春夏兩季楊梅樹(shù)葉部精油成分及抗氧化活性比較

1、春夏兩季楊梅樹(shù)葉部精油成分及抗氧化活性比較                   作者：鐘瑞敏，張振明，肖仔君，王羽梅，曾慶孝 【摘要】  目的探討不同季節(jié)烏楊梅葉部精油成分與抗氧化活性的差異。方法采用gc-ms聯(lián)用技術(shù)結(jié)合kovats保留指數(shù)對(duì)比法分析了春夏兩季烏楊梅鮮葉精油的成分， 運(yùn)用dpph自由基清除法、-胡蘿卜素漂白法和硫代巴比妥酸法對(duì)精油抗氧化活性進(jìn)行了綜合對(duì)比分析。結(jié)果春季精油產(chǎn)量(0.13%)

2、高于夏季(0.05%)，春季精油成分以倍半萜烯含氧衍生物為主(占52.69%)，夏季精油則以倍半萜烯為主(占70.04%)，其中5-羥基白菖烯是變化差異最為顯著的特征成分。春季精油表現(xiàn)出優(yōu)良的脂質(zhì)抗氧化和清除dpph自由基活性，而夏季精油僅表現(xiàn)出有限的脂質(zhì)抗氧化能力。結(jié)論楊梅葉精油產(chǎn)量和品質(zhì)隨季節(jié)而變化, 春夏兩季精油的抗氧化活性差異可能與它們特征組分的相對(duì)含量存在顯著差異有關(guān)。 【關(guān)鍵詞】  烏楊梅; 芳香精油; 季節(jié)變化; 抗氧化活性 楊梅myrica rubra sieb. et zucc.系楊梅科(myricaceae)，是原產(chǎn)于中國(guó)的亞熱帶樹(shù)種，我國(guó)有6個(gè)種1。楊梅可藥食兩

3、用，宋代食療本草和明代本草綱目對(duì)楊梅的藥用功效均有記載。楊梅的枝葉、根、皮在中國(guó)大陸、臺(tái)灣地區(qū)和日本等地常用作收斂劑、解毒劑和腸胃止瀉劑等傳統(tǒng)中藥成分2。二十多年來(lái)，日本和我國(guó)學(xué)者對(duì)楊梅枝葉溶劑萃取物的藥用成分進(jìn)行過(guò)較深入研究，先后分離出楊梅素、單寧、三萜和二芳基庚萜化合物等幾類活性成分36，近年來(lái)還分離得到兩種具有抗腫瘤活性的香豆素衍生物等成分7，8。藥理研究表明楊梅葉甲醇萃取物可治療no、ccl4-和-萘基異硫氰酸酯誘導(dǎo)的肝損傷，50%乙醇萃取物可抑制體內(nèi)黑色素的合成9，10。楊梅屬于芳香植物，近年來(lái)相繼開(kāi)展了針對(duì)不同屬楊梅葉芳香精油的分析和生物活性研究。本作者11，12對(duì)分布于南嶺自然保

4、護(hù)區(qū)內(nèi)烏楊梅樹(shù)不同藥用部位的精油成分及其生物活性也進(jìn)行了系統(tǒng)研究，發(fā)現(xiàn)其具有優(yōu)良的抗氧化和抗食源性致病菌活性，精油特征成分及含量與矮楊梅13、丁岙楊梅14及東魁楊梅15葉部精油存在較大差異。芳香精油的產(chǎn)生與植物的生理和生長(zhǎng)環(huán)境條件高度相關(guān), 同種芳香植物因生長(zhǎng)環(huán)境的差異，精油含量和品質(zhì)差別顯著，而且在不同季節(jié)、不同生長(zhǎng)期、植株的不同部位，精油及其有效成分含量也不同16，17。 本文對(duì)國(guó)內(nèi)南方省份資源豐富的烏楊梅春、夏兩季鮮葉芳香精油進(jìn)行了含量測(cè)定，采用gc-ms聯(lián)用技術(shù)并結(jié)合kovats保留指數(shù)(ki)對(duì)比法對(duì)其成分進(jìn)行了比較鑒定，同時(shí)通過(guò)國(guó)際上普遍采用的3種體外評(píng)價(jià)方法對(duì)其抗氧化活性進(jìn)行了對(duì)

