植物線粒體基因轉(zhuǎn)錄水平表達(dá)研究方法的建立_圖文

1、應(yīng)用與環(huán)境生物學(xué)報(bào)2006,12(1:128130C h in J A ppl Environ B iol=ISSN10062687X2006202225植物線粒體基因轉(zhuǎn)錄水平表達(dá)研究方法的建立3裴雁曦1,233郝建平1陳竹君3曹家樹3馬文麗1劉曉輝1,2范三紅1陳學(xué)軍4(1山西大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院;2山西大學(xué)生物技術(shù)研究所太原030006(3浙江大學(xué)農(nóng)業(yè)與生物技術(shù)學(xué)院杭州310029;4云南煙草科學(xué)研究所生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室昆明650106摘要以莖瘤芥雄性不育系為材料,在已有文獻(xiàn)的基礎(chǔ)上,對(duì)常規(guī)方法進(jìn)行改進(jìn),使植物線粒體分離、線粒體切片觀察、線粒體RNA提取、反轉(zhuǎn)錄方法、PCR擴(kuò)增、nort

2、hern雜交等方法系統(tǒng)化,建立了一整套比較有效的適合于植物線粒體基因轉(zhuǎn)錄水平表達(dá)分析的方法.圖4參12關(guān)鍵詞植物線粒體;RNA;反轉(zhuǎn)錄;植物胞質(zhì)雄性不育性CLCQ343.3Est ablish m en t of Systema ti ca l M ethods for Tran scr i pti ona l Expressi oni n Pl an t M itochondr i a3PE I Yanxi1,233,HAO J ianp ing1,CHEN Zhujun3,CAO J iashu3,MA W enli1,L I U Xiaohui1,2,F AN Sanhong1&

3、CHE N Xuejun4(1College of L ife Sciences and Technology,2Institute of B iotechnology,Shanxi U niversity,Taiyuan030006,China(3College of Agriculture and B iotechnology,Zhejiang U niversity,Hangzhou310029,China(4Key L ab of B iotechnology,Acade m y of Yunnan Tobacco Science,Kunm ing650106,ChinaAbstrac

4、tU sing tuber mustard cyt op las m ic male sterile line as study material,r outine methods f or transcri p ti onal exp ressi on research were modified and i m p r oved based on the existing infor mati on.The methods f or p lant m it ochodria is olati on,RNA ex2 tracti on,reverse transcri p ti on,PCR

5、 and Northern bl ot were combined systematically,and those methods were all app lied t o study gene transcri p ti onal exp ressi on in p lant m it ochondria.Fig4,Ref12Keywordsp lant m it ochondria;RNA;reverse transcri p ti on;cyt op las m ic male sterileCLCQ343.3植物胞質(zhì)雄性不育性(C M S是自然界較普遍的現(xiàn)象,是遺傳學(xué)理論研究的一個(gè)

6、重要課題.C MS的母性遺傳現(xiàn)象,使人們很自然地將線粒體和葉綠體兩種細(xì)胞器聯(lián)系起來(lái).目前一般認(rèn)為,線粒體的變異是進(jìn)行相關(guān)研究的前提1,2.對(duì)植物線粒體進(jìn)行分子水平研究也成為揭開這一自然之謎的重要途徑.進(jìn)行這一領(lǐng)域的研究,必然涉及到植物線粒體分離、線粒體RNA 提取、線粒體RNA反轉(zhuǎn)錄、雜交等一系列方法.線粒體分子水平分析有其特殊性,不能完全照搬植物核基因的研究方法.完整高質(zhì)量植物線粒體的分離比較困難,相繼有一些報(bào)道36;基于線粒體純化的瓶頸,線粒體RNA的提取也相當(dāng)困難,文獻(xiàn)報(bào)道較少7.提取RNA常用的方法有鹽酸胍法、硫氰酸胍法、蛋白酶K法及酸性苯酚法等8,市售常見有效的試劑盒有Tr2 izo

7、l (Gibco2BRL和RNAgents(Pr omega等.但這些方法一般針對(duì)不同實(shí)驗(yàn)?zāi)康幕蚴瞧胀ú牧?沒有系統(tǒng)化優(yōu)化,不能簡(jiǎn)單組合用來(lái)進(jìn)行植物線粒體分子水平研究.因此,這些實(shí)驗(yàn)方法需要系統(tǒng)改進(jìn)后有機(jī)地組合,以提高研究效率.1材料與方法收稿日期:2004212215接受日期:20052032173國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No.30571195Supported by the Na2 ti onal Natural Science Foundati on of China33通訊作者Corres ponding author(E2mail:peiyanxi1.1植物材料莖瘤芥種子常規(guī)表面消

