艾葉總黃酮的提取及純化工藝條件

1、艾葉總黃酮的提取及純化工藝條件    摘要：以總黃酮的吸附率、解吸率為指標(biāo)，采用可見分光光度計(jì)測(cè)定總黃酮的含量，考察AB8型大孔吸附樹脂對(duì)艾葉總黃酮的最佳純化條件。結(jié)果表明，最佳吸附條件為樣液濃度0311 mg mL，吸附速率10mL min，樣液pH值2，上樣量每克大孔樹脂5 mg粗黃酮溶液；最佳解吸條件是4倍床體積、體積分?jǐn)?shù)為70的乙醇，以10 mL min的速率洗脫。艾葉總黃酮的含量（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）在未經(jīng)純化之前為193，在最佳條件下純化之后可達(dá)601，約是原來含量的31倍。關(guān)鍵詞：艾葉；總黃酮；大孔吸附樹脂；提?。患兓傸S酮廣泛存在于自然界的某些植物

2、和果漿中，總數(shù)大約有 4 千多種，其分子結(jié)構(gòu)不盡相同，如蕓香苷、橘皮苷、櫟素、綠茶多酚、花色糖苷、花色苷酸等都屬總黃酮。 總黃酮的功能是多方面的，它具有消除氧自由基、抗氧化、調(diào)節(jié)血脂、抗腫瘤、抗病毒等生理活性，同時(shí)總黃酮具有抗?jié)?、抗過敏、抗菌、抗炎、抗衰老、降血脂、治療心腦血管疾病等藥用保健功能，是一類具有廣闊開發(fā)前景的天然抗氧化劑17。 另外，在食品工業(yè)上可作色素用6。生物類黃酮（Bioflavonoids）亦稱維生素 P，常與維生素 C 伴存，在自然界分布廣泛，屬植物次級(jí)代謝產(chǎn)物，是一組存在于蔬菜、水果、花和谷物中的天然色素，因多呈黃色而稱生物類黃酮。 大孔吸附樹脂物理化學(xué)穩(wěn)定性高、吸附

3、選擇性獨(dú)特、不受有機(jī)物存在的影響、再生簡便、解吸條件溫和、使用周期長、宜于構(gòu)成閉路循環(huán)、節(jié)省費(fèi)用等，廣泛用于生化和天然物質(zhì)的分離提純8，9。 鄭亞杰等1015的研究表明，AB8 型大孔吸附樹脂對(duì)總黃酮有較好的吸附效果。 試驗(yàn)主要研究用 AB8 型大孔吸附樹脂純化艾葉總黃酮的最佳工藝條件，其中考慮的主要因素是樣液濃度、吸附速率、樣液 pH 值、上樣量對(duì)吸附率的影響，洗脫劑體積分?jǐn)?shù)、洗脫速率、洗脫劑用量對(duì)解吸率的影響。1材料與方法11材料111儀器FA2004 型電子天平 ；1012AB 型電熱鼓風(fēng)干燥箱；RE52D 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器；WFJ7200 型可見分光光度計(jì)；玻璃層析柱（15 mm×

4、200 mm）；pHS3C 數(shù)字酸度計(jì)；SHZD 循環(huán)水式真空泵。112藥品 艾葉 （購于婁底藥店）；AB8 型大孔吸附樹脂（天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所）；蘆?。ㄉ虾；瘜W(xué)試劑公司）；氫氧化鈉；亞硝酸鈉；硝酸鋁；鹽酸；無水乙醇；體積分?jǐn)?shù)為 95的乙醇；石油醚；乙醚。 以上試劑均為分析純。12方法121粗黃酮的提取 取一定量的艾葉， 將其洗凈，把水晾干，然后放入干燥箱中，在 50 下烘干。再用粉碎機(jī)將其磨成碎末。 稱取一定量的艾葉碎末按以下方法脫色和脫脂。 以無水乙醚為脫脂劑，在45 水浴下脫脂約 20 h，充分除去樣品中脂類和脂溶性色素，當(dāng)用玻璃棒蘸一滴剛要發(fā)生虹吸時(shí)的浸提液于濾紙上，而濾紙上沒有