5、比研究，旨在為客觀評(píng)價(jià)其藥用價(jià)值和保護(hù)性開(kāi)發(fā)提供科學(xué)的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。 1 材料與儀器 1.1 材料烏楊梅m. rubra var.astropurea tsen.新鮮枝葉由廣東南嶺國(guó)家自然保護(hù)區(qū)大頂山管理處分別于2006年4月和7月提供，鮮葉均采自同一顆具有15年樹(shù)齡的大樹(shù)，采收后速凍處理待用。品種經(jīng)保護(hù)區(qū)彭華貴工程師與該自然保護(hù)區(qū)標(biāo)本庫(kù)標(biāo)本對(duì)照鑒定。主要試劑包括：c8-c21系列正烷烴(氣相色譜純，中國(guó)醫(yī)藥集團(tuán)，上海)，亞油酸(alfar aesar, 德國(guó))，dpph自由基(2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl) (sigma,美國(guó))，aaph自由基2,2-azobis(

6、2-methylpropionamidine) dihydrochioride ( aldrich，美國(guó))，硫代巴比妥酸(sigma，usa),-胡蘿卜素(sigma，usa)，2,6-二叔丁基對(duì)甲酚(bht)和抗壞血酸均為分析純。 1.2 儀器芳香精油測(cè)定儀(廣州玻璃廠)，氣質(zhì)聯(lián)用儀(finnigan trace /dsq，美國(guó)熱電)，紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(916型，澳大利亞gbc)。 2 方法 2.1 精油提取與含量測(cè)定采用水蒸氣同步蒸餾法提取精油。沸蒸回流3 h。精油用無(wú)水硫酸鈉脫水，過(guò)濾后取適量正已烷溶解稀釋為1×10-3(v/v)濃度用于氣質(zhì)聯(lián)用分析。樣品測(cè)定前均置于-25下

7、貯存。 2.2 氣質(zhì)聯(lián)用分析gc-ms分析采用韶關(guān)學(xué)院實(shí)驗(yàn)中心trace gc/dsq 氣質(zhì)聯(lián)用儀完成。gc條件：色譜柱為db-5石英毛細(xì)管柱，30 m×0.25 mm×0.25 m;載氣為高純氦(99.999%);柱流量1ml·min-1; 不分流進(jìn)樣;進(jìn)樣口溫度220;傳輸線溫度210;進(jìn)樣量1 l。程序升溫，柱溫40(1 min)-10(/min)-200(3 min)。ms條件：電離方式ei，電子能量70 ev，發(fā)射電流100 ma，離子源溫度200，質(zhì)量掃描范圍50-350 m/z，溶劑延遲4 min。c8-c21系列正烷烴均以1×10-3(v

8、/v)濃度用正己烷溶解，與上述gc條件一樣進(jìn)樣測(cè)定。楊梅葉精油被gc分離的各成分用下面的線性升溫公式計(jì)算其ki18：ki = 100n + 100( tx-tn )/( tn+1 - tn)其中tx為測(cè)定物質(zhì)的保留時(shí)間，tn和 tn+1分別為碳原子數(shù)相差為1的正烷烴的保留時(shí)間(tn < tx < tn+1)結(jié)果用隨機(jī)所帶的美國(guó)nist library(2002版)質(zhì)譜庫(kù)檢索，并與相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)ki值18對(duì)比確定，無(wú)標(biāo)準(zhǔn)ki值的組分只用質(zhì)譜庫(kù)檢索結(jié)果確定。相對(duì)含量的確定采用峰面積歸一化法。 2.3 抗氧化性評(píng)價(jià)試驗(yàn) 2.3.1 dpph自由基清除率測(cè)定配制濃度分別為4，8，10，16，24