8、毒處理后在培養(yǎng)皿中26條件下暗培養(yǎng)710d,取黃花苗供試.1.2試劑總RNA抽提液Trizol 反轉(zhuǎn)錄試劑盒、Superscri p t T M購(gòu)于Gibico/BRL公司;Taq2DNA聚合酶、瓊脂糖、d NTPs、6N隨機(jī)引物購(gòu)自上海生工公司.232P2d ATP購(gòu)自北京亞輝生物醫(yī)學(xué)工程公司;尼龍膜購(gòu)于M I L L I P ORE公司;特異引物由上海生工公司合成.1.3莖瘤芥不同發(fā)育時(shí)期線粒體純化觀察在Ke mble RJ4基礎(chǔ)上優(yōu)化線粒體提取方法(已另文發(fā)表9.若要用于線粒體基因表達(dá)分析需用無(wú)RNase的DNase I處理后進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn);線粒體電鏡觀察主要參考文獻(xiàn)3的方法,并作了必要的

9、改進(jìn),方法如下:線粒體沉淀用固定液(2%戊二醛,400mmol/L的蔗糖l00 mmol/L NaH2P O4,pH7.4,懸浮后固定l h.經(jīng)17000g離心5 m in后,沉淀用清洗液(400mmol/L的蔗糖,100mmol/L NaH2P O4,pH7.4輕輕懸浮,再經(jīng)17000g,離心5m in,反復(fù)洗3次.經(jīng)上述處理的線粒體沉淀加入1%的瓊脂糖進(jìn)行包埋,凝固成塊后.放入1%的鋨酸固定2h,再經(jīng)濃度為50%、70%、80%、85%、90%、100%的乙醇和丙酮各脫水10m in .處理后的材料依次在丙酮¬Epon812為3¬1和2¬1的樹脂中包埋1h 和

10、2h;最后在Epon812樹脂中包埋過夜,做超薄切片,并在JE M 21200EX,H 2600透射電鏡下觀察并照相.線粒體RNA 抽提按照Trizol 試劑盒說(shuō)明書要求操作,最后溶解階段渦旋器振蕩12h .甲醛變性凝膠電泳檢測(cè).1.4線粒體RNA 的分離和反轉(zhuǎn)錄取RNA 反轉(zhuǎn)錄,流程為100ng L -1的O ligo d (T 2L,100ng L -1的6N 隨機(jī)引物3L 、RNA 5L (約200ng ,75水浴5m in;加入5×RT 緩沖液6L,0.1mol L -1DTT 3L,20n mol L -1d NTPs 3L,2L MMLV (200U /L ,RNasin

11、 1L,6L DEPC 2H 2O 混合后總體積30L,42溫浴2h,65滅活.反轉(zhuǎn)錄過程中反應(yīng)體系中添加O ligo d (T 和6N 隨機(jī)引物.1.5c DNA 模板的特異基因PCR 擴(kuò)增上述c DNA 5L 作模板進(jìn)行莖瘤芥胞質(zhì)雄性不育相關(guān)T基因10片段PCR 擴(kuò)增.擴(kuò)增條件為945m in;9430s,5845s,7290s,38個(gè)循環(huán);7210m in .引物為P1×P2,P1×P3,應(yīng)分別擴(kuò)增出大小約1170bp 和830bp 的片段.1.6Northern 分析以T 基因830bp 片段為探針,對(duì)莖瘤芥線粒體RNA 進(jìn)行Northern 雜交分析.探針標(biāo)記和N

12、orthern 雜交方法參照文獻(xiàn)8方法.Typhone 8600掃描儀掃描雜交信號(hào).2結(jié)果與分析2.1莖瘤芥線粒體RNA 的提取莖瘤芥C MS 系線粒體電鏡照片(圖1表明,線粒體完整,破碎少,可以進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn).線粒體RNA 提取后電泳檢測(cè)(圖2 .圖1莖瘤芥線粒體的電鏡照片F(xiàn)ig .1Electr on m icr oscr op ic phot o of m it ochondria in tuber mustard圖2莖瘤芥C MS 系線粒體RNAFig .2M it ochondrial RNA of tuber m istard C MS line2.2RT 2PCR 擴(kuò)增莖瘤芥C M

13、S 系線粒體RNA,以O(shè) ligo d (T 引物和適量6N 隨機(jī)引物反轉(zhuǎn)錄.以反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板,以P1×P2引物擴(kuò)增出約1170bp 片段,以P1×P3引物擴(kuò)增出約830bp 片段(圖3,符合預(yù)期.表明從線粒體分離到RT 2PCR 擴(kuò)增的一系列改進(jìn)后的方法,適合于此類型實(shí)驗(yàn) .圖3以不同引物組合對(duì)線粒體c DNA 模板進(jìn)行擴(kuò)增的結(jié)果Fig .3Result of amp lificati on using m icochondrial c DNA aste mp late by different p ri m er pairs1:P1×P2引物擴(kuò)增1170bp

14、 產(chǎn)物;2:P1×P3引物擴(kuò)增830bp 產(chǎn)物1:PCR p r oduct,1170bp,using P1×P2as p ri m er pair;2:PCR p r oduct,830bp,using P1×P3as p ri m er pair2.3T 基因和線粒體RNA 的Northern 雜交分析以T 基因?yàn)樘结?與莖瘤芥線粒體RNA 進(jìn)行Northern bl ot分析(圖4.雜交結(jié)果可見,雜交信號(hào)清晰,特異性強(qiáng),表明RNA 質(zhì)量好,實(shí)驗(yàn)方法可行 .圖4C MS 系線粒體RNA 的Northern 分析Fig .4Northern bl ot anal