5、油斑，可認(rèn)為脫脂完全，再放入干燥箱中 50烘干。 將脫過脂的樣品放入圓底燒瓶中， 加入體積分?jǐn)?shù)為 70的乙醇溶液，回流浸提 8 次，每次 2 h 左右，且前 4 次樣品的質(zhì)量（g）與乙醇的體積（mL）比為 18，后 4 次為 16，最后一次浸提液幾乎無色， 說明浸提基本完成。 合并 8次浸提液，放入分液漏斗中，用石油醚進(jìn)行二次脫脂，收集二次脫脂過的粗黃酮提取液，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮至一定體積，再放入真空干燥箱中干燥得到粗黃酮粉末。122標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 精密稱取蘆丁對(duì)照品503 mg 置于 100 mL 容量瓶中，加體積分?jǐn)?shù)為 60的乙醇溶解， 定容至刻度。 精密吸取該溶液 50 mL于 100

6、 mL 容量瓶中，定容至刻度，得濃度為 0252mg mL 的蘆丁對(duì)照品溶液。 分別精密吸取該蘆丁對(duì)照 品 溶 液 00、20、50、80、120、160 mL 于 50 mL容量瓶中， 各加體積分?jǐn)?shù)為 30的乙醇 4 mL，6 g/L亞硝酸鈉 2 mL，放置 6 min 后加 10 g/L 硝酸鋁溶液2 mL， 同樣放置 6 min 后加入 10 g/L 氫氧化鈉溶液20 mL，補(bǔ)加 30乙醇至 50 mL，放置 15 min。 用分光光度計(jì)于 508 nm 波長處測(cè)定吸光度，由此可作出標(biāo)準(zhǔn)曲線，并計(jì)算出線性回歸方程。由標(biāo)準(zhǔn)曲線可以計(jì)算得回歸方程為 A99788C0011 8，其中 C 為蘆

7、丁對(duì)照品溶液的濃度（mg mL），相關(guān)系數(shù) r0998 9。123 AB8型大孔吸附樹脂的預(yù)處理 稱取約16g 的 AB8 型大孔吸附樹脂按照以下步驟對(duì)其進(jìn)行處理。 先用 95的乙醇充分浸泡 24 h 后裝柱，然后用 95的乙醇洗至加適量水無白色渾濁，再用去離子水洗至無醇味后加入大約 4 倍床體積的體積分?jǐn)?shù)為 5的 HCl 浸泡 34 h， 用去離子水洗至中性， 再加入大約 4 倍床體積的為 5 g/L 的 NaOH 溶液浸泡 34 h，最后用去離子水洗至中性即可使用。124粗黃酮中總黃酮含量的測(cè)定 稱取 327 mg的粗黃酮，在 90 用去離子水溶解，然后用離心機(jī)3 500 r min 離心

8、， 取上層清液配成 50 mL 溶液，再取 10 mL 該溶液于 50 mL 容量瓶中， 按步驟 122的方法測(cè)得總黃酮含量為 193。2結(jié)果與分析21樣液濃度對(duì)吸附率的影響稱取 6571 mg 粗黃酮在 90 水浴中用去離子水溶解，3 500 rmin 離心后取上層清液配成 250 mL溶液， 均分成 5 份， 再分別稀釋至濃度為 0066、0217、0311、0413、0507 mg mL 的溶液。 然后將它們均以 10 mLmin 的速率過柱，分別用 3 倍床體積的水洗柱，收集吸附及洗柱流出液，按步驟 122 的方法測(cè)量其中的總黃酮含量，據(jù)此計(jì)算出不同樣液濃度下的吸附率（圖 2）。 由圖

9、 2 可以看出，當(dāng)樣液濃度小于 0311 mgmL 時(shí)，隨著樣液濃度的增大，吸附率也增大；當(dāng)樣液濃度為 0311 mgmL 時(shí)，吸附率達(dá)到最大值，隨后隨著樣液濃度的增大，吸附率減小。所以，上樣時(shí)應(yīng)使樣液濃度為 0311 mgmL。22吸附速率對(duì)吸附率的影響配制濃度為 0311mgmL 的粗黃酮溶液 500mL，均分成 5 份，分別以 05、10、15、20、25 mLmin 的速率過柱，并用 3 倍床體積的水洗柱，收集吸附及洗柱流出液，測(cè)量其中的總黃酮含量，據(jù)此計(jì)算出不同吸附速率下的吸附率如圖 3。 由圖 3 可以看出，隨著吸附速率的增大，吸附率逐漸降低，但當(dāng)吸附速率太小時(shí)花費(fèi)的時(shí)間就會(huì)很多，

