大蒜素對(duì)阿爾茨海默病小鼠學(xué)習(xí)記憶能力和腦組織抗氧化能力的影響

1、大蒜素對(duì)阿爾茨海默病小鼠學(xué)習(xí)記憶能力和腦組織抗氧化能力的影響    A clear conscience is a sure card.                         作者：胡昔奇 李先輝 鄭堯帆 龍穎 曹萍 張潔【摘要】 

2、0;目的 觀察大蒜素對(duì)阿爾茨海默病(AD)小鼠學(xué)習(xí)記憶能力和腦組織抗氧化能力的影響。方法 采用 D半乳糖建立AD小鼠模型，大蒜素治療組在造模的同時(shí)皮下注射大蒜素。通過行為學(xué)方法，觀察大蒜素對(duì)AD小鼠記憶能力的影響;測(cè)定各組腦組織中丙二醛(MDA)含量和超氧化物歧化酶(SOD)的活性;常規(guī)HE和鍍銀改良法染色觀察小鼠海馬及皮質(zhì)的形態(tài)學(xué)改變。結(jié)果 模型組與對(duì)照組、大蒜素治療組比較，小鼠記憶功能明顯減退,神經(jīng)細(xì)胞破壞明顯,海馬和皮質(zhì)出現(xiàn)淀粉樣蛋白沉積及老年斑;大蒜素治療組和對(duì)照組的丙二醛(MDA)含量較模型組顯著降低(P<0.05)，SOD活性明顯高于模

3、型組(P<0.05)()。結(jié)論 大蒜素在清除自由基和抗氧化損傷方面有顯著功效，可以有效改善AD小鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力損害。 【關(guān)鍵詞】  大蒜素; 阿爾茨海默病; 行為學(xué);抗氧化能力Riches do not always bring happiness.               大蒜素是大蒜的主要成分，具有抗腫瘤、抗氧化、抗血小板聚集、提高免疫、清除自由基、護(hù)肝、降血脂、降血壓及預(yù)防心血

4、管疾病等生理學(xué)作用1。因其具有較好的脂溶性，可通過血腦屏障，因此在防治腦血管病方面的作用也備受關(guān)注。研究資料顯示,大蒜素可改善血液流變性、增加腦血流量、清除自由基、改善腦功能及減輕急性腦梗死時(shí)缺血再灌注損傷2。大蒜素作為一種具有良好發(fā)展前景的天然抗氧化藥物,具有抗氧化延緩衰老的作用3，同時(shí)對(duì)腦缺血再灌注大鼠海馬神經(jīng)元具有保護(hù)作用4,而氧化應(yīng)激和海馬神經(jīng)元的損傷是阿爾茨海默病(AD)的主要發(fā)病機(jī)制。本研究采用D半乳糖致小鼠AD模型，從組織形態(tài)學(xué)角度,觀察大蒜素對(duì)AD腦組織的保護(hù)作用及對(duì)小鼠學(xué)習(xí)記憶能力的改善作用，并對(duì)其抗氧化機(jī)制進(jìn)行初步研究,為臨床應(yīng)用大蒜素防治AD提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。1 材

5、料與方法1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康昆明雌性小鼠30只，清潔級(jí)，體重1822 g，湖南長(zhǎng)沙市開福區(qū)東創(chuàng)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物服務(wù)部提供，批準(zhǔn)號(hào)：001847(醫(yī)藥學(xué)/臨床醫(yī)學(xué)論文 )。1.2 藥品與試劑 大蒜素腸溶膠囊(20 mg/粒，湖北金龍福藥業(yè)有限公司，批號(hào)H42022592)，D半乳糖由國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司提供(批號(hào)20050422)，兔抗P38 MAPK、SABC免疫組化試劑盒、DAB顯色試劑盒由武漢博士德有限公司提供，考馬斯亮蘭蛋白測(cè)定試劑盒、丙二醛(MDA)測(cè)定試劑盒及超氧化物歧化酶(SOD)測(cè)定試劑盒均由南京建成生物工程研究

