水稻條紋病毒致病相關(guān)蛋白與宿主相互作用的研究 - 揚

1、RSV CP與植物和昆蟲宿主互作的研究(趙淑玲 學(xué)號: D08037 導(dǎo)師: 梁建生教授)摘要:水稻條紋病毒(Rice stripe virus,RSV)引起的水稻條紋葉枯病對水稻生產(chǎn)造成了巨大損失，特別是近幾年來該病連續(xù)爆發(fā)流行引起了人們的普遍關(guān)注，因此弄清RSV的致病機理和如何防治病害發(fā)生成為研究者迫切希望解決的問題。雖然目前RSV基因組功能方面有了一些初步研究，但是該病毒與宿主互作及病毒的致病機理還未有研究報道，病毒的侵染和致病機理還不清楚。RSV的衣殼蛋白（Capsid protein,CP）是一種多功能蛋白，在病毒的侵染、復(fù)制、運動和傳播方面均起重要作用。因此本項目擬開展RSV CP

2、與植物和昆蟲相互作用的研究，通過此項工作深入了解CP在病毒的致病及傳播過程中所起的作用，同時還可對病毒的侵染機理以及病毒與宿主的相互作用有更深層次的認(rèn)識，也為開展植物抗病毒基因工程的研究和應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。關(guān)鍵詞：RSV；衣殼蛋白；相互作用；侵染機理1. 研究背景及意義1.1 水稻條紋病毒的危害水稻條紋病毒(Rice stripe virus, RSV)是水稻條紋葉枯病的致病原，該病毒僅靠介體昆蟲傳播，其他途徑不能傳病。介體昆蟲主要為灰飛虱，灰飛虱一旦獲毒就可終身帶毒并且經(jīng)卵進行持久性傳播。感染RSV的水稻發(fā)病初期病株心葉沿葉脈呈現(xiàn)斷續(xù)的黃綠色或黃白色短條斑，以后常連成褪綠大片，使葉片一半或大半變

3、成黃白色。早期發(fā)病植株枯死，發(fā)病遲的只在劍葉或葉鞘上有褪色斑，但抽穗不良或穗畸形不實，病株分蘗一般減少。水稻條紋葉枯病最早于1897年在日本發(fā)現(xiàn),在我國自1963年在蘇南地區(qū)始發(fā)后,已經(jīng)擴散到18個省市,特別是近幾年來在江蘇和河南連續(xù)暴發(fā),造成了水稻生產(chǎn)上的巨大損失。該病害2001年在江蘇、河南等地暴發(fā)流行，病田率達50%以上, 2004年再次大規(guī)模流行，病田率達75%以上,且自2004年來該病持續(xù)流行,對水稻生產(chǎn)構(gòu)成了嚴(yán)重威脅1。1.2 水稻條紋病毒的基因組結(jié)構(gòu)及功能RSV屬于纖細(xì)病毒屬( Tenuivirus)，基因組由4條單鏈RNA組成，共編碼7個不同的功能蛋白(如圖1所示)。除RNA1

4、采用負(fù)鏈編碼策略, RNA2 RNA4均采取雙義編碼策略,即在RNA的毒義鏈( viral RNA, vRNA)和毒義互補鏈( viral complementary RNA, vcRNA )的靠近5端處各有一個開放閱讀框(open reading frame, ORF) ,都可以編碼蛋白質(zhì)2,3,4,5。RSV RNA1采取負(fù)鏈編碼策略，vcRNA1編碼病毒的RNA聚合酶（RdRp）6。RSV RNA2正鏈編碼一非結(jié)構(gòu)蛋白NS2，目前NS2的功能還未知。序列分析表明，RSV vcRNA2編碼的NSvc2蛋白與番茄斑萎病毒屬（Tospovirus）病毒膜糖蛋白前體的氨基酸序列之間有相似性，推測

