淺探肺炎鏈球菌候選蛋白疫苗ClpP的保守性和抗原性

1、淺探肺炎鏈球菌候選蛋白疫苗ClpP的保守性和抗原性    摘要： 目的: 評價酪蛋白裂解酶P(ClpP)作為候選疫苗的保守性和抗原性，分析在不同血清型肺炎鏈球菌（SPN）中的表達情況. 方法: 以TIGR4型SPN的ClpP基因序列設(shè)計引物，分別以12株不同血清型SPN的基因組DNA為模板，對ClpP基因進行聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)擴增、膠回收產(chǎn)物與PMD18克隆載體連接后進行測序，運用生物信息學(xué)方法對其核苷酸及推測的氨基酸序列及抗原性進行分析，并利用Western Blot方法檢測12株不同血清型SPN的ClpP蛋白的表達情況. 結(jié)果: 12株不同血清型

2、SPN的ClpP基因序列和GenBank數(shù)據(jù)庫對已公布的TIGR4型SPN的ClpP基因一致性>99.0%，推測的氨基酸序列一致性>99.5%. Western Blot結(jié)果顯示antiClpP多克隆抗體與12型SPN的菌體蛋白能夠起交叉反應(yīng). 結(jié)論: ClpP蛋白在不同型SPN之間同源性高，在不同型SPN菌株中均有表達. ClpP是一個具有前景的SPN候選蛋白疫苗因子. 關(guān)鍵詞：  肺炎鏈球菌；ClpP基因；序列分析；抗原性      0引言    肺炎鏈球菌（streptococcus p

3、neumoniae，SPN）是引起獲得性肺炎、中耳炎、鼻竇炎的主要病原菌. 隨著多重耐藥菌株的不斷發(fā)現(xiàn)，疫苗在預(yù)防和控制SPN感染中的作用越來越重要1. SPN根據(jù)莢膜可分為90多個血清型，開發(fā)對所有血清型SPN都具抵抗作用的高保守性蛋白疫苗是目前SPN疫苗的發(fā)展方向. 研究發(fā)現(xiàn)的SPN蛋白質(zhì)候選疫苗酪蛋白裂解酶P(caseinolytic protease P, ClpP）是ATP依賴的絲氨酸蛋白水解酶2，其在SPN的生存、致病和入血過程中起著重要的作用3-4，針對其靶點的疫苗或抗生素也越來越顯示出其潛在的價值. 本研究探討ClpP在不同SPN菌株中的保守性與抗原性，以及在不同血清型SPN中

4、表達情況，旨在為自主開發(fā)SPN蛋白疫苗奠定基礎(chǔ).    1材料和方法    1.1材料    1.1.1菌種與質(zhì)粒12株不同血清型SPN： CMCC(B)31 109(serotype 1)，CMCC(B)31 203(serotype 3)，CMCC(B)31 446(serotype 4)，CMCC(B)31 011(serotype 5)，CMCC(B)31 207(serotype 6B)，CMCC(B)31 507(serotype 7F)，CMCC(B)31 216 (serotype 9V)

5、，CMCC(B)31 614 (serotype 14)，CMCC(B)31 687(serotype 18C)，CMCC(B)31 693(serotype 19F)，CMCC(B)31 759(serotype 23F)（北京中國醫(yī)學(xué)細(xì)菌保藏管理中心），NCTC7466 (serotype 2，國際通用名為D39)（歐洲國家標(biāo)準(zhǔn)菌種庫）；大腸桿菌DH5a和原核表達系統(tǒng)(含pET32a(+)/ClpP重組質(zhì)粒)E.coli BL21(DE3)(重慶醫(yī)科大學(xué)臨床檢驗診斷學(xué)重點實驗室)，金黃色葡萄球菌標(biāo)準(zhǔn)菌株(重慶醫(yī)科大學(xué)微生物學(xué)教研室)，質(zhì)粒PMD18T載體試劑盒(日本TaKaRa公司).&#

6、160;   1.1.2試劑DNA提取試劑盒，凝膠回收試劑盒及日常型質(zhì)粒DNA快速制備試劑盒(上海華舜公司)；限制性內(nèi)切酶EcoRI，SacI，高保真LA Taq聚合酶，dNTPs，Buffer，MgCl2(大連寶生物技術(shù)公司)；丙烯酰胺，雙丙烯酰胺，異丙基D硫代半乳糖苷(IPTG)，完全弗氏佐劑(CFA)和不完全弗氏佐劑(IFA)(美國Sigma公司)；DNA marker(上海生工公司)；Goatantimouse IgG HRP(H+L)和3二氨基苯聯(lián)胺DAB3(北京中杉公司)；咪唑，Nacl和Tris堿(美國BBI公司)；His Bind Column(NiNTA)

