RNA的變電泳原理

1、RNA的瓊脂糖凝膠電泳實(shí)驗(yàn)原理RNA電泳可以在變性及非變性兩種條件下進(jìn)行。非變性電泳使用1.0%-1.4%的凝膠，不同的RNA條帶也能分開，但無法判斷其分子量。只有在完全變性的條件下，RNA的泳動率才與分子量的對數(shù)呈線性關(guān)系。因此要測定RNA分子量時，一定要用變性凝膠。在需快速檢測所提總RNA樣品完整性時，配制普通的1%瓊脂糖凝膠即可?；具^程同DNA電泳一樣，但應(yīng)明確一點(diǎn)的是，因?yàn)镽NA分子對RNA酶的作用非常敏 感，因此必須用對 RNA酶有抑制作用 DEPC水來配置所有溶液，所有與RNA接觸的儀器和 裝置都要嚴(yán)格處理以盡量減少RNA酶對樣品的降解；另外，因?yàn)镽NA分子有二、三級結(jié)構(gòu)可以影響

2、其電泳結(jié)果，因此電泳時應(yīng)在變性劑存在下進(jìn)行，常用的變性劑為甲醛和戊二醛。25Sf rRNA （占8085%） J i8s5s植物RNA tRNA及小分子RNA （占1口15%）、inRNA （占17%）“W3上bioQ.an）寡聚脫氧胸背Oli的dT層析柱RNA非變性瓊脂糖凝膠檢測實(shí)驗(yàn)材料、器具及藥品蘑菇的總RNA溶液。 電泳儀，電泳槽，電子天平，移液器，槍頭，微波爐，紫外透射檢測 儀等。瓊脂糖，1XTAE電泳緩沖液，0.5科g/ml澳化乙錠(EB) 10X載樣緩沖液。實(shí)驗(yàn)步驟(1)用1XTAE電泳緩沖液制作瓊脂糖凝膠，力口 1XTAE電泳緩沖液至液面覆蓋凝膠。(2)在超凈工作臺上，用移液器吸

3、取總RNA樣品4 ul于封口膜上。在實(shí)驗(yàn)臺上再加入 5 ul 1X TAE電泳緩沖液及1 ul的10X載樣緩沖液，混勻后，小心加入點(diǎn)樣孔。(3)打開電源開關(guān)，調(diào)節(jié)電壓至100V,使RNA由負(fù)極向正極電泳，約 30min后將凝膠放入EB染液中染色 5min,用清水稍微漂洗。在紫外透射檢測儀上觀察RNA電泳結(jié)果。非變性電泳：上樣量超過 3ug,電壓超過6V/cm ,電泳緩沖液時間太長， 均可能導(dǎo)致 28S和 18S條帶分不開。使用2ug上樣量，電壓小于 6V/cm,使用新鮮的電泳緩沖液并且頻繁混 勻兩極的緩沖液，是獲得好的電泳結(jié)果的前提。(以DNA標(biāo)準(zhǔn)為參照，28S和18S分別位于2.0kb和0.

4、9kb左右。)變性電泳條帶變淡：EB與單鏈的結(jié)合能力要差一些，故同樣的上樣量，變性電泳比非變性 電泳要淡一些。另外的可能是甲醛的質(zhì)量不高。RNA的變性瓊脂糖凝膠檢測試齊：(1) MOPS緩沖液(10*) :0.4mol/L 嗎咻代丙烷磺酸 (MOPS) (PH7.0), 0.1mol/L NaAc, 10mol/L EDTA(2)上樣染料：50%甘油，1mmol/L EDTA ,0.4%澳酚藍(lán)，0.4%二甲苯藍(lán)。(3)甲醛。(4)去離子甲酰胺。電泳槽清洗：去污劑洗干凈(一般浸泡過夜)一一水沖洗一一乙醇干燥一一3%H2O2灌滿一一室溫放置 10分鐘一一0.1%DEPC7R沖洗。操作：(1) 將制

