(zhēng)抑制實(shí)驗(yàn)結(jié)果由表2可見，相對(duì)分子質(zhì)量為127 000的表面蛋白可強(qiáng)烈抑制變鏈對(duì)IgA降解片段的粘附；蛋白P1對(duì)細(xì)菌及5種唾液成分的粘附均有較強(qiáng)抑制作用；GTF組分主要競(jìng)爭(zhēng)抑制細(xì)菌與淀粉酶的粘附；相對(duì)分子質(zhì)量為117 000的蛋白可強(qiáng)烈抑制細(xì)菌對(duì)一IgA片段及2種淀粉酶的粘附。三、酶聯(lián)免疫受體粘附實(shí)驗(yàn)結(jié)果由表3可見，4種變鏈粘結(jié)素組份均不與SBG1D1，SBG2D1發(fā)生有效結(jié)合；MD3S

14、2，MD3S3，MD5S1可與4種淀粉酶組份有效結(jié)合。表3粘附相關(guān)蛋白ELIRA測(cè)定結(jié)果包被成分SBG1D1SBG2D1SBG3D1SBG4SAG1D1SAG3MD3S11.20.71.71.41.31.5MD3S22.01.85.44.93.07.2MD3S31.31.04.23.72.24.2MD5S11.81.84.04.33.03.4注：此表中的測(cè)定結(jié)果為陽性對(duì)照組與陰性對(duì)照組的光吸收值之比，當(dāng)比值>2.1時(shí)為陽性 討論一、變鏈粘附隱匿受體的存在及唾液淀粉酶組分在其粘附中的雙重作用本研究發(fā)現(xiàn)，IgA降解片段及相對(duì)分子質(zhì)量為13 000的酸性蛋白在吸附于HA上時(shí)可促進(jìn)變鏈的粘附，但

15、不競(jìng)爭(zhēng)抑制其粘附；在直接測(cè)定變鏈表面蛋白與各種唾液受體間的結(jié)合關(guān)系的ELIRA實(shí)驗(yàn)中，它們也不與任何一種測(cè)試的變鏈表面粘結(jié)素成分有效結(jié)合，提示它們?yōu)樽冩溤谘烂娴碾[匿受體，IgA片段的促粘附作用也許不是通過抗原抗體反應(yīng)進(jìn)行的，它具有高度的特異性。作者在過去的研究中還發(fā)現(xiàn)唾液中的IgA成分呈現(xiàn)出多型性，而不同表型的IgA在變鏈粘附中的作用亦不同，IgA降解片段SBG1D1及SBG2D1可促進(jìn)變鏈粘附，而其它IgA組分則作用很弱3，提示口腔內(nèi)細(xì)菌產(chǎn)生的IgA酶的降解作用可減少SIgA的抗粘附作用，并增強(qiáng)它對(duì)粘附的促進(jìn)作用。由于這類受體不誘導(dǎo)細(xì)菌凝集，故不利于細(xì)菌的清除，因此在細(xì)菌對(duì)牙面的粘附中有十分

16、重要的作用。本實(shí)驗(yàn)中還發(fā)現(xiàn)幾種唾液淀粉酶組分既能明顯促進(jìn)變鏈對(duì)HA的粘附，又可有效地競(jìng)爭(zhēng)抑制其粘附，說明它們?cè)谧冩溦掣街芯哂须p重作用。其中兩種酶組分在低濃度時(shí)即可完全阻斷細(xì)菌粘附，提示其抗粘附作用更為重要。二、變鏈表面粘結(jié)素與其唾液受體結(jié)合特異性的初步研究我們通過純化變鏈表面粘結(jié)素對(duì)該菌與純化SAP組分包被HA粘附的競(jìng)爭(zhēng)抑制實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)：變鏈表面相對(duì)分子質(zhì)量為127 000粘結(jié)素可有效抑制該菌對(duì)唾液IgA降解片段的粘附，提示其以IgA降解片段為受體；P1和相對(duì)分子質(zhì)量為117 000的表面蛋白則可同時(shí)有效抑制細(xì)菌對(duì)IgA降解片段和唾液淀粉酶組分的粘附，提示它們可能有兩類受體；而GTF酶組分MD353主要抑制細(xì)菌與淀粉酶的粘附，故主要以淀粉酶為受體。這一結(jié)果提示變鏈在牙面的粘附是多種粘結(jié)素與多種受體共同作用的結(jié)果。作者單位：詹玲劉天佳岳松齡周學(xué)東（610041 成都，華西醫(yī)科大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院），傅明德（基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)生化教研室）參考文獻(xiàn)1Russell MW, Mansso-Rahemtulla B. Interaction between surface protein antigens of Str