10、并且當(dāng)吸附速率由 05 mLmin 增大到 10 mLmin 時(shí)， 吸附率只是略微降低，卻節(jié)省了 12 的時(shí)間；而當(dāng)吸附速率大于 10 mLmin 時(shí)，雖然花費(fèi)的時(shí)間減少了，但吸附率卻急劇下降。 綜合考慮以上因素，選擇吸附速率為 10 mLmin 比較合適。23樣液pH值對(duì)吸附率的影響配制濃度為 0311 mgmL 的粗黃酮溶液 500mL，均分成 5 份，用 5的 HCl 將它們的 pH 值分別調(diào)至 1、2、3、4、5， 然后均以 10 mLmin 的速率過柱，再用 3 倍床體積的水洗柱，收集吸附及洗柱流出液， 按照步驟 122 的方法測(cè)量其中的總黃酮含量，據(jù)此計(jì)算出不同 pH 值下的吸附率

11、如圖 4。 據(jù)圖4 可看出，當(dāng) pH 值小于 2 時(shí)，隨著樣液 pH 值的增大，吸附率相應(yīng)地增大；當(dāng) pH 值大于 2 后，隨著 pH值的增大，吸附率明顯地降低；當(dāng) pH 值為 2 時(shí)吸附率可達(dá)最大值。 因此過柱前要調(diào)好溶液的酸堿度，使其 pH 值為 2，以便增大大孔樹脂對(duì)總黃酮的吸附能力。24上樣量對(duì)吸附率的影響配制濃度為 0311 mgmL 的粗黃酮溶液 1 500mL， 分別從中取出總黃酮量為 40、60、80、100、120mg 的溶液，均以 10 mL min 的速率過柱，并用 3 倍床體積的水洗柱，收集吸附及洗柱流出液，按步驟122 的方法測(cè)量其中的總黃酮含量，據(jù)此計(jì)算出不同上樣量

12、下的吸附率如圖 5。 由圖 5 可知，當(dāng)上樣量小于 60 mg 時(shí)， 隨著上樣量的增加， 吸附率略有減小；上樣量在 6080 mg 之間時(shí)，隨著上樣量的增加，吸附率略有增大；上樣量大于 80 mg 后，隨著上樣量的增加，吸附率明顯減小。 總體上看，上樣量為 4080 mg 時(shí)，吸附率變化不大；雖然上樣量小有利于吸附，但上樣量太小，大孔樹脂的利用率太低。 因此，當(dāng)上樣量為 80 mg 時(shí)，既能保持較大的吸附率，又使得大孔樹脂的利用率較高。 根據(jù)所用大孔樹脂的量為 16 g 來計(jì)算，可算出平均每克大孔樹脂的上樣量為 5 mg 時(shí)， 吸附率和大孔樹脂的利用率都比較高。所以，試驗(yàn)前要根據(jù)所用大孔樹脂的

13、量來確定上樣量，使平均每克大孔樹脂的上樣量為 5 mg。25洗脫劑體積分?jǐn)?shù)對(duì)解吸率的影響配制濃度為 0311 mgmL 的粗黃酮溶液 500mL，均分成 5 份 ，均以 10 mL min 的速率過柱 ，分別用 3 倍床體積的水洗柱，并收集吸附及洗柱流出液， 再用 4 倍床體積的體積分?jǐn)?shù)分別為 30、50、70、80、90的乙醇溶液以 10 mL min 的速率洗脫，收集洗脫液。 按步驟 122 的方法測(cè)量其中的總黃酮含量，據(jù)此計(jì)算出不同體積分?jǐn)?shù)的洗脫劑下的解吸率如圖 6。由圖 6 可以看出，當(dāng)洗脫劑體積分?jǐn)?shù)小于 70時(shí)，隨著洗脫劑體積分?jǐn)?shù)的增大，解吸率也增大；當(dāng)洗脫劑體積分?jǐn)?shù)為 70時(shí)，解吸