5、膠用具用70%乙醇沖冼一遍，晾干備用。(2)配制瓊脂糖凝膠。稱取0.5g瓊脂糖，置干凈的100ml錐形瓶中，加入40ml蒸儲水，微波爐內(nèi)加熱使 瓊脂糖徹底溶化均勻。待膠涼至60-70 C,依次向其中加入 9ml甲醛、5ml 10X MOPS緩沖?和0.5 ul澳 化乙錠，混合均勻。灌制瓊脂糖凝膠。(3)樣品準(zhǔn)備： 取DEPC處理過的500 ul小離心管，依次加入如下試劑：10x MOPS緩沖液2ul,甲醛3.5 ul,甲酰胺(去離子)10 ul, RNA樣品4.5 ul,混勻。 將離心管置于60c水浴中保10分鐘，再置冰上2分鐘。向管中加入3 ul上樣染料，混勻。(4)上樣。(5)電泳：電泳槽

6、內(nèi)加入 1XMOPS緩沖液，于7.5V/ml的電壓下電泳。(6)電泳結(jié)束后，在紫外燈下檢查結(jié)果。實(shí)驗(yàn)19總RNA的變性瓊脂糖凝膠檢測【實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹空莆湛俁W A變性核電瓶的原理科方法=【實(shí)驗(yàn)原理】RNA電泳可以在變性及非變性兩種條件下進(jìn)行.非變性電泳使用的凝膠不同的RNA條帶也能分開h但無法判斷其分子量.只有在完全變性的 條件下，RMA的泳動率才與分于量的對敝呈性關(guān)系,因此要測定RNA分子量 時，一定要用變性凝技,卻需快速檢惻提取息RNA的鼠理：,可用普通的與 瓊脂糖凝膠監(jiān)察.判斷RNA提取物的完整性是進(jìn)行電泳圉主要II的之一,完整的未降解的RNA制品的電冰圖譜應(yīng)可清晰看到28rRNA、IHxr

7、RNA1 5仃QJA的一二條且2覦dtNA的哀度此為I柒昧恒人的四恪n【器材與材料】1 .器材水平式瓊脂糖凝門fc泳系統(tǒng)、電子天平、移液器、Tip頭、電爐、紫外透射檢測 儀2 .試劑(1) 01%(J7F)DEPC 水200ml雙哀去離子水加0.2mlDEPC (焦炭酸二乙函充分?jǐn)嚢杌靹?，室溫放置過夜，用冰滅菌。(2) 10 乂電泳緩沖液嗎味代內(nèi)烷磺酸(MOPS) 0.4mol/L (pH 7.0)NaAcO.lmol/L乙二股四乙酸(EDTA)lOnnno 1/L(3) 501nL變性瓊脂糖凝膠I % (m/丹】0X電泳輟沖液5 ml瓊脂苑0.5g0.1% (0 DEPC 水36.5 ml加

8、熱溶解，稍冷卻，加入8.5ml37%(0r)Ti5c(4)上桿線沖液：50% (F/r)甘油，ImmoVLEDTA, 0.4%(nk)浪酚藍(lán)，0.4% (m/4二甲芥藍(lán)e(5)甲% (去離子)。3.材料植物或動物的總RNA溶液.【操作步驟】1 .電泳植，制酸用具的清洗：去污劑洗干凈(一般浸泡過夜)，水沖洗后用，3% HQ2灌滿電泳槽，空溫放置10mm,用0.1% (勿處DEPC水沖洗，喙干備用,2 .刷蛇稱取0.5g球腑糖粉末，加入放有36.5ml的DEPC水的錐形瓶中，加 熱使瓊脂糖完仝溶解。稍冷卻后加入5向的10x電泳輟沖液、8.5ml的甲也 然 后在膠槽中灌制凝膠，插好梳子，水平放置待凝