5、NSvc2為病毒的膜糖蛋白。Liang等7在灰飛虱唾液腺和中腸的上皮細(xì)胞中檢測到NSvc2蛋白，且可以和SP在中腸中積累，形成纖維質(zhì)狀的電子質(zhì)不透明內(nèi)含體，而這種內(nèi)含體在植物中幾乎不存在。這意味著NSvc2蛋白和SP都有可能在病毒與昆蟲介體的識別中起作用。RNA3正鏈編碼的蛋白為RNA沉默抑制子，能夠抑制植物、昆蟲細(xì)胞和哺乳動物細(xì)胞的RNA沉默8，9。vcRNA3編碼病毒的衣殼蛋白（CP），RNA4正鏈編碼致病癥狀相關(guān)蛋白（SP）。許多研究結(jié)果已經(jīng)揭示了衣殼蛋白（CP）和致病癥狀相關(guān)蛋白（SP）在病葉中的積累量與褪綠花葉癥狀的嚴(yán)重度密切相關(guān),推測這兩種蛋白都是致病相關(guān)蛋白10，11。明艷林等1

6、2發(fā)現(xiàn)CP和SP存在于受侵染水稻的葉綠體內(nèi),其濃度與病葉癥狀的嚴(yán)重度呈正相關(guān)，并且RSV粒體能夠進行體外葉綠體跨膜運輸研究,結(jié)果表明,病毒粒體能快速進入離體葉綠體。vcRNA4編碼病毒的移動蛋白，Xiong等13通過實驗證實NSvc4能夠使缺失移動蛋白的PVX病毒恢復(fù)運動功能，從而從煙草的一個細(xì)胞達到另一個細(xì)胞，因此推測NSvc4蛋白是RSV的移動蛋白。 圖1. RSV的基因組結(jié)構(gòu)1.3 本項目立項依據(jù)和研究意義 水稻條紋葉枯病近幾年來連續(xù)爆發(fā)流行，給水稻生產(chǎn)帶來了嚴(yán)重的危害,因此如何防治病害發(fā)生及控制病害的流行成為研究者迫切希望解決的問題。雖然對RSV 基因功能進行了一些初步研究，但還有很多

7、基因的功能未知，特別是該屬病毒的侵染和致病機理研究未深入，病毒致病的整個過程還不清楚。另外由于RSV是多片段的負(fù)鏈RNA病毒,不易建立侵染性克隆,因此目前還不能采用如缺失突變、片段重組等傳統(tǒng)基因工程方法來研究其基因功能。這也給RSV基因功能的研究工作帶來了困難，使得RSV的分子水平的研究未深入進行。植物病毒CP是根據(jù)它能包被病毒核酸使其殼體化而被命名，是病毒生命過程中的主要蛋白。除參與病毒粒體的構(gòu)成外，CP在病毒復(fù)制、癥狀形成和傳播過程中也有一定的功能。病毒要在宿主內(nèi)增殖首先要進入宿主細(xì)胞，在這個過程中非包膜的病毒一般是通過外殼蛋白與宿主細(xì)胞表面的受體作用進入細(xì)胞。在寄主和介體的長期進化過程中

8、，假如寄主植物能在初期就對病毒的入侵作出防衛(wèi)反應(yīng)，那它們一般都是靠識別病毒CP作為分子信號來引發(fā)防衛(wèi)機制的，研究表明植物病毒CPs的突變可以改變寄主的范圍和寄主發(fā)病的癥狀特征。在運動方面，CP形成殼體可以保護病毒基因信息防止病毒發(fā)生退化，對于大多數(shù)植物病毒來講，CP對于病毒在被侵染植物中的運動過程都是有重要作用的。另外，CP和SP存在于受RSV侵染水稻的葉綠體內(nèi),其濃度與病葉癥狀的嚴(yán)重度呈正相關(guān)，說明在RSV CP誘發(fā)植物癥狀形成方面也起著非常重要的作用綜上所述，植物病毒的CP是一種多功能蛋白，在病毒的侵入、復(fù)制、運動、傳播和誘發(fā)癥狀形成等過程均有CP的參與。因此本項目開展RSV CP與植物和