6、所提供。1.3 主要儀器 BX51 系統(tǒng)顯微鏡(Olympus)、微量進(jìn)樣器(上海安亭微量進(jìn)樣器廠)、UV3100PC型紫外可見分光光度計(jì)(上海美譜達(dá)儀器有限公司)。1.4 動(dòng)物分組及造模 按照改良的Morris法對(duì)60只小鼠進(jìn)行連續(xù)7 d Morris水迷宮定向航行訓(xùn)練5。每天分上下午2個(gè)時(shí)段，每個(gè)時(shí)段訓(xùn)練2次,并記錄小鼠從放入水槽至找到平臺(tái)的時(shí)間(逃避潛伏期)，若120 s仍找不到平臺(tái)，則由實(shí)驗(yàn)者將小鼠放置于平臺(tái)上，逃避潛伏期記為120 s，并讓小鼠在平臺(tái)上休息30 s。根據(jù)訓(xùn)練成績(jī)，選擇成

7、績(jī)較好的30只小鼠。按體重分層隨機(jī)分成3組： AD模型組，大蒜素治療組，陰性對(duì)照組。每組10只。AD模型組與大蒜素治療組皮下注射12.5% D半乳糖40 l，連續(xù)60 d。Deeds are fruits; words are but leaves.  1.5 給藥方法 大蒜素治療組在造模的同時(shí)按10 ml/kg進(jìn)行腹腔注射大蒜素腸溶膠囊提取物0.48 g·kg-1·d-1;AD模型組和陰性對(duì)照組給予相同劑量的生理鹽水，連續(xù)60 d。1.6 水迷宮行為學(xué)檢測(cè)

8、0;連續(xù)給藥60 d后，對(duì)小鼠進(jìn)行改良的Morris水迷宮法檢測(cè)，記錄小鼠的逃避潛伏期，評(píng)價(jià)各組大鼠記憶能力的改變。1.7 抗氧化活性檢測(cè) 行為學(xué)檢測(cè)結(jié)束后，用25%的烏拉坦麻醉小鼠后固定于自制的手術(shù)板上，置于解剖盤中，開胸暴露并游離心臟。切開右心房，經(jīng)左心室插入灌流4生理鹽水2030 ml，直至肝臟顏色轉(zhuǎn)白及右心房流出液澄清后，繼續(xù)灌注4%甲醛2030 ml，取腦組織海馬部組織塊1 cm3 左右，4%甲醛浸泡固定24 h后，做石蠟組織切片。測(cè)定殘余腦組織重量，按重量體積比加4生理鹽水制成10%的組織勻漿，離心(2

9、 500 r/min，10 min)，取上清液，置4備用。測(cè)定SOD 活力和MDA 含量。  1.8 組織形態(tài)的觀察 分別采用HE染色和鈴木神經(jīng)組織鍍銀改良法6染色觀察小鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞及神經(jīng)原纖維纏結(jié)(NET)。1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 數(shù)據(jù)用x±s表示，兩個(gè)樣本比較采用t檢驗(yàn)，多個(gè)樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析,所有統(tǒng)計(jì)由SPSS17.0軟件處理。 論文教育信息網(wǎng)  The wise hand doth not all that the fool.  2

10、60;結(jié) 果2.1 大蒜素AD模型小鼠學(xué)習(xí)記憶能力的影響 改良的Morris水迷宮記錄小鼠的潛伏期,實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，AD模型組小鼠的潛伏期(54.25±4.34) s，明顯長(zhǎng)于大蒜素治療組(6.67±1.81) s和陰性對(duì)照組(12.18±3.94) s,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);大蒜素治療組與陰性對(duì)照組潛伏期比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。He who would search for pearls must dive below(or deep).  2.2

11、0;MDA、SOD測(cè)定 大蒜素治療組和陰性對(duì)照組MDA 含量較AD模型組顯著降低(P<0.05),SOD活性高于AD模型組(P<0.05)，見表1。2.3 小鼠海馬區(qū)域切片HE染色和鈴木神經(jīng)組織鍍銀改良法染色結(jié)果 HE染色結(jié)果顯示，AD模型組海馬區(qū)腦組織可見小膠質(zhì)細(xì)胞增多,神經(jīng)細(xì)胞數(shù)量減少,細(xì)胞散失,排列不成行,組織疏松;大蒜素治療組海馬區(qū)腦組織可見神經(jīng)細(xì)胞普遍細(xì)長(zhǎng),細(xì)胞排列較規(guī)整;陰性對(duì)照組海馬區(qū)腦組織神經(jīng)細(xì)胞排列整齊,少數(shù)細(xì)胞濃染，見圖1。鈴木神經(jīng)組織鍍銀改良法染色結(jié)果示，模型組海馬區(qū)腦組織切片可清楚看到大量NET;大蒜素治療組海馬區(qū)腦組

