畢業(yè)論文實驗報告

1、畢業(yè)論文實驗報告學生姓名： 石書鵬 學 號： 20080357 學院： 生命科學與技術(shù)學院 專 業(yè)： 08生物工程2班 論文題目： 木瓜多糖的提取工藝研究 指導教師： 吳耀輝 副教授 評閱教師： 王 衛(wèi) 講師 2012年4 月20日本課題要研究或解決的問題和擬采用的研究手段（途徑）：本實驗對木瓜中水溶性多糖的提取工藝進行了研究，多糖類化合物具有強親水性，極易溶于水，和在親水性比較強的乙醇中也難于溶解的性質(zhì)，確定采用水提醇沉（水作為溶劑，乙醇來沉淀多糖）的方法提取多糖。分析提取時間、提取溫度、固液比、提取次數(shù)對多糖提取率的影響，確定其最佳工藝條件。并且對多糖的抗氧活性進行探討，為木瓜的綜合利用提

2、供依據(jù)。1 材料與儀器1.1 原料 新鮮木瓜1.2 試劑 95 %乙醇，無水乙醇（分析純），苯酚（分析純），濃硫酸（分析純），蒸餾水，葡萄糖（分析純）等1.3 儀器 電子天平，粉碎機，鼓風干燥機，布氏漏斗，高速離心機，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，恒溫水浴鍋，752C紫外分光光度計，滴管，移液管，漏斗，燒杯，滴定管，錐形瓶等。2 實驗方法2.1 粗多糖提取及純化步驟2.1.1 木瓜處理 新鮮木瓜，洗凈后，在溫度50 下烘干，經(jīng)粉碎機粉碎后過60 目篩，收集粉末。2.1.2 浸提稱取一定量的木瓜粉加入適量蒸餾水，在設(shè)定條件下恒溫浸提，并不斷攪拌。2.1.3 過濾離心將提取液用濾紙進行抽濾，棄掉濾渣,得澄清浸提液。

3、浸提液用臺式高速離心機進行離心5 min，轉(zhuǎn)速3500 r/min。2.1.4 濃縮將離心后的浸提液放入旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中濃縮到原體積的1/5。2.1.5 醇沉將濃縮后的提取液加入4 倍體積的 95 % 的乙醇溶液中，靜置24 h以上。2.1.6 離心將用醇沉淀的多糖液離心，并用無水乙醇洗滌2 次3 次，再次離心（轉(zhuǎn)速3500 r/min，時間5 min），收集沉淀物。2.2 粗多糖的含量測定方法葡萄糖標準曲線的繪制精確取稱110 干燥至恒重的無水葡萄糖標準品25 mg，置于250 ml容量瓶中，制得濃度為0.10 mg/ml的葡萄糖標準溶液，準確移取標準溶液0.00 ml、0.20 ml、0.40

4、 ml、0.60 ml、0.80 ml、1.00 ml、1.20 ml、1.40 ml、1.60 ml、1.80 ml、2.00 ml濃度為0.10 mg/ml的葡萄糖溶液，分置于試管中，各加蒸餾水補足至每管2.00 ml。在各管中加入5.00ml顯色液，然后振蕩混勻，置于沸水浴中加熱30 -35min，流水冷卻，于波長490 nm處測定吸光度值。以吸光值A(chǔ)為縱坐標 溶液濃度 (mg/ml)為橫坐標繪制標準曲線。粗多糖含量的測定將純化后的木瓜多糖粗品溶解，定容到100 ml。用移液管移取1.00 ml樣液置于試管中，再用移液管加入顯色液5ml，于沸水浴中加熱30-35 min 后于波長為490

5、 nm的分光光度計中測量吸光度。根據(jù)標準曲線、回歸方程計算粗多糖含量，再由含量求出木瓜竹葉中多糖的含量。計算公式為： CVn木瓜多糖提取率= 100% （1） m式中： C 提取液中木瓜多糖的濃度（g/ml） m 稱取的木瓜質(zhì)量（g） n 稀釋倍數(shù) V 粗多糖（m1）3實驗結(jié)果3.1葡萄糖標準曲線的繪制表1 葡萄糖濃度與吸光度的關(guān)系葡萄糖濃度mg/ml0.00.010.020.030.040.050.060.070.08吸光度/A0.0000.1020.2590.3490.3870.5230.6570.7850.921根據(jù)表1的數(shù)據(jù)，以葡萄糖濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標，繪制葡萄糖標準曲線，如