9、介體昆蟲相互作用的研究，通過此項工作深入了解CP在病毒的致病及傳播過程中所起的作用，同時還可對病毒的侵染機理以及病毒與宿主的相互作用有更深層次的認(rèn)識，也為開展植物抗病毒基因工程的研究和應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。2. 研究內(nèi)容、研究目標(biāo)以及擬解決的關(guān)鍵問題2.1 研究內(nèi)容RSV是跨越動、植物兩界的雙宿主病毒， 病毒可以在灰飛虱體內(nèi)增殖且能夠借助蟲卵傳到后代，也可以在水稻中增值從而引發(fā)水稻條紋葉枯病。因此，本項目從兩個方面來研究RSV 與宿主間的相互作用：一是RSV與植物宿主的相互作用，二是RSV和介體昆蟲宿主的互作。在RSV與植物和昆蟲宿主相互作用的過程中，CP均起重要作用，因此通過CP與宿主間互作的研究可

10、明確CP的功能，也為進一步闡明病毒的侵染機理奠定基礎(chǔ)。 （1）RSV CP與水稻的相互作用本項目采用酵母雙雜交系統(tǒng)來研究RSV CP與植物宿主之間的相互作用，即利用RSV CP從水稻cDNA文庫中篩選與其互作的蛋白。由于水稻的研究開展的比較深入，全基因組序列已經(jīng)測定完成，某些蛋白的功能也已明確，所以易對篩選出的蛋白進行功能分析，從而也可進一步闡明CP在病毒的致病過程所起的作用。利用酵母雙雜交系統(tǒng)研究RSV CP與水稻宿主間的互作主要包括以下幾個步驟： 水稻cDNA文庫的構(gòu)建要篩選與RSV CP互作的蛋白就要首先建立水稻cDNA文庫。水稻條紋葉枯病發(fā)生程度在不同水稻品種之間的差異較大,一般糯稻發(fā)

11、病重于粳稻，秈稻發(fā)病最輕。我們選用對RSV比較敏感、發(fā)病程度較重的糯稻葉片作為構(gòu)建水稻cDNA文庫的材料。首先提取葉片總RNA, 分離mRNA，然后合成cDNA第一鏈和其互補鏈，最后連接到酵母雙雜交的獵物質(zhì)粒上，構(gòu)建成了水稻的酵母雙雜交cDNA文庫。 從水稻cDNA文庫中篩選與RSV CP互作的蛋白提取RSV基因組核酸，根據(jù)已發(fā)表的RSV基因組序列設(shè)計引物擴增cp基因，連接入酵母雙雜交系統(tǒng)的誘餌質(zhì)粒上。然后將誘餌質(zhì)粒和獵物質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化酵母，篩選相互作用的蛋白。由于可能出現(xiàn)假陽性的結(jié)果，因此我們用其它研究蛋白互作的方法來進一步驗證篩選出的互作蛋白，如免疫共沉淀、GST-pull down等。 互作

12、蛋白的功能分析酵母雙雜交得到的陽性克隆子質(zhì)粒經(jīng)過DNA測序，通過與NCBI數(shù)據(jù)庫中，分析篩選出的其它序列比對分析基因的功能。如果是數(shù)據(jù)庫功能未知的基因，首先要對基因編碼的蛋白進行細(xì)胞定位，然后做進一步的功能研究，另外對篩選出的蛋白進行亞細(xì)胞定位也可為明確RSV CP的作用位點奠定基礎(chǔ)。 （2）RSV CP與昆蟲細(xì)胞的相互作用在植物病毒與介體昆蟲相互作用方面研究比較多的是馬鈴薯Y病毒屬（Potyvirus）的病毒。Potyvirus屬病毒是通過蚜蟲以非持久的方式傳播的, Potyvirus能被蚜蟲傳播除了需要病毒的外殼蛋白外,還需要蚜傳輔助因子(Helper component proteina