7、鎳柱(美國Novagen公司).    1.1.3儀器熱循環(huán)儀（TMBioRad PCR，美國gene cycle公司）； 電泳儀（Power/PAC200，美國BioRad公司）.    1.1.4動物BALB/c小鼠，雌性，810 wk齡，體質(zhì)量1820 g（重慶醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心）.    1.2方法    1.2.1聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)擴增目的基因?qū)?2株SPN在C+Y培養(yǎng)基中增菌至對數(shù)生長中后期，按試劑操作說明書分別提取基因組DNA，擴增ClpP的開放讀碼框架(

8、591 bp). 上游引物：5CGAATTCATGATTCCTGTAGTTAT3，含EcoRI位點；下游引物：5CGAGCTCTTAGTTCAATGAATTGTTG3，含SacI位點，引物由上海生工生物技術(shù)公司合成. 使用La Taq高保真DNA聚合酶，以不同型SPN基因組DNA為模板進行擴增. PCR體系: ddH2O 13.7 L，5×buffer(含Mg2+) 6.0 L，dNTP(10 mmol/L) 2.4 L，P1(5 pmol/L) 3 L，P2(5 pmol/L) 3 L，SPN DNA 1.5 L，LA Taq 0.4 L. 在PCR儀上按下列條件進行擴增：95預(yù)熱

9、5 min后反應(yīng)30個周期：94 1 min，53 1 min，72 1 min. 末輪后72延伸 5 min. 取5 L反應(yīng)產(chǎn)物置10 g/L瓊脂糖凝膠電泳鑒定后，DNA膠回收試劑盒回收PCR產(chǎn)物.    1.2.2TA克隆載體的構(gòu)建與鑒定將回收純化的12個PCR產(chǎn)物克隆至PMD18T載體，轉(zhuǎn)入DH5感受態(tài)細(xì)胞，在Amp+LB平板上培養(yǎng)得到多個陽性克隆，單個陽性克隆細(xì)菌經(jīng)增菌后進行質(zhì)粒抽提后雙酶切鑒定，并將質(zhì)粒送往重慶醫(yī)科大學(xué)感染實驗室做雙向測序.    1.2.3序列比對與氨基酸序列預(yù)測利用DNAssist軟件，將12個重組克隆質(zhì)

10、粒雙向測序的結(jié)果及預(yù)測的氨基酸序列與GenBank數(shù)據(jù)庫對已公布的TIGR4 SPN全基因組序列進行相似性分析. 1.2.4抗原表位預(yù)測用抗原表位預(yù)測工具ANTIGENIC PREDICTED ANTIGENIC PEPTIDES分析不同血清型SPN ClpP蛋白的抗原表位及其氨基酸組成.    1.2.5PETClpP重組載體的誘導(dǎo)表達及純化原核表達系統(tǒng)pET32a    (+)/ClpPE.coli BL21(DE3)在終濃度1 mmol/L IPTG，37，250 r/min條件下誘導(dǎo)目的重組蛋白ClpP的表

11、達. 收集的菌體超聲波碎菌后，采用NiNTA柱純化目的蛋白，以SDSPAGE和BioRad凝膠圖像分析系統(tǒng)檢查目的重組蛋白表達與提純效果. 將透析除鹽的純化蛋白溶液經(jīng)Bradford法定量后備用.    1.2.6antiClpP抗血清的制備稀釋后重組clpP蛋白溶液與等體積的CFA或IFA充分混勻成乳狀，在小鼠腹腔下接種制備好的抗原蛋白. 初次免疫時小鼠接受含200 L(含重組蛋白10 g)的CFA與重組蛋白混合物；小鼠再次與末次免疫時接受200 L(含重組蛋白10 g)的IFA與重組蛋白混合物. 小鼠經(jīng)3次免疫后，分離小鼠血清，并用ELISA法測其antiCl

12、pP抗體效價.    1.2.7Western Blot檢測將12株SPN在C+Y培養(yǎng)基中增菌至對數(shù)生長中后期（A620 nm 0.50.6左右），各取2 mL菌液離心取沉淀. 沉淀用PBS洗3次，用1×上樣buffer處理后，于100水浴5 min. 全菌裂解物經(jīng)SDSPAGE電泳分離后轉(zhuǎn)膜. 以antiClpP多克隆抗體為一抗（1400)，羊抗鼠HRPIgG為二抗（15000），DAB為顯色底物，Western Blot檢測菌體中ClpP蛋白的表達，以金黃色葡萄球菌作為對照.    2結(jié)果  

13、0; 2.1目的基因PCR產(chǎn)物12株細(xì)菌的PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后，可見清晰的擴增條帶，產(chǎn)量高，所有PCR產(chǎn)物的分子大小一致，都位于600 bp左右(圖1).    2.2TA克隆載體的構(gòu)建與鑒定將12個重組克隆質(zhì)粒雙酶切后，經(jīng)10 g/L的瓊脂糖凝膠電泳，于期望位置上出現(xiàn)目的條帶(圖2)，證明ClpP開放讀碼框架正確克隆入PMD18T載體，同時菌落PCR結(jié)果也證明基因克隆正確.    2.3測序結(jié)果與序列比對不同株的ClpP基因編碼區(qū)大小與TIGR4菌株中ClpP基因一樣，均為591 bp，起始密碼子為ATG，終止密碼子為TAA