9、同后使用。3 .加桿：在一個消亦的小惠心管中混合以下試劑：2囚10義電泳級沖液、3.5ml 甲姓、10ml甲酰眩、3.5MRNA樣品e混勻，置60匕保溫lOmin,冰上速冷.加 入3川的上樣緩沖液混勻，取適量加樣于凝膠點(diǎn)樣孔內(nèi). H時代RNA標(biāo)準(zhǔn)樣品.4 .電泳：打開電泳儀，穩(wěn)壓7.5V/cm電泳s5 .電泳結(jié)束后通過紫外透視儀觀察.【要點(diǎn)提示】1 .本實(shí)驗(yàn)中必須防止RNase溝染，以免R.NA降解。所有試劑需用DEPC水配制, 用具也用DEPC水沖洗，并滅菌.2 . RNA的非變性瓊脂糖凝膠電泳與DNA的操作相同.【思考題】如何判斷RN A提取物的質(zhì)量？方案6 按大小分隰RNA：在含有甲醛的

10、瓊脂糖凝膠上進(jìn)行的 RNA的電泳RNA樣品經(jīng)甲酰妝處理以及經(jīng)合有甲醛的凝膠電泳分離可能會發(fā)生變性，這一方法是從 Lehmcheral. (1977), Goldberg (1980), Seed (1982a)和 Rosen er al (1990)修改而來。RNA在含有2.2 mol/L甲醛的旋數(shù)上電泳分鬻出袱U答國網(wǎng)覆用的的況將基團(tuán)形成不9定第SchJfX基對，這些E分初通過阻止?jié)鷥?nèi)WagsCrLk破 基配使RNA維持在立叫狀態(tài).因,笈對不雄定南且客幼被舞徉除去,因此只有二甲號存在F級沖 液或黑長葉.RNA才氣推特在變性狀怎“甲酸逋過不啜或與皮膚接觸具許根高的本性.是一種致畸因戶, 2經(jīng)核

11、，4安全qg展出臺SHA)認(rèn)定為”案INF.含有甲解的溶諫為流在化學(xué)遑色像慎處理，含有甲酣的瓊脂彼凝膠比非變性的瓊淚糖麻放更易褥，更抉乏律性，將其從一個容 器轉(zhuǎn)到另一個容器時要格外小心,盡管如此，因?yàn)樽冃訰NA比乙二醛電泳后的RNA 在Norihern分析過程中更易從凝膠上分離，因此，甲座凝膠電泳仍然是分離RNA的一 個普遍采用的方法。然而，在甲詼族膠上的RNA條帶總是橫糊不清的，而且不能與乙 二薜瓊脂糖裔股電泳的清晰條帶相悔美。原有的Norrhem分析方案所用的甲醛為6%或2.2 mol/L (Bocdtkcr 19711 Ix:hrach ei al. 1977; Raveet al. 1

12、979),這變性物質(zhì)的高濃度彌補(bǔ)了電泳過程中甲醛通過凝膠 擴(kuò)散進(jìn)入援沖液中所形成的甲薜損失。然而，這一問髭可以通過以高電樂(7-10 V/cm,代替常用的2-3V/cm)電冰較短的時向來避免，這樣就可以允許兼膠中甲醛的 濃度減少到 1.1% 或 0.66 mo!/L (Da5 8 d. 1986)。溟化乙詫的存在曾經(jīng)被認(rèn)為是影晌了 RNA從甲醛凝膠到膜的轉(zhuǎn)移并/或播制了后 續(xù)的雜交(Thoa 1980)?，F(xiàn)在，如果這種效應(yīng)存在的話，量也被認(rèn)為是很小的 (Kroczek and Siebert 1990),許多研究人員刁慣在0.66 md/L甲醛的凝膠中加入澳化乙 錠.這樣可以免去電泳結(jié)束與的R

13、NA染色過程.當(dāng)用紫外線照射酎，它但發(fā)射一種沖 秘的吩紫色的光芒，在凝校電泳之前淹沒了少量RNA的信號，加熱低濃度澳化乙錠的 RNA樣品，井且在沒有背景熒光的情況下；可以扶得更好的著色(Fourney el al. 1988; Rosen and Villa-Komaroff 1990)0只要樣曲中溟化乙艇的濃世不超過50Rg/ml, RNA傳移和雜交的效率不會受到顯著的影響(Kroczek 1989; Kroczek and Siebert 1990; Ogretmen ei al. 1993)o材料9：在這方家中.對OEFC婦丹的水制備阱有的洛拘(清參陰信息也關(guān)如何去除RNAtW) 住蜜，

