真菌DNA大量提取

1、核裂解法大量提取真菌 DNA一、試劑的配制1. EDTA-Na2（ 0.1 M）：稱取 3.72 g Na2EDTA·2H2O，用超純水定容至 100 mL。2. Tris-HCl（1 M，pH）：稱取 12.11 g Tris-HCl ，用 90-95 mL超純水溶解，調(diào) pH至 8.0后，在定容至 100 mL。3. 核裂解液 （10 mM Tris-HCl,400 mM NaCl ，2 mM EDTA-Na 2，0.8 mM 鹽酸胍）： 分別稱取 76.43 g鹽酸胍， 23.38 g NaCl于 1 L燒杯中，加入滅菌超純水充分 攪拌溶解至 900 mL，再加入 10 mL

2、1 M Tris-HCl 和 20 mL0.1 M EDTA-Na 2， 攪拌溶解，調(diào) pH 至 8.0，定容至 1000 mL，高溫滅菌，冷卻待用。4. SDS（20%）：稱取 20 g SDS，滅菌超純水定容至 100 mL。（SDS 不能采用 高溫高壓滅菌）5. 鹽酸胍：強(qiáng)烈變性劑，可溶解蛋白質(zhì)，導(dǎo)致 細(xì)胞結(jié)構(gòu) 破壞，核蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu) 破壞，從核酸上解離下來，此外， RNA 酶可被鹽酸胍等還原劑滅活。二、操作步驟1. 稱取液體培養(yǎng)基 PPDA 培養(yǎng)樣品 1.0-1.5 g（可用滅菌超純水或 TE 緩沖液清 洗 1-2 次），研缽先用液氮預(yù)冷， 再將樣品用液氮研磨， 直至全部研磨成均勻 粉末

3、。2. 轉(zhuǎn)入預(yù)裝 5 mL（ 與樣品質(zhì)量比為 1:4-1:6 ）核裂解液的 15 ml 離心管中，加入 60 l 50 mg/mL 蛋白酶 K（80-150 l，20 mg/mL），10 l RNase A充分震蕩 15s混勻。3. 加入 500 l 20% SDS（終濃度 1%-5%），震蕩混勻。4. 56-65水浴，約 3 h，至出現(xiàn)較多上清，期間不斷顛倒混勻。5. 冷卻后， 4， 6000 rpm，離心 10 min，吸取上清至另一新的 15 mL 離心管 中。6. 加入 10 l -巰基乙醇（終濃度 0.02%），再加入等體積的酚 /氯仿 /異戊醇 （25:24:1），顛倒混勻 30次

4、左右， 6000 rpm，離心 10 min。（該步驟須在通風(fēng)廚中進(jìn)行，顛倒混勻動(dòng)作輕柔，避免劇烈震蕩）7. 吸取上清至另一新的 15 mL 離心管，注意不要吸到中間蛋白層。8. 如果上清十分渾濁，可用等體積氯仿 /異戊醇（ 24:1）再抽提一到兩次，同樣 6000 rpm 離心 10 min，將上清轉(zhuǎn)至新的離心管。（該步驟須在通風(fēng)廚中進(jìn)行， 顛倒混勻動(dòng)作輕柔，避免劇烈震蕩）9. 加入等體積 -20預(yù)冷的異丙醇（可先加入 1/10體積 3 M，pH5.2的 NaAc， 沉淀效果更好），輕柔顛倒混勻，如果 DNA 沉淀呈絮團(tuán)狀，可用移液槍槍頭 或干凈玻璃棒將 DNA 絮狀沉淀挑出，若DNA 不呈

5、完整絮狀沉淀或沉淀較少， 可在-20 冰箱放置 1-2 h促沉淀。10. 若 DNA 沉淀無法直接挑出， 可 4，6000 rpm，10 min 收集沉淀，棄盡上清， 挑出 DNA 沉淀。11. 將DNA沉淀轉(zhuǎn)入 2 mL EP管，加入 1 mL預(yù)冷的 70%乙醇，輕彈管壁重懸 沉淀?；靹蛳礈?2-3次，以去除殘余的鹽， 12000 rpm，2 min 棄盡上清。12. 加入 1mL 預(yù)冷的無水乙醇， 輕彈管壁重懸沉淀； 12000 rpm，離心 2 min。（動(dòng) 作輕柔，不可劇烈震蕩，避免造成 DNA 斷裂）13. 室溫放置 10-15 min 左右，使乙醇完全揮發(fā)，加入適當(dāng)體積的滅菌超純水