14、，編碼196個氨基酸，基因序列一致性超過99%. 由于遺傳密碼子的簡并性，預(yù)測的氨基酸序列一致性則為99.5%以上. 經(jīng)生物學(xué)信息軟件分析結(jié)果顯示，serotype 4，5，6B 三菌株ClpP氨基酸序列與TIGR4菌株ClpP氨基酸序列僅存在著一個氨基酸的差異，serotype 1 SPN與TIGR4菌株ClpP氨基酸序列僅存在著兩個氨基酸的差異，其余血清型與TIGR4菌株ClpP氨基酸序列完全一致.    2.4抗原表位分析結(jié)果12株SPN ClpP蛋白的抗原表位數(shù)目相同（分別含7個抗原表位）并且氨基酸組成及分布完全一致.   

15、2.5融合蛋白及其antiClpP抗體效價轉(zhuǎn)化菌經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后，較未誘導(dǎo)菌有一條明顯增粗的蛋白條帶，Mr約為42×103左右，與期望值相符合（ClpP蛋白約為Mr 21×103，再加上Mr 21×103左右的硫氧還蛋白）. 蛋白溶液經(jīng)鎳離子柱親和層析后透析，SDSPAGE證明純化產(chǎn)物為單一蛋白，純度達90%. 該蛋白免疫小鼠后用ELISA法測得的血清效價為168 000（圖3）.    2.6ClpP蛋白的表達SPN全菌裂解物經(jīng)電泳分離后，與制備的antiClpP血清反應(yīng)，12型SPN全菌裂解物Mr均在21×103的位置出

16、現(xiàn)特異性反應(yīng)條帶，而陰性對照未見反應(yīng)條帶出現(xiàn)(圖4). 提示不同血清型SPN中均有ClpP蛋白抗原的表達.    3討論    蛋白疫苗是SPN的第三代疫苗. 目前認(rèn)為理想的SPN蛋白質(zhì)疫苗的標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)包括:能在細(xì)胞壁表達或者以分泌方式表達、在人體內(nèi)抗原性高、能誘導(dǎo)殺菌的抗體和具有高度的保守性. 隨著基因組學(xué)與蛋白組學(xué)的發(fā)展，SPN毒力相關(guān)蛋白候選疫苗不斷地被篩選出來. 但是一些蛋白由于等位基因的變異5-7，針對于該蛋白的抗體升高不能識別其等位基因變異的表達產(chǎn)物，從而不能誘導(dǎo)針對不同血清型菌株廣泛的免疫保護. 因此，候選疫苗是否具有誘導(dǎo)高

17、水平、能與不同種類的型或亞型菌株起交叉反應(yīng)的抗體的能力，是很多致力于SPN疫苗的專家不斷尋找高保守蛋白疫苗的原因8-9.    我們要評價ClpP候選蛋白疫苗的價值就應(yīng)考慮其在不同血清型SPN的保守性，并考慮ClpP是否在SPN菌體中表達. 本研究選用分離自不同標(biāo)本并且在中國比較常見的1012株不同血清型SPN進行研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在12株菌中ClpP基因相當(dāng)保守，其抗原表位氨基酸組成以及分布完全一致，無抗原位點的突變，而且12株SPN菌體蛋白中都有ClpP蛋白的表達. 我們的結(jié)果初步表明：ClpP在不同血清型SPN中高度保守，在不同型菌體中都有表達. &

18、#160;  細(xì)胞壁表達的高保守性蛋白是首選的疫苗靶點. 目前研究較多的幾個SPN蛋白質(zhì)疫苗如PspA11，PspC6和PLY12等，PspA和PspC雖在細(xì)胞壁表達，但由于等位基因變異，保守性相對較差；PLY雖具有較高的保守性，但在細(xì)胞內(nèi)表達，其抗體難以透過細(xì)胞壁與之結(jié)合，疫苗保護效果難以得到保證. 而ClpP在SPN熱休克后從細(xì)胞內(nèi)向細(xì)胞壁易位3，同時具有高度的保守性，因此它是SPN很好的疫苗靶點，將其單獨使用或與其他的蛋白疫苗組合使用，可能會使SPN蛋白疫苗的研究取得突破性進展，從而為我們自主開發(fā)廣保護范圍的SPN疫苗提供理論基礎(chǔ).    另外我們也采用了BLAST方法分析了SPN ClpP與鄰近種屬細(xì)菌ClpP基因序列的相似性，發(fā)現(xiàn)SPN ClpP與許多其它種屬細(xì)菌的ClpP基因序列具有高度的同源性，比如SPN的ClpP與唾液酸鏈球菌ClpP的預(yù)測氨基酸序列相似程度為87%88%，與無乳鏈球菌ClpP的預(yù)測氨基酸序列相似程度為91%9