14、浦參閱附錄12美尸標(biāo)以(!)的每芯法當(dāng)處庫緩沖液與溶液璃套網(wǎng)附戊1關(guān)于原收.緩沖液和氐克的成分.并幡停原放典合命的儂度。澳化乙錠(200隅/ml) 用DPC處理的水配制!)甲醛便用的中能力37%約m/V (12.3 mri/L)的甲城厝旅.衣中可靛包含象甲酹(IQ%IS，)這 碎的毯定樹.當(dāng)甲群累爆f空，中時物易氯化度甲酸. 4昊甲醛汽修的pH值是酸性的(PM4.0)或 科如果液作交It用癰便椅原枚fllWRadAOSQW或DowexXG8這樣的混合肆樹旃處理.以去除需 子。甲酰放方實(shí)這件試對的事網(wǎng)去離子制劑分成小價在20匕克K條件下亡幫.另一方法是,成制烯的甲或胺引 如月附錄I所述去離子C1

15、0x手酷凝膠電泳加蚌援M液。5QK甘沌(*再于DEPC處通過的水中10 mmol/L EDTA (pH8.0)0石 (m/V)滇黔詆52S% (附/V)二甲不裨a乙目10x MOPS電冰緩沖液(L2 3LMOHS (pH7.0) (!)20 rmnnl/L乙電忸10 nunol/L EOTA (pHB.O)料41.8 R的MOTS嬉II于700 ml滅薄的DEPC處厚的水中.用2 mI/L的NRH利整出值到7.0.加 20 mlDEPC 處理的 1 nu:/L 的乙竣幀加 20 ml DEPC 6fl的 0.5 mol/LEDTA (pHS.O).用 DRPC處理 的水材冷液的體現(xiàn)調(diào)整到1 L

16、.通過一個。.4Swn的內(nèi)孔次斌過GJ火窗落發(fā).同時,相具住室114遍尤 貯存。如累累儒于光線中域高壓天蒿.鄧幺媛版會隱告忙存時間出變就.享暮色的H中液不彩晌愧 用效果，但是更深晚色的堤沖楸就不能使用。凝膠含點(diǎn)2.2 mol/L甲盛的球器糖或椒制卦100而含有2.2 011/1.甲應(yīng)的1 S的球附慚UH,加1.Sg球戚加到72 mJ滅崔水中，用餐諛爐 有濡法伸S隙由糖.珞停播冷江煲55c同附30入W ml I0X MOPS電泳量沖液和18 ml去育子甲H疙化 手舉風(fēng)冊內(nèi)H制就校,用一個3m的簫子做它一個箜少比槍HRNAe51#4個孔的愛咬，這些彳余 的林道用作大小巳攵的K、A作為程W分子啦量標(biāo)

17、準(zhǔn)簪盛旅適和染料的電建（埼參工第4歲），可叨允 許興茂在文湛下放出1瓊麗傳要盡快配制.用，rn餐90也官莫可以ini*.1.5%衲第福傳凝膠用來分離Q,58 kb太小的RNA,更大的RNA立饃用1.0%或1.2%的球絡(luò)發(fā)廉教 分離（Uhrachct L 1977| MBcr 1967）核酸和衽核甘酸RNA神品急RNA或pd/ （A）* RNA祥晶應(yīng)該是在】2 /體根中含有20 RNA,從忙春桂岳中欣等“ RNA分 析（清專電方案】.RNA的七俘八將RNA與乙裔共沉員L井帶其答X于幻天的的DEPC處理IS的金 宜體稅的水中.佯品中有就或SD6存在的情81下.或力是每個泳道RNA的上修量20座時.