13、se, HC-Pro)。HC-Pro是一種非結(jié)構(gòu)蛋白，其一端與病毒的CP互作，一端與蚜蟲結(jié)合，在蚜蟲口針與CP之間起橋聯(lián)作用。輔助組分必須在獲毒過程中或之前被蚜蟲獲得，這種輔助成分在非持久性和半持久性傳播的大部分植物病毒中存在14。 對于持久、增殖性方式傳播的植物病毒研究較少，近兩年對水稻矮縮病毒（Rice dwarf virus, RDV）的研究取得了一些進展。RDV經(jīng)葉蟬以持久的增殖性的方式傳播，其病毒粒子由外、中、內(nèi)三層衣殼組成，無包膜。研究表明RDV的其中一個衣殼蛋白P2是蟲媒傳染的關(guān)鍵蛋白，P2蛋白與包膜動物病毒編碼的膜融合蛋白具有相同的結(jié)構(gòu)特征。當(dāng)RDV  P2蛋白被表達

14、出來，并出現(xiàn)在草地貪夜蛾(Spodoptera  frugiperda)  細(xì)胞表面時，這種蛋白就會在低pH值下誘導(dǎo)膜融合。說明RDV P2和包膜病毒糖蛋白一樣具有膜融合的功能15。關(guān)于纖細(xì)病毒與介體互作的分子基礎(chǔ)知之甚少。序列分析表明，RSV vcRNA2編碼的NSvc2蛋白與番茄斑萎病毒屬（Tospovirus）病毒膜糖蛋白前體的氨基酸序列之間有相似性，推測NSvc2為病毒的膜糖蛋白。Tospovirus病毒粒子外有包膜糖蛋白，然而迄今未發(fā)現(xiàn)RSV病毒粒體的包膜，RSV病毒粒體僅含一種外殼蛋白，CP的氨基酸序列分析結(jié)果表明其不具備膜糖蛋白的特征。那么NSvc2蛋白和CP

15、蛋白在RSV與昆蟲介體的互作過程中各起什么作用呢？RSV NSvc2是否和其它的膜糖蛋白一樣具有膜融合的功能呢？在病毒經(jīng)昆蟲介體傳播的過程中是否也像PVY病毒一樣需要一種非結(jié)構(gòu)蛋白作為輔助因子，這種輔助蛋白是否就是NSvc2蛋白呢？所有這些問題答案還未知。因此本項目著重研究CP和 NSvc2蛋白在病毒侵染過程中所起的作用，從而逐步闡明病毒侵染介體昆蟲的機制，為該病毒防治奠定基礎(chǔ)。本項目擬從以下幾個方面來初步研究RSV與昆蟲細(xì)胞的相互作用：病毒通過介體昆蟲的傳播需要哪些蛋白參與；RSV NSvc2蛋白和CP是否具有膜融合功能；CP和NSvc2蛋白之間的相互作用。 參與介體昆蟲傳播的病毒蛋白利用桿

16、狀病毒表達系統(tǒng)表達RSV的NSvc2蛋白，制備抗體，先檢測提純的RSV病毒粒子是否含有NSvc2蛋白。實驗分兩組：一組只用提純的RSV病毒粒子喂飼灰飛虱；另一組將病毒粒子和桿狀病毒表達的NSvc2蛋白混合后喂飼灰飛虱，然后PCR檢測灰飛虱體內(nèi)有沒有RSV的存在，分析NSvc2蛋白是否是介體傳毒的必需蛋白。 CP和NSvc2蛋白之間的相互作用。如果RSV 像Potyvirus屬病毒一樣需要輔助因子的話，那么輔助因子可能和病毒的衣殼蛋白互作，從而引導(dǎo)病毒粒子進入昆蟲細(xì)胞。為了驗證這一點，我們利用酵母雙雜交系統(tǒng)來研究CP和NSvc2蛋白之間是否互作，如果有的話，通過缺失突變來確定作用位點。 CP和N

