超聲波提取甘草黃酮及其抑菌活性研究

1、超聲波提取甘草黃酮及其抑菌活性研究    【摘要】  的研究甘草中的黃酮提取方法和抗菌活性。方法利用超聲波技術(shù)通過正交試驗提取甘草中的黃酮，杯碟法對其進(jìn)行抗菌活性的研究。結(jié)果超聲波最佳的提取條件為功率385W，80%乙醇，料液比為115，提取時間為8 min，黃酮提取率為6.23%。該提取液對金色葡萄球菌、枯草桿菌、大腸桿菌、黑曲霉、青霉都有明顯的抑菌效果，最低抑菌濃度分別為：0.062 5,0.062 5,0.031 3,0.15,0.25 mg/ml；最小殺菌濃度為0.25,0.125,0.031 3,0.5,0.25 mg/ml。結(jié)論超聲

2、波技術(shù)是提取甘草黃酮的高效方法，甘草具有較強(qiáng)的抗菌活性。 目 【關(guān)鍵詞】  超聲波提取 甘草 黃酮 抑菌活性Studies on Flavonoids Extraction by Ultrasonic Technology from Glycyrrhiza and their Bacteriostatic ActivityAbstract:ObjectiveTo study on flavonoids extraction from Glycyrrhiza and their bacteriostatic activity. Methods Using ultrasonic tech

3、nology, flavonoids were extracted form Glycyrrhiza by orthogonal experiment, and their bacteriostatic activity were studied by cylinder plate method. Results The optimum extractive conditions for flavonoids were ultrasonic power 385W, ethanol 80%, ratio of solid to liquid 115, extracting time 8 min.

4、 Ultrasonic technology had the highest extraction rate 6.23%. The substance extracted showed some antibiotic activity against Staphylococcus aureus, Bacillus subtil, Escherichia coli, Aspergillus niger, penicillium, the minimum inhibitory concentration (MIC) was 0.0625, 0.0625, 0.0313, 0.125, 0.25 m

5、g/ml, and minimum bactericidal concentrations (MBC) was 0.25, 0.125, 0.0313, 0.25, 0.5 mg/ml respectively.Conclusion Ultrasonic technology is an effective method for extracting flavonoids from Glycyrrhiza, which showed strong antibiotic activity.Key words:Ultrasonic extraction；  Glycyrrhiza；

6、60; Flavonoids；  Bacteriostatic activity     甘草是豆科甘草屬植物干燥的根和根莖，是臨床上最常用的中藥材之一1。近年來，對甘草黃酮化合物的研究引起了人們的關(guān)注。據(jù)報道，甘草黃酮是一類生物活性較強(qiáng)的天然產(chǎn)物，具有抗菌、抗氧化、抗心率失常、抗腫瘤、降血脂、保肝等作用2，3，超聲波具有加速藥材中有效成分溶解、縮短提取時間、提高有效成分的提取率等優(yōu)點4，因此，本文通過正交實驗探討超聲波提取甘草黃酮的最佳提取條件，為大規(guī)模高效生產(chǎn)甘草黃酮提供了有力的理論依據(jù)。甘草黃酮的體外抗菌的研究較少，本實驗對最佳提取條件下

7、的黃酮提取液對一些細(xì)菌和真菌進(jìn)行了抑菌試驗，旨在能開發(fā)一種天然的抑菌劑，并為臨床用藥提供理論依據(jù)。1  材料與方法1.1  材料甘草：購于湖南長沙康爾佳藥店，粉碎過40目篩，80烘干備用。    蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品：購于中國上海醫(yī)藥化學(xué)試劑公司    供試菌種：金色葡萄球菌、枯草桿菌、大腸桿菌、黑曲霉、青霉由本實驗室保存并培養(yǎng)。1.2   方法1.2.1  超聲波提取法稱取甘草粉10 g，采用L9（34）按表1方法進(jìn)行超聲波提取，提取液過濾，合并濾液，定容至100 ml，搖勻備用。1.2.2&

8、#160; 對比實驗    煎煮法：稱取甘草粉10g，加水200 ml，浸泡30 min，煮沸后，文火煎60 min，過濾，共煎煮兩次，合并濾液，定容至100 ml，搖勻備用。    連續(xù)回流提取法：稱取甘草粉10 g，加80%乙醇200 ml，水浴回流80 min，過濾，共提取兩次，合并濾液，定容至100 ml，搖勻備用。表1  因素水平表（略）1.2.3  標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作稱取在105下干燥恒重的蘆丁對照品10 mg，用95%的乙醇溶解，搖勻，定容至10 ml使之成為濃度為1 mg/ml的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品溶液，作為儲備