18、在電*：會引肥HNA的 美常不清崎，RNA大小參奧物DNA和RNA以不同的通車M也含有甲姓的班祈密凝膠,RNA的迂移速率與網(wǎng)號大小的DNA不同 卬火”|蝕9,因?yàn)?1人物照帳泳動出清喊的條韋玨較好的.但它曾不能的魚法用來/V東招RNA的 倫財大小.因此.我郡使用RNA除記（例幼來自Life技術(shù)公司）.長度為9.4/7.46, 4.40. 2.37. 1.3SHIQ.24M,這就允許RNA標(biāo)記成為RNA鼻染或電誄中解脂段現(xiàn)的其他向儂檢員等，境參 閱力* 5的unhern雜殳苴里的介紹r專用設(shè)備水平電冰儀一個特定的電泳僅應(yīng)設(shè)被保存用來出RNA分析快用，盾清電外槽卻K子以備卬做K、A電燈,再用水 沖

19、洗,用乙怦，干.然后用3%的H?怯溶廉*年.在室&FJtt2MQmm,用。JDEPC處反過的水帶 底沖汰電泳槽和彼干.因?yàn)閍電教過再中電施韁沖液的ph值隋r發(fā)生變化.裝好電/指后使電泳.沖渣通過蝴4案從一個小 空到另一個小31不即地砧環(huán)，另一神做金*.號小環(huán)人工變0即雙，透明直尺55P水浴方法1 .在一滅菌的融城離心管建立變生反應(yīng)RNA多姑叫，。讓JflX MUFS耳域里南痕?. Ufil甲廢，口同甲睨胺*口團(tuán)瘦化乙靛(Z00fj/n：)l.ihil.誓一旅遭至步可分析20圈KM離，遣常用他牌幅物總NNH姓行NwtX情型交,可以幡涸高豐度mRNA t占 rnRNA忘量的DJ%以上,拼得刪RNA

20、包培鞋薇每個冰通里少過加14鵬產(chǎn)(ArNALRNA t-Jx 胡的林林奇試用特測RNA樣品的同坪方法來制梟，2 .蓋微量國心管的或子，于55c阻育RNA液體60皿也 在冰水中冷卻肆品10 min, 然后離心5s并將所有的履悴在微虻離心管的底部悅淀.有些的與人最思意在85七下事育RNA海儒I。曲13 .加21 10 X甲醛凝膠加伴緩沖液并將試管重新置于冰上。4-特瓊指糖/用酸凝膠裝入水平電泳槽中.加入足鐳t x MOPS電泳緩沖液覆蓋凝膠約 1mm。電泳5min (5 V/tmo加RNA群品到凝膠加樣孔中，將空皎兩便的兩條最 外例的泳道留下，加樣RNA標(biāo)準(zhǔn)大小匿照物.5,驟膠深入1XMOPS電泳

21、援神液中，4-5 V/tm電壓下進(jìn)疔電泳，直到浸酚藍(lán)移出的 8加(4-5成.池泳時用較高電壓會導(dǎo)致條帶圖糊不清“因?yàn)殡娪揪彌_誨的pH值 在電泳過程中會發(fā)生變化，裝好電泳槽，踱沖液通過修動泵不斷從一個室到另一個 室.每隔一個小時更換一次韁沖液n6 .哥凝段效臀于一片Sd“n膜上在紫外線透射儀上觀察RNA將染色凝膠和紫外戰(zhàn)透射 的雕片用透明用直尺對17k 請叁方案5美于RNA制劑的咸誠的檢杳c7 .照像并測量照片上每個RNA條帶至加憚孔的蛇離.以RNA片段大小的對數(shù)值相RNA條帚的適修距離作圖.用筋礙曲線計笄從觸膠轉(zhuǎn)移到面相支持體后通過雜交計 算出RNA分子的大小.8 .通過上或下毛細(xì)管轉(zhuǎn)移固相化