9、，32 和50 g·l-1的受試樣品甲醇液。分別取200 l與4 ml濃度為6×10-5m dpph甲醇液混合，于517 nm處測(cè)定吸光度，不加樣的dpph甲醇液為空白樣。平行樣為3個(gè)。自由基清除率按下式計(jì)算自由基清除率(%)=(ac(0)?aa(t)/ ac(0)×100%其中ac(0)為t = 0 h時(shí)的空白樣吸光度值;aa(t)為t= 1 h時(shí)樣品吸光度值。 2.3.2 -胡蘿卜素漂白試驗(yàn)法將-胡蘿卜素(0.1 mg)用氯仿(10 ml)于梨形瓶中溶解，加入亞油酸(20 mg)和吐溫40(100 mg)，然后于50旋轉(zhuǎn)真空干燥。加入50 ml含氧蒸餾水，于超

10、聲波中形成乳化液a。取200 l濃度分別為4，8，12，16和20 g·l-1的受試樣品乙醇液與5 ml乳化a液于試管中混合，不加樣品的用等量乙醇代替與a液混合作為空白樣。在50保溫，于470 nm測(cè)定吸光度。平行樣為3個(gè)?？寡趸视孟率接?jì)算抗氧化率(%) = (aa(120) ? ac(120)/( ac(0) ? ac(120)× 100%其中aa(120)為t = 120 min時(shí)的樣品吸度度，ac(120)為t = 120 min時(shí)空白樣吸光度值，ac(0)為t = 0 min時(shí)的空白樣吸光度值。 2.3.3 硫代巴比妥酸法分別取0.1ml濃度為5，25，50 g&

11、#183;l-1的樣品甲醇液與0.5 ml蛋黃乳濁液混合，加入50 l的aaph自由基溶液(0.07mol/l)引發(fā)脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)。隨后即加入1.5 ml乙酸溶液(20%)和1.5 ml濃度為0.8%硫代巴比妥酸液用1.1% (w/v) 十二烷基硫酸鈉溶液配制，振蕩均勻。不加精油樣品的為空白樣。然后于95水浴保持60 min。冷卻后，每個(gè)試管中加入5 ml正丁醇，充分萃取，于1 200 g離心15 min。傾出有機(jī)層在532 nm處測(cè)定吸光度值。平行樣為3個(gè)?？寡趸笖?shù)用下式計(jì)算抗氧化指數(shù)(%) =(ac(0) ? aa(t)/ ac(0)× 100%其中ac(0)為空白樣t = 0

12、 h吸光度值，aa(t)為樣品t = 1 h吸光度值。 2.4 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計(jì)分析采用spss10.0軟件。相同受試濃度水平下各受試物的抗氧化率之間兩兩差異顯著性分析比較用鄧肯氏極差法(p<0.01)。3 結(jié)果 3.1 精油的gc-ms分析采用水蒸氣同步蒸餾法測(cè)得烏楊梅春季鮮葉精油含量為0.13%±0.04% (v/w)、夏季為0.05±0.01%(v/w)。精油均呈檸檬黃色，無(wú)刺激性，相對(duì)密度為0.9280 mg·ml-1。春、夏兩季烏楊梅葉部精油的氣相色譜總離子流圖如圖1所示。分別對(duì)2種精油中相對(duì)含量0.05%的41和36種成分進(jìn)行了鑒