9、液備用。    量取上述溶液0，0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6 ml，分別加水至3 ml，加5%的亞硝酸鈉溶液0.5 ml，放置6 min，加10%的硝酸鋁溶液0.5 ml，搖勻，放置6 min，后加5%的氫氧化鈉溶液2.5 ml，混勻，放置15 min后蒸餾水定容10 ml，用紫外分光光度計在510 nm處測其吸光度，得到回歸方程為：A9.933 9C0.001 73（R2=0.997 5）1.2.4  甘草黃酮的抑菌實驗采用杯碟法測定其抑菌作用，取濃度106107CFU/ml的各種待試菌懸液0.2 ml，與相應(yīng)滅菌培養(yǎng)基15 ml混合

10、制成混菌平板，凝固后，在平板上等距離放入4個滅菌牛津杯，每個菌設(shè)置3個重復(fù)，一個無菌生理鹽水為對照，取0.1 ml黃酮提取液加入牛津杯中，細(xì)菌37、真菌28培養(yǎng)1824 h后，移去牛津杯，量取抑菌圈直徑，直徑越大抗菌活性越強(qiáng)。1.2.5  最低抑菌濃度(MIC)和最小殺菌濃度(MBC)的測定用無菌水將甘草黃酮提取液稀釋，終濃度分別為1，0.5，0.25，0.062 5，0.031 3，0.007 8 mg/ml。取2 ml提取稀釋液至15 ml培養(yǎng)基，混勻后，倒入平板，凝固后加入100 l 106107CFU/ml的菌液，涂布均勻，放至37/28培養(yǎng)24 h后觀察結(jié)果。菌落被完全抑制

11、的最高稀釋度提取物濃度即MIC。培養(yǎng)48 h后，菌落被完全抑制的最高稀釋度提取物濃度為MBC。 2  結(jié)果與分析2.1  超聲波提取法條件的優(yōu)化利用L9（34）正交試驗法優(yōu)化甘草黃酮提取條件結(jié)果見表2，各因素對試驗結(jié)果影響順序為A>C>D>B，即超聲波功率對黃酮提取率的影響效果最為顯著，其次是超聲波時間。最佳提取條件為A3B2C2D1，即在功率為385W，80%乙醇，料液比為115，提取時間為8 min條件下甘草提取液黃酮含量最高。以該最佳提取條件進(jìn)行驗證實驗，甘草黃酮提取率為6.23%，RSD0.862%（n6），因此該最佳提取條件是可行的。表2

12、0; 正交實驗結(jié)果（略）2.2  提取方法的比較由表3可知，超聲波提取方法的提取率明顯高于其它兩種方法，且提取時間最短，提取溶劑用量最少。表3  不同的提取方法與黃酮含量的關(guān)系（略）2.3  抑菌圈的確定由表4可以看出甘草黃酮提取液對金色葡萄球菌、枯草桿菌、大腸桿菌、黑曲霉、青霉都有較強(qiáng)的抑菌效果。而且對細(xì)菌的抑制效果強(qiáng)于真菌。表4  黃酮提取液的抑菌效果（略）2.4  最低抑菌濃度和最小殺菌濃度的確定結(jié)果見表5。表5  甘草黃酮最低抑菌濃度和最小殺菌濃度（略）    由表5可知，甘草黃酮對金色葡萄球菌、

13、枯草桿菌、大腸桿菌、黑曲霉、青霉的最低抑菌濃度分別為0.062 5，0.062 5，0.031 3，0.125，0. 25 mg/ml；最小殺菌濃度為0.25，0.125，0.031 3，0.5，0.25 mg/ml。3  討論    對于甘草黃酮的提取方法的研究已有一些報道，如煎煮法、連續(xù)回流法、浸漬法、酶解法、微波提取法和超聲波提取法等，其主要是以超聲波提取法的效率最高5，6，這與本實驗結(jié)果相一致，這是由于超聲波振動空化、機(jī)械粉碎、攪拌等作用，使植物組織中的細(xì)胞破裂，利于溶劑滲透到植物細(xì)胞內(nèi)部，使細(xì)胞中的成分進(jìn)入溶劑中，加速相互滲透，增加了黃酮在溶劑

14、中的溶解，且其破碎過程是一個物理過程，黃酮化合物的生物活性在一定時間內(nèi)保持不變。與其它實驗結(jié)果比較，本實驗的甘草黃酮提取率更高，達(dá)6.23%。    黃酮類化合物是藥用植物的一大類有效成分，具有多種生物活性，主要的作用之一是抑菌或殺菌7。目前，甘草黃酮對真菌的研究還未見報道，本實驗結(jié)果表明，甘草黃酮對真菌有一定的抑制作用，是一種天然的抑菌劑，可望用于食品保藏，抗菌消炎等，為甘草的綜合利用開辟新的途徑。 【參考文獻(xiàn)】  1金 宏.淺談甘草藥理作用J.時珍國醫(yī)國藥,2000,11(1)：78.2季宇彬，姜 薇，范玉玲,等.甘草黃酮的研究進(jìn)展J.中草藥,2004,35(9)：52.3聶小華，尹光耀，史寶軍，等.甘草有效成分體外抗腫瘤活性和免疫活性的研究J.中藥材