17、Svc2蛋白膜融合功能的研究根據(jù)序列分析的結(jié)果推測 RSV NSvc2蛋白為病毒的膜糖蛋白，這只是推測，是否具有這種功能還需要實驗來驗證。我們分別將編碼CP、NSvc2蛋白的基因插入編碼桿狀病毒膜蛋白gp64信號肽和編碼皰疹性口炎病毒(VSV)G蛋白跨膜結(jié)構(gòu)域的基因序列之間,轉(zhuǎn)染草地貪夜蛾sf9細(xì)胞,使目的蛋白表達并呈現(xiàn)在sf9細(xì)胞的膜表面。然后用倒置顯微鏡觀察細(xì)胞融合的情況，從而判斷CP、NSvc2蛋白是否具有膜融合的功能。2.2 研究目標(biāo)（1） 篩選出與RSV CP互作的植物宿主蛋白（2） 探明RSV CP在病毒致病過程中的作用（3） 初步闡明RSV侵染昆蟲細(xì)胞的的機理2.3 擬解決的關(guān)鍵

18、科學(xué)問題（1） RSV CP的功能（2） 闡明RSV的致病機理（3） 初步探明RSV通過介體傳播的機制3. 擬采取的研究方法及可行性分析3.1 RSV CP 與水稻互作研究的路線圖構(gòu)建誘餌質(zhì)粒構(gòu)建獵物質(zhì)粒擴增RSV cp基因構(gòu)建水稻葉片cDNA文庫共轉(zhuǎn)化酵母細(xì)胞篩選與RSV CP互作的蛋白與NCBI庫中基因序列比對，推測互作蛋白的功能序列測定？互作蛋白的細(xì)胞定位進一步功能研究 圖2. RSV CP與水稻互作研究的路線圖3.2 主要研究方法(1) 水稻酵母雙雜交cDNA文庫的構(gòu)建cDNA文庫是指細(xì)胞全部mRNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA并被克隆的總和，代表生物的某一特定器官或特定發(fā)育時期細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄水平上的

19、基因的群體，并不能包括該生物的全部基因。cDNA文庫構(gòu)建步驟主要為：細(xì)胞總RNA的提取和mRNA的分離；第一鏈cDNA合成；第二鏈cDNA合成；雙鏈cDNA克隆連接載體質(zhì)粒并導(dǎo)入宿主菌中繁殖。cDNA文庫構(gòu)建的實驗流程圖如圖3所示。組織總RNA提取mRNA分離Oligo(dT)引導(dǎo)合成cDNA第一鏈置換合成法合成cDNA第二鏈連接接頭載體質(zhì)粒提取質(zhì)粒酶切消化DNA與載體連接轉(zhuǎn)化大腸桿菌鑒定文庫的克隆數(shù)和特性篩選出所需的克隆擴增后供長期儲存 圖3. cDNA文庫構(gòu)建的實驗流程圖(2) 利用酵母雙雜交系統(tǒng)從水稻葉片cDNA文庫中篩選互作的蛋白真核基因表達時，轉(zhuǎn)錄因子（蛋白質(zhì)）必須同基因上游的特異性

20、序列結(jié)合才能激活RNA 聚合酶將基因拷貝成RNA。轉(zhuǎn)錄因子有兩個重要的功能區(qū)域。一個負(fù)責(zé)與啟動子上游的調(diào)控序列結(jié)合，另一個負(fù)責(zé)轉(zhuǎn)錄過程的激活。在酵母雙雜交體系中，編碼這兩個結(jié)構(gòu)域的DNA片斷分別被構(gòu)建在兩個獨立的表達載體上，一個表達載體包含轉(zhuǎn)錄因子的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域基因片段與待研究的抑制蛋白質(zhì)編碼序列形成的融合基因，另一個表達載體包含轉(zhuǎn)錄因子激活結(jié)構(gòu)域與許多未知的cDNA連接形成的融合基因。這兩種表達載體共處于同一酵母細(xì)胞時將表達產(chǎn)生兩種融合蛋白。如果與DNA結(jié)合區(qū)域融合的蛋白質(zhì)同與激活區(qū)域融合的蛋白質(zhì)之間存在互作關(guān)系便會形成復(fù)合體，可以啟動報告基因的表達過程。酵母雙雜交系統(tǒng)的原理和實驗流程分