13、定，被鑒定的組分相對(duì)含量總和分別為相應(yīng)精油的97.30%和99.97%。結(jié)果見(jiàn)表1春、夏兩季楊梅葉部精油的化學(xué)組分基本為倍半萜類(分別為92.77%和97.78%)。春季精油以倍半萜烯含氧衍生物為主(占52.69%)，而夏季精油則主要以倍半萜烯為主(占70.04%)。兩季精油中化學(xué)組成沒(méi)有明顯變化，但其主要成分的含量存在較大差異。這種變化主要表現(xiàn)在：夏季精油中的倍半萜烯異石竹烯和石竹烯含量(分別為24.21%和26.47%)比春季精油明顯高得多(分別為10.17%和11.61%)，而大根香葉烯a、-依蘭油烯、-金合歡烯等倍半萜烯成分在兩季節(jié)則變化不大;隨著季節(jié)的更替，5-羥基白菖烯在鮮葉中的含

14、量出現(xiàn)顯著變化，其在春季精油中的含量高達(dá)30.44%，而夏季精油中的含量則僅為1.81%。此外，春、夏兩季精油中均含有較高量的(e)- 橙花叔醇(分別為9.57%和16.65%)。 3.2 精油抗氧化性對(duì)比分析 3.2.1 dpph自由基清除活性dpph自由基清除法可適用于親脂性和親水性質(zhì)子供體的活性檢測(cè)。本研究選用脂溶性的bht、弱脂溶性的pg和水溶性的抗壞血酸3個(gè)強(qiáng)抗氧化劑為參照，對(duì)比了春、夏兩季烏楊梅葉部精油的dpph自由基清除效果。如圖2所示，bht、pg和抗壞血酸均表現(xiàn)極強(qiáng)的dpph自由基清除活性，三者在各受試濃度下的dpph自由基清除率之間不存在顯著差異(p0.01)。本實(shí)驗(yàn)測(cè)定它

15、們的自由基半清除濃度ic50分別為0.014，0.018和0.013 g·l-1?？傮w而言，春、夏兩季烏楊梅葉精油的dpph自由基清除能力均隨受試濃度升高而增強(qiáng)，春季葉部精油自由基清除活性表現(xiàn)優(yōu)良，其ic50約為0.061 g·l-1，而夏季葉部精油dpph清除活性較弱，在本實(shí)驗(yàn)條件下未能測(cè)出自由基半清除濃度，兩季精油的dpph自由基清除能力存在顯著性差異(p<0.01)。dpph自由基是依靠能抗氧化劑提供·h而中和的，作為靈敏的質(zhì)子受體，通過(guò)觀察質(zhì)子供體與其反應(yīng)的速度也能判斷受試物抗氧化活性的強(qiáng)弱。在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中也觀察到，在相同濃度時(shí)春季楊梅葉部精油清除自由

16、基的的反應(yīng)速度比夏季精油反應(yīng)速度快得多。導(dǎo)致這種現(xiàn)象的根本原因可能與5-羥基白菖烯在兩季精油中的含量顯著差異有關(guān)，作者曾測(cè)到從春季烏楊梅葉部精油中分離的5-羥基白菖烯單體具有極強(qiáng)的dpph自由基清除能力12。a-春季樣 b-夏季樣圖1 春、夏兩季楊梅樹(shù)葉部精油氣相色譜總離子流圖 3.2.2 -胡蘿卜素漂白抑制活性-胡蘿卜素漂白試驗(yàn)法主要評(píng)價(jià)的是抗氧化物質(zhì)在乳化脂質(zhì)體系中抑制脂質(zhì)氫過(guò)氧化前期反應(yīng)的能力。圖3為采用-胡蘿卜素漂白試驗(yàn)法測(cè)定的烏楊梅葉部精油與抗氧化劑bht、pg和抗壞血酸的抗氧化效果對(duì)比。在脂質(zhì)體系中醇溶性的bht是公認(rèn)的強(qiáng)抗氧化劑，在本試驗(yàn)條件下，bht再現(xiàn)出極強(qiáng)的抗氧化性，其半抑