22、的RNA到固相支持物上(請參見方案7.毛細(xì)管轉(zhuǎn) 移兀RNA提取、電泳注意事項(xiàng)，有幾點(diǎn)說得很好啊快速的操作，低溫環(huán)境，少量取上清主要是抽提之后吸取上清時要特別小心，只要不把蛋白層吸出來就不會有RNase污染。分子克隆第二版343頁，上關(guān)于提取RNA所用的玻璃容器的處理方法 ，是用前180度干烤8小 時或更長時間；另一種方法是 0.1%的depc水浸泡(37度2小時)，然后滅菌水淋洗數(shù)次,100度 干烤15分鐘，然后高壓滅菌除去depc.我們實(shí)驗(yàn)室一直是用 170度考4小時，且不準(zhǔn)離人，不準(zhǔn) 過夜，可能是怕烤箱長時間高溫，線路老化會發(fā)生危險吧提取RNA所用的槍頭，EP管。直接高壓烘干即可。如果用

23、0.1 % DEPC處理，要在 DEPC配 置后振搖1小時后再浸泡槍頭，EP管方有效。我做的都是將槍頭泡在配制好的depc中，搖120度干烤一會振過夜，然后倒掉 depc注意要到干凈，再高壓，為了防止仍殘留液體可A.對于提取RNA來說，我認(rèn)為關(guān)鍵的一點(diǎn)在于實(shí)驗(yàn)器材的準(zhǔn)備 .包括從最初的標(biāo)本的制備，保 存，以及之后的試劑的準(zhǔn)備，勻漿器，鐐子,tip頭的去除RNase處理，尤其是去除 RNase的DEPC 處理步驟B.您在處死大鼠前，先準(zhǔn)備好干凈的凍存管（用1.5ml的Ep管也可以，就是后面您在從液氮中 取出的時候容易爆，您的注意安全，然后將去除的骨骼肌立即用干凈的剪刀分成半顆到一顆黃豆大小，裝入

24、凍存管后立即投入液氮保存.個人認(rèn)為在這里使用裝標(biāo)本的管子沒必要用DEPC處理C.在提取RNA之前，將試劑（TRIzo肝口器械（tip頭銀子勻漿器）都準(zhǔn)備好D.從液氮取出標(biāo)本后，立即轉(zhuǎn)移進(jìn)入事先加入TRIzol的勻漿器內(nèi)（最好置冰上操作）,立即勻漿，一直到標(biāo)本完全碾磨碎，這個時候TRIzol液體成渾濁狀，而且勻漿器的壁上沒有太多的黏附組 織,然后將TRIzol轉(zhuǎn)出，繼續(xù)后續(xù)的步驟.1 RNase是一種蛋白酶，能夠降解 RNA。2我們的手上皮膚上有很多，應(yīng)該是對我們的身體起保護(hù)作用。保護(hù)不被RNA病毒感染？或者什么的。3這個酶高效穩(wěn)定。要么在 DEPC水中處理n小時，要么在160度高溫烘烤6小時。

25、此酶才 會失效。4所謂DEPC是一種叫做焦碳酸二乙酯白東西。有毒啊。所謂 DEPC水，一般指兩種狀態(tài)， a,配制好未消毒；b,配制好已消毒。通過高壓消毒，該物質(zhì)會降解，從而無毒。1無菌蒸儲水中加入 0.1%（v/v）焦碳酸二乙酯（DEP。，室溫攪拌4小時以上至完全溶解，高壓滅菌20分鐘，冷卻備用。這個是 DEPC水的b狀態(tài)。2如果你要用DEPC水處理Tips等等東東，那么就要用高壓前的水，即DEPC水白a狀態(tài)。把槍頭管子等完全浸泡至少 8小時，我一般都是過夜的，或者平時就泡在里面?zhèn)溆?。RNA提取必須創(chuàng)造無 RNase的環(huán)境，所有儀器與試劑均按照以下方法進(jìn)行處理：研缽、研棒、藥匙、玻璃器皿等需在

26、180c烘干4h以上；電泳槽、膠板、梳子、用0.1 %0.2%DEPC 水處理過夜或者用洗滌靈清洗干凈后用0.5%的SDS （Sodium dodecyl sulfate,抑制RNase的活性）浸泡過夜，然后用 ddH2O沖洗干凈，晾干備用；離心管，槍頭等塑料器皿要用0.1%0.2%DEPCK處理之 后（DEPC有致癌之嫌，須小心操作）。37保溫12h以上，然后高壓滅菌， 滅活DEPC （ Diethypyrocarbonate ）;溶液都需用經(jīng) DEPC處理過的水配置，RNA提取的所有操作應(yīng)盡可能在超凈工作臺上進(jìn)行。我們研究所里提 RNA用的槍頭和EP管都是高壓兩遍的，沒有用DEPC水處理。