21、別如圖4和圖5所示。 圖4. 酵母雙雜交系統(tǒng)原理圖 圖5. 酵母雙雜交的基本實驗過程(3) 蛋白的亞細(xì)胞定位研究研究蛋白在細(xì)胞中的定位首先可根據(jù)用生物信息學(xué)軟件預(yù)測該蛋白在細(xì)胞內(nèi)的定位,但是這種預(yù)測結(jié)果不是結(jié)論性的,需要實驗來驗證。綠色熒光蛋白(GFP)是一種發(fā)光蛋白，其編碼基因gfp作為一種新穎的非酶性標(biāo)記基因具有許多優(yōu)點：檢測方便, 只需要熒光顯微鏡或激發(fā)光源; 材料無需前處理, 可以活體檢測; 無需任何底物或輔助因子; 對細(xì)胞本身幾乎無毒; 植物本身不含有GFP,不會出現(xiàn)假陽性; 由于GFP分子量較小, 不影響與其融合的蛋白的生物學(xué)活性, 所以GFP在研究蛋白的亞細(xì)胞定位方面是一個很好的

22、工具。本課題中將GFP用于目的蛋白的亞細(xì)胞定位研究，將GFP編碼序列融合到目的基因的編碼序列的5端或3端，然后連接入植物表達載體，轉(zhuǎn)化水稻原生質(zhì)體或轉(zhuǎn)化植株，用激光共聚焦顯微鏡對細(xì)胞進行激光斷層掃描以采集細(xì)胞內(nèi)綠色熒光的分布信號，并用計算機軟件進行成像處理，最后獲得目的蛋白在細(xì)胞內(nèi)的定位信息。（4） 桿狀病毒表達載體的構(gòu)建及蛋白的表達利用桿狀病毒表達系統(tǒng)研究目的蛋白的膜融合功能參照Zhou等所采用的方法15。gp64蛋白是桿狀病毒的囊膜糖蛋白，可誘導(dǎo)相鄰細(xì)胞間的膜融合，從而使成熟的病毒粒子從一個細(xì)胞感染另一細(xì)胞。gp64的信號肽具有跨膜的功能，可以使其攜帶的蛋白穿過細(xì)胞膜分泌到細(xì)胞外。皰疹性口

23、炎病毒（VSV）的G蛋白也是囊膜糖蛋白，其跨膜結(jié)構(gòu)域可使與其相連的肽錨定于膜上。我們將NSvc2蛋白前端連接gp64的信號肽序列，后端連接VSV G蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)域， gp64的信號肽可以引導(dǎo)NSvc2蛋白穿過細(xì)胞膜，而后端連接的VSV G蛋白跨膜結(jié)構(gòu)域又可使其后端固定于細(xì)胞膜膜上，這樣NSvc2蛋白便成功展現(xiàn)在了昆蟲細(xì)胞膜上，以利于研究其膜融合的功能（如圖6所示）。gp64 spCP/NSvc2VSV G tm圖6. 構(gòu)建CP或NSvc2蛋白的細(xì)胞膜錨定載體將上述構(gòu)建好的供體質(zhì)粒轉(zhuǎn)入含有Bacmid的大腸桿菌,通過轉(zhuǎn)座使外源基因插入到Bacmid中，然后提取質(zhì)粒，PCR鑒定是否含有插入的外源

24、基因。隨后將鑒定好的含有目的基因的Bacmid轉(zhuǎn)染昆蟲細(xì)胞sf9,使其在昆蟲細(xì)胞中表達。一定時間后收集細(xì)胞，提取蛋白，Western Blot檢測目的蛋白的表達情況（如圖7所示）。（5） 蛋白膜融合功能的研究方法我們用熒光免疫方法檢測目的蛋白是否呈現(xiàn)在了昆蟲細(xì)胞的膜上。重組病毒感染sf9細(xì)胞一定時間后收集感染的細(xì)胞，加入制備的RSV CP或NSvc2蛋白的抗體，結(jié)合后洗幾次再加入連接有TRITC的二抗，激光共聚焦顯微鏡下觀察目的蛋白在細(xì)胞膜表面的表達。TRITC為四甲基異硫酸羅丹明，是一種熒光素，激發(fā)后出現(xiàn)橙紅色熒光。若目的蛋白表達后呈現(xiàn)在細(xì)胞膜的表面則在激光共聚焦顯微鏡下細(xì)胞的表面出現(xiàn)橙紅色