14、率達(dá)最大值；當(dāng)洗脫劑體積分?jǐn)?shù)大于 70后，隨著洗脫劑體積分?jǐn)?shù)的增大，解吸率逐漸減小。 所以，洗脫時(shí)用體積分?jǐn)?shù)為70的乙醇，洗脫效果最好。26洗脫速率對(duì)解吸率的影響配制濃度為 0311 mgmL 的粗黃酮溶液 500mL，均分成 5 份 ，均以 10 mL min 的速率過柱 ，分別用 3 倍床體積的水洗柱，并收集吸附及洗柱流出液，再用 4 倍床體積的體積分?jǐn)?shù)為 70的乙醇溶液洗脫，洗脫速率分別為 05、10、20、30、40 mLmin，收集洗脫液， 按步驟 122 的方法測(cè)量其中的總黃酮含量，據(jù)此計(jì)算出不同洗脫速率下的解吸率如圖7。 由圖 7 可看出，隨著洗脫速率的增大，解吸率減小，因此，按

15、說洗脫速率小有利于解吸率的增加；但洗脫速率太小就需要花費(fèi)很多時(shí)間。 同時(shí)由圖 7 可以看出， 洗脫速率在 0510 mLmin 之間解吸率大，且隨著洗脫速率的增加，解吸率降低很小，卻節(jié)省了 12 的時(shí)間； 而當(dāng)洗脫速率大于 10 mLmin時(shí)，雖然所用時(shí)間減少，但解吸率急速減小。 考慮以上因素，將洗脫速率定為 10 mLmin 比較合適。27洗脫劑用量對(duì)解吸率的影響配制濃度為 0311 mgmL 的粗黃酮溶液 500mL，均分成 5 份 ，均以 10 mL min 的速率過柱 ，分別用 3 倍床體積的水洗柱，并收集吸附及洗柱流出液，分別用 2、3、4、5、6 倍床體積的體積分?jǐn)?shù)為 70的乙醇溶

16、液洗脫，收集洗脫液，按步驟 122 的方法測(cè)量其中的總黃酮含量，據(jù)此計(jì)算出不同用量洗脫劑下的解吸率如圖 8。 由圖 8 可看出，洗脫劑用量從2 倍床體積增加到 4 倍床體積時(shí)，解吸率顯著增大；洗脫劑用量大于 4 倍床體積時(shí)，隨著洗脫劑用量的增加，解吸率幾乎不再變化。 因此，洗脫劑用量為 4倍床體積時(shí)，洗脫效果最好。28最佳條件下的純化效果配制濃度為 0311 mgmL 的粗黃酮溶液 250mL，pH 值調(diào)為 2， 以 10 mL min 的速率過柱， 用 3倍床體積的水洗柱，再用 4 倍床體積的體積分?jǐn)?shù)為70的乙醇溶液以 10 mL min 的速率洗脫，將洗脫液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮到一定體積，再減

17、壓干燥成粉末。 然后按步驟 122 的方法測(cè)得其總黃酮的含量為 601，約是過柱前含量的 31 倍。3結(jié)論用 AB8 型大孔吸附樹脂為吸附劑對(duì)粗黃酮進(jìn)行純化，受到各種因素的影響，包括樣液濃度、吸附速率、樣液 pH 值、上樣量對(duì)吸附率的影響及洗脫劑體積分?jǐn)?shù)、洗脫速率、洗脫劑用量對(duì)解吸率的影響，這些因素對(duì)純化效果有很大的影響。 研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)樣液濃度為 0311 mgmL，pH 值為 2， 吸附速率為10 mL min， 上樣量為每克大孔樹脂 5mg 粗黃酮溶液，吸附率可達(dá)最大值；再用 4 倍床體積的體積分?jǐn)?shù)為 70的乙醇溶液以 10 mLmin 的速率洗脫可使解吸率達(dá)到最大值。 當(dāng)吸附率和解吸率都達(dá)到最大值時(shí)，即為試驗(yàn)所需的最佳條件。 在最佳條件下，通過 AB8 型大孔吸附樹脂的純化， 使得粗黃酮中的總黃酮含量由原來的 193增大到 601， 是原含量的 31 倍。參考文獻(xiàn)：1 陳乃富 蕨菜黃酮類化合物的提取及其抗氧化作用 J 食品與發(fā)酵工業(yè)，2003，29（11）：63662 陳乃富 ，張 莉 蕨菜黃酮類化合物的提取與分析 J 中國副特產(chǎn)，2004（4）：1