27、1、 有滅菌過的DEPC水，這一般是用來配 75%乙醇用，因?yàn)橐掖既舾邏簻缇鷷]發(fā)，所 以乙醇是新開封專用的。2、 沒有經(jīng)高壓滅菌的 DEPC水，這主要是用于配你提 RNA所用的其他試劑（所說的試劑 是可以經(jīng)高壓滅菌的），總的來說，都得經(jīng)過高壓滅菌，目的就是要去除DEPC以防止它以隨后實(shí)驗(yàn)的干擾。3、 DEPCi理水：無菌蒸儲水中加入0.1%（v/v）焦碳酸二乙酯（DEP。，室溫攪拌4小時以上，121度高壓滅菌20分鐘，冷卻備用。凡是不能用高溫烘烤的材料如塑料容器等皆可用0.1%的焦碳酸二乙酯（DEPC水溶液處理，再用蒸儲水沖凈。DEPC是RNA酶的化學(xué)修飾劑，它和RNA酶的活性基團(tuán)組氨酸的咪

28、陛環(huán)反應(yīng) 而抑制酶活性。DEPC與氨水溶液混合會產(chǎn)生致癌物，因而使用時需小心。試驗(yàn)所用試劑也可 用DEPCi理，加入DEPC至0.1%濃度,然后劇烈振蕩10分鐘,再煮沸15分鐘或高壓滅菌以消 除殘存的DEPC否則DEPC也能和腺喋吟作用而破壞mRNA活性。但DEPCt歸與胺和疏基反應(yīng)，因而含Tris和DTT的試齊ij不能用DEPC處理。Tris溶液可用DEPCM理的水配制然后高壓滅菌。 配制的溶液如不能高壓滅菌，可用DEPC處理水配制，并盡可能用未曾開封的試劑 .為啥在28s之后還是有影影約約的片斷？和模糊的smear?這都與非變性電泳方式有關(guān)。RNA的電泳，嚴(yán)格講是要使用變性電泳的，我們平時

29、所知道的RNA電泳的知識，實(shí)際上都是由變性電泳獲得的。但因?yàn)榉亲冃噪娪緦?shí)在是太方便了，同 時，就一般檢測而言，完全可以替代變性電泳，所以我們?nèi)粘z測就都使用非變性電泳了。電泳時間太長了容易產(chǎn)生降解。最好是在120V左右。操作的時候有沒有注意戴口罩和手套， 注意，手套要經(jīng)常換，不要太節(jié)約了。那樣也會影響RNA的質(zhì)量。無論你是提什么 RNA只要是用異丙醇沉淀的，都得用75 %的酒精洗滌一次。1樣品不要太多，抽提務(wù)必充分，室溫放置5min;2 200ul氯仿 劇烈振蕩20s,室溫放置 215min；3 13000g 離心 15min;4取上層水相，一般400-450ul就足夠了，千萬不要貪多！*5加

30、入500ul異丙醇 搖勻，室溫放置10min ;6 12000g 離心 10min;7 75%乙醇1000ul洗滌沉淀；8 7500g離心5min； （ 12000轉(zhuǎn)速太高了吧，沉淀不容易溶解的）9棄乙醇，吸干凈殘余的微量乙醇，室溫干燥3 5min；（時間太久沉淀不易溶解）10適量DEPCK溶解沉淀。電泳的上樣量1ug,電泳buffer用DEPC處理的水配制，電泳時間不要太久，95V, 10 15min 足夠了。建議跑RNA電泳。先用2%瓊脂糖膠，若分離效果不好，可用甲醛變性膠。在上樣緩沖液中注意加入RNA酶抑制劑。注意觀察帶形，質(zhì)量較好的 RNA亮度。28S:18S應(yīng)為2:1。還要注 意觀察