6、圖1。圖1 葡萄糖標準曲線由圖1可知，葡萄糖與吸光度呈良好的線性關(guān)系，其回歸方程：y=11.172x-0.0043 式（3）相關(guān)系數(shù):R2=0.9905 式中x為葡萄糖濃度，y為吸光度。3.2不同單因素條件對木瓜多糖得率影響的研究本試驗首先主要考察幾種對水浸提法提取木瓜多糖得率影響比較大的因素44，包括浸提溫度、浸提時間、浸提時的液固比。從而找出這些因素影響木瓜多糖得率的大小和作用范圍，為響應面實驗的設(shè)計提供依據(jù)。浸提時間對多糖提取率的影響以 1 g 木瓜粉末為基準，各加入50ml蒸餾水，在80。C下提取，分別考察提取時間 1.0 h，2.0 h，3.0 h，4.0 h，4.5h，5.5h對多

7、糖提取率的影響，再用苯酚-硫酸法測定其多糖的含量，最后分析結(jié)果。見表2與圖2：表2浸提時間與多糖吸光度提取率的關(guān)系浸提時間 /h1.02.0 3.0 4.0 4.5 5.5提取率 %7.408.007.208.109.609.30圖2不同浸提時間對多糖提取率的影響 由表2和圖2可知：隨著浸提時間的增加，多糖得率也增加，但當浸提時間達到4.5以后，多糖得率反而下降，故再增加提取時間對多糖得率增加不明顯，說明多糖已經(jīng)基本析出。溫度對多糖提取率的影響準確稱取5份木瓜粉,每份 1 g，各加入50 ml蒸餾水，分別在溫度50。C、60。C、70。C 、80。C 、90。C、95。C下提取4.5h，再用苯

8、酚-硫酸法測定其多糖的含量，分析不同溫度對多糖提取率的影響，結(jié)果見表3與圖3:表3 浸提溫度與多糖提取率的關(guān)系浸提溫度 506070809095提取率 %4.305.706.206.306.005.80圖3 不同浸提溫度對多糖提取率的影響由表3和圖3可知：隨著浸提溫度的增加，多糖得率也增加，但當溫度達到80以后，多糖被破壞，得率反而下降，故再增加浸提溫度對多糖得率增加不明顯，說明多糖已經(jīng)基本析出.3.2.3 浸提比對多糖提取率的影響在溫度為80 ，提取時間為4.5h條件下 ，考察了浸提比20：1，30:1，40:1，50：1 ，60：1 ml/mg情況下多糖的得率，浸提比對多糖提取率的影響結(jié)果

9、見表4與圖4。 表4 浸提比與多糖提取率及吸光度的關(guān)系浸提比 ml/mg 20：1 30:1 40:1 50:1 60:1提取率 5.266.416.586.446.08圖4 不同浸提比對多糖得率的影響由表4和圖4可知：隨著浸提比的增加，多糖得率也增加，但當浸提比達到40:1以后，多糖被破壞，得率反而下降，故再增加浸提比對多糖得率增加不明顯，說明多糖已經(jīng)基本析出。3.3響應面試驗3.3.1 響應面設(shè)計 為了找到各個因素之間的相互影響, 我們在單因子試驗的基礎(chǔ)上進行響應面試驗, 優(yōu)化提取工藝。選擇浸提時間，浸提溫度，浸提比3個對多糖提取影響較大的因素 ,按表6設(shè)計三因素,三水平實驗，結(jié)果見表7。

10、 表6 響應面分析因素與水平因素 水平-1 01浸提時間 /h4.04.55.0浸提溫度 /708090浸提比 / ml/mg30：140:150:1 利用Design Expert軟件進行多元回歸擬合分析，得出多糖得率與浸提處理各因素變量的二次方程模型為： 多糖得率2-3.34B2-4.47C2 式中：A-為浸提時間 h ； B-為浸提溫度 ； C-為浸提比 ml/mg 對表7數(shù)據(jù)進行方差分析。 方差分析及顯著性見表8.表7響應面分析方案及試驗結(jié)果StdRun Factor 1 A:浸提時間 h Factor 2B:浸提溫度 Factor 3C：浸提比 ml/mgResponse 1多糖得率