12、織切片錐體細(xì)胞顯示清晰，均未見到NET;對(duì)照組海馬區(qū)腦組織切片中錐體細(xì)胞顯示清楚，形態(tài)正常，未見NET，見圖2。表1 大蒜素對(duì)AD模型小鼠腦組織SOD活性和MDA 含量比較3 討 論P(yáng)oliteness costs nothing and gains everything.  AD是發(fā)生在老年期或老年前期的一種中樞神經(jīng)系統(tǒng)慢性漸行性退行性疾病,以腦細(xì)胞內(nèi)NFT 、細(xì)胞外老年斑(SP) 以及大量神經(jīng)元丟失為主要病理特征7。國(guó)內(nèi)外研究證實(shí),自由基引起的氧化損傷是不同病因誘發(fā)神經(jīng)退行性疾病的共同通路8。大量的自由基能夠損傷生物大分

13、子使蛋白質(zhì)、DNA和脂質(zhì)過氧化,致使神經(jīng)細(xì)胞凋亡和缺失，導(dǎo)致學(xué)習(xí)和記憶障礙，進(jìn)而導(dǎo)致或加重AD。Early mistakes are the seeds of future trouble.  大蒜素又名大蒜新素，化學(xué)名為二烯丙基三硫化物，其結(jié)構(gòu)式為CH2=CH-CH-S-S-S-CH2-CH=CH2,是大蒜的主要有效成分。藤田勛等研究表明大蒜素的抗氧化活性部位是S(O)SCH2CH=CH2基團(tuán)，其中烯丙基位的氫與抗氧化活性有關(guān)。有研究表明,大蒜素對(duì)小鼠局灶性腦缺血再灌注損傷有明顯保護(hù)作用9,其機(jī)制可能與提高抗氧化酶活性,抗脂質(zhì)過氧化損傷及抗炎作用有關(guān)10。本研究表明大蒜素能改善AD

14、模型小鼠學(xué)習(xí)能力和記憶功能，有效地清除腦組織過氧化代謝產(chǎn)物MDA，增強(qiáng)SOD的活性，提高了機(jī)體的抗氧化能力。因此，可以推斷大蒜素可以用來早期干預(yù)或預(yù)防AD，改善AD患者認(rèn)知、記憶等臨床癥狀。Death when it comes will have no denial.  【參考文獻(xiàn)】  1 邵力鈞，單文衛(wèi).大蒜素的臨床應(yīng)用進(jìn)展J.中國(guó)現(xiàn)代醫(yī)生,2009;47(3)：453.2 史載樣,張久亮，毛建生.大蒜素注射液治療急性腦梗死101例臨床研究J.中西醫(yī)結(jié)合急救雜志，1999;6(9)：3904.3 劉 浩,崔美芝,董

15、60;娟.大蒜素抗氧化延緩衰老作用的實(shí)驗(yàn)研究J.中國(guó)老年學(xué)雜志，2006;26(2)：2522.4 郭莉華，李清君，胡玉燕，等.大蒜新素對(duì)腦缺血再灌注大鼠海馬的保護(hù)作用及對(duì)P53蛋白表達(dá)的影響J.中國(guó)病理生理雜志，2009;25(2)：264.5 聶榮慶,張 進(jìn)，胡國(guó)柱，等.腦細(xì)胞活性因子對(duì)小鼠學(xué)習(xí)、記憶能力的影響J.中國(guó)行為醫(yī)學(xué)科學(xué),2002;11(5)：4882.6 賴 紅,田應(yīng)燮.鈴木神經(jīng)組織鍍銀改良法在石蠟連續(xù)切片中的應(yīng)用J.解剖科學(xué)進(jìn)展，1995;1(4)：347.7 St GeorgeHyslop PH，Petit A.Molecular biology and genetics of Alzheimers diseaseJ.CR Biol，2005;328(2)：11930.8 Yves C.Oxidative stress and Alzheimer diseaseJ.Am J Clin Nutr,2000;71(2)：6219.9 賈海忠,史載祥,李 格，等.大蒜素犬心肌缺血再灌注