實驗 SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳分離混合蛋白質(zhì)

1、實驗 電泳法 SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離混合蛋白質(zhì)【實驗?zāi)康摹?.了解聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白質(zhì)的基本原理。2.熟悉并掌握聚丙烯酰胺凝膠電泳的實驗方法和常規(guī)操作?！緦嶒炘怼?.聚丙烯酰胺是由丙烯酰胺(Acr)和交聯(lián)劑N,N-亞甲基雙丙烯酰胺(Bis)在催化劑和引發(fā)劑作用下，聚合交聯(lián)而成，具有網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的凝膠。以此為支持物，可以對蛋白質(zhì)或核酸等大分子物質(zhì)進行電泳分離。2.聚丙烯酰胺凝膠電泳根據(jù)蛋白質(zhì)分子或其它生物大分子所帶電荷的差異及分子大小的不同對不同組分進行分離。然而，有時兩個分子量不同的蛋白質(zhì)，由于分子大小的差異被電荷的差異所補償，最終以相同的泳動速度向陽極移動，不能達到分離的目的。

2、SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)就是設(shè)法將電荷差異這一因素除去或減小到可以忽略而不計的程度。SDS是一種陰離子表面活性劑，它能破壞蛋白質(zhì)的疏水相互作用，造成蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)的解體。由于SDS帶有負電荷，使SDS-蛋白質(zhì)復合物帶有相同密度的負電荷，帶電量遠遠超過了蛋白質(zhì)分子本身的電荷，因而掩蓋了不同蛋白質(zhì)分子本身電荷的差別?！緦嶒灢襟E】按下表配方制備凝膠： 將12的分離膠（10毫升）加入玻璃板之間，緩慢加入蒸餾水密封，待膠凝固倒掉上層水，加入5濃縮膠（5毫升），插入樣品梳，室溫放置，待聚合反應(yīng)完成制備樣本小心取出樣品梳，取預(yù)先制備好的樣品10uL，緩慢加入點樣孔中按圖所示安裝電泳槽，

3、加入適量電泳緩沖液：恒壓電泳約1小時，至指示劑到達膠板底部時停止電泳卸開電泳槽，撬開玻璃板，小心取出凝膠，剝離分離膠將凝膠放置在培養(yǎng)皿中，加入染色液浸沒凝膠，脫色搖床搖晃30分鐘后觀察【實驗結(jié)果】如圖所示：各種混合蛋白質(zhì)Mark 【討論與分析】1.SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白質(zhì)的原理？答：聚丙烯酰胺凝膠電泳是網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，具有分子篩效應(yīng)，它有兩種形式，一種是非變性聚丙烯酰胺凝膠，蛋白質(zhì)在電泳中保持完整的狀態(tài)，蛋白在其中依三種因素分開：蛋白大小，形狀和電荷。而SDS-PAGE僅根據(jù)蛋白分子量亞基的不同而分離蛋白。SDS是陰離子去污劑，作為變性劑和助溶試劑，它能斷裂分子內(nèi)和分子間的氫鍵，使分子去

4、折疊，破壞蛋白分子的二、三級結(jié)構(gòu)。而強還原劑如巰基乙醇，二硫蘇糖醇能使半胱氨酸殘基間的二硫鍵斷裂。在樣品和凝膠中加入還原劑和SDS后，分子被解聚成多肽鏈，解聚后的氨基酸側(cè)鏈和SDS結(jié)合成蛋白- SDS膠束，所帶的負電荷大大超過了蛋白原有的蛋白量，這樣就消除了不同分子間的電荷差異和結(jié)構(gòu)差異。SDS-PAGE一般采用的是不連續(xù)緩沖系統(tǒng)，于連續(xù)緩沖系統(tǒng)相比，能夠有較高的分辨率。濃縮膠的作用是有堆積作用，凝膠濃度較小，孔徑較大，把較稀的樣品加在濃縮膠上，經(jīng)過大孔徑凝膠的遷移作用而被濃縮至一個狹窄的區(qū)帶。當樣品液和濃縮膠選TRIS/HCL緩沖液，電極液選TRIS/甘氨酸。電泳開始后，HCL解離成氯離子，甘氨酸解離出少量的甘氨酸根離子。蛋白質(zhì)帶負電荷，因此一起向正極移動，其中氯離子最快，甘氨酸根離子最慢，蛋白居中。電泳開始時氯離子泳動率最大，超過蛋白，因此在后面形成低電導區(qū)，而電場強度與低電導區(qū)成反比，因而產(chǎn)生較高的電場強度，使蛋白和甘氨酸根離子迅速移動，形成以穩(wěn)定的界面，使蛋白聚集在移動界面附近，濃縮成一中間層。2. 凝膠配制時的注意事項答：丙烯酰胺與亞甲基雙丙烯酰胺均為神經(jīng)毒劑，對皮膚有刺激作用，故操