6、或 TE 緩沖液溶解。CTAB 法大量提取真菌基因組 DNA一、試劑的配制1. CTAB （十六烷基三甲基溴化銨） 提取液（PH 8.0）：2% CTAB（w/v），1.4 M Nacl，0.02 M EDTA ，0.1 M Tris-cl ，0.2%巰基乙醇。即稱取 CTAB 2 g 加蒸 餾水 40 ml，加 1M Tris-cl（PH8.0）10 ml，0.5 M EDTA（PH 8.0）4 ml 和 5 M NaCl 28 ml（約 8.19 g NaCl），于 65下溶解，用蒸餾水定容到 100 ml，最 后 pH 值 8.0，滅菌后加入 0.2 ml - 巰基乙醇。2. 1 M T

7、ris-cl（PH 8.0）：12.11 g Tris堿；ddH2O，80 ml；HCl ，4.9 ml 三者混勻 充分溶解后，滴加濃鹽酸調(diào) PH至 8.0，定容至 100 ml。3. 0.5 M EDTA （PH 8.0）：在 80ml 水中加入 18.01 g EDTANa2·2H2O 攪拌溶 解，用 NaOH調(diào) PH 至 8.0（約 2 g NaOH顆粒），定容至 100 ml。4. 5 M NaCl 100ml ：稱取 29.22 g NaCl ，用ddH2O定容到 100 ml。5. 3 M NaAc 10ml：稱取 2.46 g NaAc，用 ddH2O定容到 10 ml

8、，pH5.2。6. TE溶液： Tris-HCl（pH=8.0，1 mol/ L ）5 ml，EDTA（pH=8.0，0.5 mol/ L）1 ml ，加 ddH2O 定容到 500 ml ，PH8.0。二、操作步驟1. 稱取液體培養(yǎng)基 PPDA 培養(yǎng)樣品 1.0 g，研缽先用液氮預(yù)冷， 再將樣品用液氮 研磨均勻，直至全部研磨至粉末，轉(zhuǎn)入 15 ml 離心管中，加入 4 mL（ 與樣品 質(zhì)量比為 1:4-1:6 ）65預(yù)熱的 CTAB 溶液（用前加入 0.2%的 -巰基乙醇）， 充分振蕩混勻。2. 65水浴，約 45 min-60 min，期間顛倒混勻 3-4 次。3. 冷卻后，加入等體積的酚

9、： 氯仿：異戊醇 （25:24:1），顛倒混勻 30 次左右，12000 rpm，離心 15 min。（該步驟須在通風(fēng)廚中進(jìn)行，顛倒混勻動(dòng)作輕柔，避免劇 烈震蕩）4. 吸取上清至另一新的 15 mL 離心管，注意不要洗到中間蛋白層。5. 加入等體積氯仿 :異戊醇（ 24:1），12000 rpm，離心 15-20 min，若上清仍十分 渾濁，可重復(fù) 2-3 次。（該步驟須在通風(fēng)廚中進(jìn)行，顛倒混勻動(dòng)作輕柔，避免 劇烈震蕩）6. 吸取上清，轉(zhuǎn)入新的離心管中，加入 1/10體積的 NaAc（3 M，pH5.2）。7. 加入等體積 -20預(yù)冷的異丙醇或兩倍體積的無水乙醇顛倒混勻后置于 -20 冰箱放置

10、 1-2 h。（顛倒混勻動(dòng)作輕柔， 不可劇烈震蕩， 避免造成 DNA 斷裂）8. 12000 rpm， 10 min 棄上清。9. 向離心管中加入 70%的乙醇至管中 2/3 體積，混勻洗滌 2-3 次，以去除殘余 的鹽， 12000 rpm，2 min 棄盡上清。10. 室溫放置 10-15 min左右，使乙醇完全揮發(fā)，加入適當(dāng)體積 ddH2O或TE 緩 沖液溶解，同時(shí)加入 2-10 lRNA酶A，混勻， 37水浴 30-60 min。準(zhǔn)備藥品： Tirs 堿、濃鹽酸、 EDTANa2·2H2O、NaOH、NaCl、CTAB、酚、氯仿、異 戊醇、無水乙醇、 NaAc、液氮、巰基乙醇