17、制濃度ic50約為0.083 g·l-1。值得一提的是作為強(qiáng)抗氧化劑的水溶性抗壞血酸幾乎不顯現(xiàn)其抗氧化活性，而且與濃度無(wú)相關(guān)性，弱水溶性的pg也未能測(cè)出其ic50值，與bht存在極為顯著的差異(p<0.01)。這種現(xiàn)象稱為脂質(zhì)體系中的“極性反?！?polar paradox)，已被許多研究者所證實(shí)19，其原因是由于水溶性極性物質(zhì)在乳化脂質(zhì)體系中主要集中在水相，而脂相中的濃度極低。春、夏兩季楊梅葉部精油在高濃度時(shí)也表現(xiàn)出較好的抑制-胡蘿卜素漂白的活性，它們的ic50分別約為0.177和0.264 g·l-1，不存在顯著性差異(p0.01)。表明它們抑制脂質(zhì)氫過(guò)氧化前期的

18、能力相近，呈現(xiàn)抗氧化能力的成分主要是脂溶性成分，即春季精油中高含量的5-羥基白菖烯、異石竹烯和石竹烯等特征成分，以及夏季精油中高含量的異石竹烯和石竹烯等特征成分是主要的脂質(zhì)抗氧化物質(zhì)。 3.2.3 硫代巴比妥酸法脂質(zhì)抗氧化指數(shù)硫代巴比妥酸法主要衡量的是抗氧化劑清除能導(dǎo)致脂質(zhì)過(guò)氧化的自由基的能力，但同時(shí)也能衡量弱親脂性抗氧化劑的抗氧化能力。如表2所示，樣品的抗氧化指數(shù)均隨受試濃度的升高而上升，但有些抗氧化劑在同一受試濃度的抗氧化指數(shù)之間的差異極為顯著(p<0.01)。采用該法對(duì)極性較大的抗氧化劑pg和抗壞血酸進(jìn)行測(cè)試的結(jié)果與-胡蘿卜素漂白試驗(yàn)法一樣，pg、抗壞血酸與bht的抗氧化指數(shù)存在極

19、為顯著的差異(p<0.01)，也表現(xiàn)出“極性反?！爆F(xiàn)象。春季楊梅葉部精油在受試濃度下與bht的抗脂質(zhì)過(guò)氧化能力不存在極為顯著的差異，尤其是在高濃度下的抗氧化能力接近bht，而夏季楊梅葉部精油與bht的抗氧化能力差異顯著。春夏兩季楊梅葉部精油之間的抗脂質(zhì)過(guò)氧化能力也存在差異，這可能與其化學(xué)組成特征成分的含量差異有關(guān)。表1 春、夏兩季楊梅樹(shù)葉部精油對(duì)比鑒定的成分及其相對(duì)含量 4 結(jié)論 春、夏兩季烏楊梅葉部精油中化學(xué)組成沒(méi)有明顯變化，但精油的產(chǎn)量和組分的相對(duì)含量存在顯著差異。春季烏楊梅葉部精油成分以倍半萜烯含氧衍生物為主，其中5-羥基白菖烯是最主要的特征成分;而夏季精油則以倍半萜烯為主，其中異

20、石竹烯和石竹烯是最主要的特征成分。表明楊梅葉部精油產(chǎn)量和品質(zhì)隨季節(jié)而變化。 總體上春季葉部精油的抗氧化活性明顯優(yōu)于夏季葉部精油。春季精油具有較好的dpph自由基清除能力，在脂質(zhì)體系氧化前期與后期均表現(xiàn)優(yōu)越的抗氧化能力;夏季葉部精油的dpph自由基清除能力較弱，但表現(xiàn)出一定的脂質(zhì)抗氧化能力。春、夏兩季烏楊梅葉部精油的抗氧化能力的差異可能與其特征組分相對(duì)含量存在顯著差異有關(guān)。 【參考文獻(xiàn)】  1 李興軍,呂均良,李三立.中國(guó)楊梅研究進(jìn)展j. 四川農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),1999, 17(2):224.2 matsuda h, morikawa t, and tao j, et al. bioact

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