15、ysis of C MS m it ochondrial RNA3討論由于在線粒體研究中常常使用黃化苗為材料,相對(duì)來(lái)說(shuō),材料來(lái)源少.對(duì)于那些可以進(jìn)行自花授粉的胞質(zhì)雄性不育系植物來(lái)說(shuō),要通過人工去雄、保持系異花人工授粉、套袋留種等繁瑣工序,且結(jié)實(shí)率相對(duì)較低,種子產(chǎn)量低,這就使得通過種子獲得的黃化苗材料更加珍貴.因而在系統(tǒng)穩(wěn)定情況下,嚴(yán)格按照本程序提取線粒體后可不進(jìn)行電鏡觀察;提取RNA 后,也不需電泳檢測(cè)而直接進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄,后續(xù)實(shí)驗(yàn)都會(huì)得到較為滿意的結(jié)果,同時(shí)也節(jié)省了大量寶貴不育系種子.在本實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)中,線粒體提純后,用Dnase I 處理去除核基因影響時(shí),一定要使用無(wú)Rnase 的Dnase I

16、;RNA 提取時(shí)最后用TE 緩沖液(DEPC 水配制溶解時(shí),渦旋約12h,可以提高RNA 產(chǎn)量數(shù)倍.克服了常規(guī)操作常常遇到的RNA 產(chǎn)量低,無(wú)法或很難進(jìn)行多個(gè)平行實(shí)驗(yàn)的困難,有利于后續(xù)實(shí)驗(yàn)順利進(jìn)行.線粒體基因組是植物細(xì)胞遺傳物質(zhì)中重要的組成部分,和核基因組相比有許多特點(diǎn).線粒體mRNA 大部分類似原核基因,不具有poly (A 尾,但是也有植物線粒體成熟mRNA 具有poly (A 尾的報(bào)道11,12.本研究在線粒體RNA 反轉(zhuǎn)錄過程中,采用O ligo d (T 引物和6N 隨機(jī)引物混合使用的方法,既保證了具有多腺化尾轉(zhuǎn)錄本的反轉(zhuǎn)錄完整性,也兼顧到未多腺化加工的轉(zhuǎn)錄本,盡量全面地保留線粒體基

17、因組轉(zhuǎn)錄后的RNA 信9211期裴雁曦等:植物線粒體基因轉(zhuǎn)錄水平表達(dá)研究方法的建立息.我們使用這一實(shí)驗(yàn)系統(tǒng),在莖瘤芥胞質(zhì)雄性不育性相關(guān)T 基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)研究中得到較為滿意的結(jié)果10.而嘗試僅用隨機(jī)引物進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄線粒體RNA并擴(kuò)增莖瘤芥T基因,結(jié)果沒有任何特異性擴(kuò)增.一方面表明該基因轉(zhuǎn)錄后具有多腺化尾,同時(shí)也可以證明O ligo d(T和6N隨機(jī)引物混合使用可以相對(duì)完整地獲得線粒體基因轉(zhuǎn)錄后遺傳信息,減少了植物線粒體轉(zhuǎn)錄水平研究中一些有價(jià)值基因信息的丟失和研究的誤差.References1Abad AR,Mehrtens BJ,Mackenzie S A.Specific exp ressi o

18、n in rep r o2 ductive tissues and fate of a m it ochondrial sterility2ass ociated p r otein in cyt op las m ic male sterile bean.Plant Cell,1995,7:271852Bonhomme S,Budar F,Lancelin D.Sequences and transcri p t analysis of the Nco Ogura2s pecific frag ment are correlated with cyt op las m ic male ste

19、rility in B rassica hybrids.M ol Gen Genet,1992,235:340483Paras ons DF,BonnerWD,Verboon JG.Electr on m icr oscopy of is olated p lant m it ochondrial and using both the thin2secti on and negative2staining techniques.Cana J B ot,1965,43:6476554Ke mble RJ.A radid,single leaf nucleic acid assay f or de

20、ter m ining the cyt op las m ic organelle comp le ment of rapeseed and related brassica s pe2 cies.Theor A ppl Genet,1987,73:3643705M ignouna H,Ver m in SS,B riquetM.M it ochondrial DNA modificati ons ass ociated with cyt op las m ic male sterility in rice.Thero A ppl Genet,1987,74:6666696Leaver CJ,

21、Hack E,Forde BG.Pr otein synthesis by is olated p lant m it o2 chondria.M eth Enzym ol,1983,97:4764847Jean2Claude Farré,A lejandr o A raya.RNA s p licing in higher p lantm it o2 chondria:deter m inati on of functi onal ele ments in gr oup II intr on fr om a chi m eric cox II gene in electr oporated wheat m it ochondria.Plant J, 2002,29(2:2032108Sa mbr ook J,Fritsch EF,Maniatis T.Molecular Cl oning.New York: Cold Sp ring Harbor Laborat ory Press,19899Chen XJ(陳學(xué)軍,Chen ZJ(陳竹君,Zhang YZ