11、 %114.070.0040.0021.8924.570.0030.0018.381734.080.0050.0023.471344.080.0040.0024.2354.090.0040.0021.51764.580.0040.0027.811074.590.0030.0018.2811684.580.0040.0027.8495.090.0040.0021.86105.080.0030.0020.314114.580.0040.0028.85124.080.0030.0017.48135.080.0050.0022.5512144.590.0050.0022.20992155.070.00

12、40.0021.415164.580.0030.0019.411174.570.0030.0021.4099表8 方差分析及其顯著性檢驗方差來源平方和自由度均方F值p值顯著性模型172.29919.1421.370.0003significantA0.8510.850.940.3637B0.08010.0800.0860.7737C39.78139.7844.410.0003AB0.1210.120.140.7225AC3.6513.654.070.0834BC0.2010.200.230.6489A228.04128.0431.310.0008B246.43146.4351.830.0002

13、C280.90180.9090.32 0.0001殘差6.2770.90失擬差5.6151.123.400.2428Not significant純誤差0.6620.33總和178.5616 從表8中可以看出，本實驗的模型極顯著（p0.01),失擬相不顯著，（p=0.2428)，因而該模型擬合程度比較好，實驗誤差小，可以用此模型對提取木瓜多糖得率進行分析和預測。3.3.2響應面分析三個因素的相互作用圖5 浸提時間與浸提溫度交互作用對多糖得率影響的響應面立體分析圖和相應等高線圖圖6 浸提比與浸提溫度交互作用對多糖得率影響的響應面立體分析圖和相應等高線圖圖7 浸提比與浸提時間交互作用對多糖得率影響

14、的響應面立體分析圖和相應等高線圖 圖5-圖7是利用響應面工具Design Expert (version 8.0.6)得到的多元回歸方程繪制的應面立體分析圖和相應等高線圖，所擬合的響應曲面和等高線圖能夠比較直觀地反應各因素和各因素間的交互作用和因素與響應值(木瓜多糖得率)之間的作用，圖5-圖7表明，三個響應曲面均為開口向下的凸形曲面，同時等高線最小橢圓的中心在所選的-11范圍內(nèi)，說明響應值（木瓜多糖得率）在所選擇的三個因子設(shè)計的范圍內(nèi)存在極大值。三個圖中的圖7的等高線成橢圓形狀，同時低編碼值的A和高編碼值的A時，響應值隨著B的變化，變化趨勢不同。說明A（浸提時間）和C（浸提比）有一定的交互作用

15、，這與方差分析的結(jié)果相吻合。分析圖5和圖6，這種交互的關(guān)系不明顯，說明A和B，B和C間交互效應不顯著，比較幾個圖可以看出C（浸提比）對響應值木瓜多糖得率的影響比較大，響應值的變化也比較大。4驗證實驗 采用熱水浸提法提取木瓜多糖的工藝，單因素實驗表明，隨浸提時間、浸提溫度、浸提比的不同，多糖得率有著較大的差別，根據(jù)單因素實驗確定的條件范圍，采用Design Expert軟件對所得的回歸擬合方程進行優(yōu)化，得到的模型推算的最佳提取條件為浸提時間4.00h、浸提溫度70.00、浸提比40:1，此時多糖得率最大為28.1335%。 根據(jù)以上推算的最佳條件對木瓜多糖進行了三次提取實驗，得到木瓜多糖的得率為

16、28.0251%，與理論值相對誤差為3.08%，驗證值與回歸方程所預測值相吻合得很好，驗證了此響應面分析方法的可行性。參考文獻1中國科學院. 中國植物志. 第九卷,第一分冊. 科學出版社,1996.2張毅 王少敏.木瓜高效栽培與利用M.北京：中國農(nóng)業(yè)出版社,2003.3何銀生,廖朝林,郭漢玖等.皺皮木瓜美好前景J.中國現(xiàn)代中 藥,2008,10(9):46-47.4張冬松,高慧媛,吳立軍.光皮木瓜的化學成分藥理活性及臨床研究進展J. 沈陽藥科大學學報,2007,24(11):721-725.5方煥;生吉萍;吳顯榮 工業(yè)生產(chǎn)中木瓜蛋白酶的活性檢測方法比較2000(06) 6木瓜蛋白酶的開發(fā)與應用

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