25、熒光。觀察膜融合的方法：因為在低pH條件下才能發(fā)生膜融合，所以收集感染后一定時間的細(xì)胞先在低pH條件下（pH5.0）培養(yǎng)2分鐘，然后轉(zhuǎn)入正常pH條件下（pH6.2）培養(yǎng),一定時間后倒置顯微鏡下觀察合胞體形成情況,從而判斷細(xì)胞是否發(fā)生了融合。整個實驗過程見圖8。Western Blot檢測目的蛋白的表達擴增cp基因片段擴增編碼gp64 sp的片段連接形成gp64 -cp擴增VSV tm連接形成gp64-cp-VSV tm供體質(zhì)粒pFastBac連接形成pFastBac-cp轉(zhuǎn)入含Bacmid的大腸桿菌篩選,PCR鑒定提取Bacmid質(zhì)粒,轉(zhuǎn)染昆蟲sf9細(xì)胞加入抗CP的一抗加入耦聯(lián)有TRITC的二

26、抗收集細(xì)胞，低pH條件下誘導(dǎo)融合激光共聚焦顯微鏡檢測目的蛋白在膜表面的表達幾分鐘后轉(zhuǎn)到正常pH下培養(yǎng)顯微鏡下觀察細(xì)胞融合圖8. 研究CP蛋白的膜融合功能的路線圖 圖7.利用桿狀病毒表達系統(tǒng)表達外源蛋白的基本實驗過程4. 本研究的特色及創(chuàng)新之處（1） 本項目首先開展了RSV病毒與植物宿主相互作用研究，通過此項研究工作為初步闡明病毒的致病機理奠定基礎(chǔ)。（2） 本項目初次進行了RSV侵染昆蟲機理的研究工作，在分析RSV蛋白功能結(jié)構(gòu)域和其它病毒侵染的機理的基礎(chǔ)上，我們進行了大膽的假設(shè)，并想通過實驗驗證這一假設(shè)。本項工作的開創(chuàng)性很強，對于進一步闡明該病毒的侵染機理有重要的推動作用。（3） 本項目在研究病

27、毒與昆蟲細(xì)胞互作時借用了桿狀病毒表達載體和昆蟲細(xì)胞sf9將待研究蛋白呈現(xiàn)在了昆蟲細(xì)胞的膜上，運用此種方法十分清晰明了的顯示蛋白的膜融合功能。5. 年度研究計劃及預(yù)期研究成果（1） 年度研究計劃研究工作預(yù)定三年完成，基本所有工作都可以全年進行，不受季節(jié)限制。第一年， 著重研究RSV CP與水稻的相互作用構(gòu)建水稻的cDNA文庫，利用CP從水稻cDNA文庫中釣出與之互作的蛋白，然后利用其它方法驗證蛋白間的相互作用。同時也進行RSV CP與NSvc2蛋白間互作的研究工作。第二年， 對水稻cDNA文庫中與CP互作的蛋白進行功能分析對互作的蛋白進行功能分析，亞細(xì)胞定位。第三年， 研究RSV侵染昆蟲細(xì)胞機制

28、分別構(gòu)建CP、NSvc2的桿狀病毒表達載體，轉(zhuǎn)染昆蟲細(xì)胞，研究目的蛋白的膜融合功能。（2） 預(yù)期研究成果 構(gòu)建好水稻cDNA文庫; 探明RSV CP與水稻互作的位點以及其在病毒致病過程中作用; 初步闡明RSV侵染介體昆蟲的機制。6. 主要參考文獻目錄1 吳書俊，鐘環(huán)，左慧等.水稻條紋病毒分子生物學(xué)與抗病毒基因工程研究進展.江西農(nóng)業(yè)學(xué)報，2006，18（4）：7277. 2 Toriyama S, Takahashi M, Sano Y, et al. Nucleotide sequence of RNA1, the largest genomic segment of rice stripe

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