31、，在加樣孔或剛出加樣孔附近，有沒有帶，若有，可能為基因組 DNA污染。OD值只有1.5,可能為基因組 DNA污染。參考一下分子克隆 3。上面有OD值與?虧染DNA的關(guān)系。 建議，酚氯仿抽提后，上清可少吸一些。提取后的RNA樣品可用無RNA酶的DNA酶消化一下。注意該酶的buffer中有一種物質(zhì)在 OD260有吸光度，應(yīng)嚴(yán)格按照其 protocol操作，減 少誤差。只要用DEPC處理過的水，打開一瓶新的無水乙醇（或者專用于RNA的，即只用處理過的槍頭取過乙醇的） 配就可以了。DEPC高溫高壓時變成 CO2和水，再加上乙醇也很容易氣化， 可能是因?yàn)橛袣怏w產(chǎn)生吧，如果蓋子太緊容易發(fā)生瓶子破掉的事情。

32、（我還從來沒有聽說過把乙醇高溫滅菌過）而且，濕熱滅菌本身不足以去除RNA酶，所以我覺得有時候，滅菌可能反而引入RNA酶污染也不一定哦75%的乙醇用于提取 RNA時最好還是現(xiàn)用現(xiàn)配，乙醇最好是新的且以后不要用于其他方面， 也就是留一瓶專門用于提取 RNA。DEPC 一般高壓滅菌30分鐘就可以了！75%乙醇：滅菌后的千分之一 DEPC水25ml 75ml無水乙醇.配好后裝入高溫烘烤的玻璃瓶中(160干烘四小時)，或塑料器皿的用千分之一的DEPCm 12小時以上再滅 30分鐘，存放于低溫冰箱4度保存!實(shí)驗(yàn)H一動物組織細(xì)胞總 RNA勺提取一、實(shí)驗(yàn)原理RNA1基因表達(dá)的中間產(chǎn)物，存在于細(xì)胞質(zhì)與核中。對R

33、NA8行操作在分子生物學(xué)中占有重要地位。獲得高純度和完整的RNA是很多分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)所必需的，如 Northern雜交、cDNA合成及體外翻譯等實(shí)驗(yàn)的 成敗，在很大程度上取決于RNA的質(zhì)量。由于細(xì)胞內(nèi)的大部分 RNA1以核蛋白復(fù)合體的形式存在，所以在提取RNA寸要利用高濃度的蛋白質(zhì)變性劑，迅速破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)，使核蛋白與RN砌離，木!放出RNA再通過酚、氯仿等有機(jī)溶劑處理、離心，使RNA與其他細(xì)胞組分分離，得到純化的總RNA在提取的過程中要抑制內(nèi)源和外源的 RNase活性，保護(hù)RNA分子不被降解。因此提取必須在無RNase的環(huán)境中進(jìn)行?？墒褂肦Nase抑制劑，如DEPQ1 RNase的強(qiáng)抑制劑，常

34、用來抑制外源 RNase活性。提取緩沖液中一般含SDS酚、氯仿、服鹽等蛋白質(zhì)變性劑，也能抑制RNase活性。并有助于除去非核酸成分。本實(shí)驗(yàn)介紹異硫氧酸服法和 TRIzol法提取動物組織總RN斷通過電泳進(jìn)行鑒定。二、儀器和試劑(1) 器：超凈工作臺、高速冷凍離心機(jī)、電泳儀、紫外分光光度計、凝膠成像系統(tǒng)、振蕩器、移液器、吸頭、Ep管、玻璃勻漿器、試管、玻璃器皿洗凈后置180c烘烤8h;不耐高溫的器皿(如塑料制品)應(yīng)用 0.1% DEPC浸泡2h,7080c烘烤 干燥，120c高壓20min,再7080c烘烤干燥方可使用。(2) 劑：(1)細(xì)胞裂解液：異硫氧酸服 4mol/L檸檬酸鈉(pH7.0) 25mmol/L十