11、 研缽、恒溫水浴、離心機(jī)、離心管三、基本原理樣品在液氮中研磨可以迅速破壞其細(xì)胞壁， 游離出細(xì)胞器和原生質(zhì)， 并防止 DNA 降解。采用 CTAB （十六烷基三甲基溴化胺，一種非離子型去污劑）抽提 液抽提（ 65）上述研磨物。在低離子強(qiáng)度溶液中 CTAB 具有沉淀核酸與酸性 多聚糖的特性，在高離子強(qiáng)度的溶液中 （0.7mol/L NaCl）,CTAB 溶解細(xì)胞膜相物 質(zhì)，與蛋白質(zhì)和多聚糖形成復(fù)合物，只是不能沉淀核酸。通過有機(jī)溶劑抽提，去 除蛋白、多糖、酚類等雜質(zhì)后經(jīng)過多次乙醇漂洗和沉淀， 用 RNase水解 RNA ， TE 緩沖液或已滅菌超純水溶解得到較為純凈的 DNA 粗提物Tris-HCl

12、 （pH8.0）提供一個(gè)緩沖環(huán)境 ,防止核酸被破壞； EDTA 螯合 Mg2+或 Mn2+離子,抑制 DNase 活性； NaCl 提供一個(gè)高鹽環(huán)境，使 DNA 充分溶解，存 在于液相中； -巰基乙醇是抗氧化劑，有效地防止酚氧化成醌，避免褐變，使酚 容易去除基因組 DNA 。蛋白質(zhì)的去除：酚 /氯仿抽提使用變性劑變性 （SDS、異硫氰酸胍等 ）高鹽洗滌 蛋白酶處理核酸分離，純化；多糖的去除：高鹽法，用乙醇沉淀時(shí)，在待沉淀溶液中加入 1/2 體積的 5MNaCl，高鹽可溶解多糖。用多糖水解酶將多糖降解。在提取緩沖液中加一定量 的氯苯（1/2 體積），氯苯可以與多糖的羥基作用，從而去除多糖。用 P

13、EG8000代 替乙醇沉淀 DNA ：在500 L DNA液中加入 200l 20% PEG8000 含（ 1.2 M NaCl） ， 冰浴 20min.核酸分離，純化；多酚的去除 :在抽提液中加入防止酚類氧化的試劑： -巰基乙醇、抗壞血酸、 半胱氨酸、二硫蘇糖醇等加入易與酚類結(jié)合的試劑：如PVP（ 聚乙烯吡咯酮 ）,PEG（聚乙二醇 ），它們與酚類有較強(qiáng)的親和力，可防止酚類與 DNA 的結(jié)合；鹽離子的去除： 70%的乙醇洗滌核酸吸附，沉淀和溶解使用合適的吸附材 料吸附核酸，其它的雜質(zhì)均被洗掉，達(dá)到純化 DNA 的目的另一種方式加入 1/10 體積的 NaAc（pH5.2,3M） ，用預(yù)冷的乙

14、醇或異丙醇沉淀 RNA 吸附或沉淀后應(yīng)用 70%的乙醇洗滌，以除去鹽離子等若長期儲(chǔ)存建議使用 TE 緩沖液溶解 TE 中的 EDTA能螯合Mg2+或Mn2+離子，抑制 DNase，pH值為8.0，可防止 DNA發(fā)生 酸解。DNA 中含有蛋白、多糖、多酚類雜質(zhì)。 DNA 在溶解前，有酒精殘留，酒精 抑制后續(xù)酶解反應(yīng)， DNA 中殘留有金屬離子，有 RNA 的存留。對(duì)策：重新純化 DNA ，去除蛋白、多糖、多酚等雜質(zhì)，重新沉淀 DNA ，讓酒精充分揮發(fā)，增加 70%乙醇洗滌的次數(shù) （2-3 次），加入 RNase降解 RNA。四、 DNA 質(zhì)量檢測1. 取2-5 l DNA，加1l 6上×

15、;樣緩沖液混勻，以HindIII DNA marker 作為 分子量標(biāo)準(zhǔn)，在 1×TAE 緩沖液中于 120 V 進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳 20-30 min，于紫外成像儀中拍照，檢查 DNA 的質(zhì)量；2. 取待測 DNA 樣品 10 l至一潔凈的離心管中， 加蒸餾水稀釋至 2 mL ，轉(zhuǎn) 入到潔凈的石英比色皿中，以等體積蒸餾水作為空白對(duì)照，于快速核酸 蛋白分析儀或分光光度計(jì)上測定 OD260及 OD280，根據(jù) OD260 計(jì)算 DNA 的濃度，并以 OD260/OD280 的大小確定 DNA 的質(zhì)量；五、常見問題1. 用酚抽提細(xì)胞 DNA 時(shí)，有什么作用？有什么優(yōu)點(diǎn)？ 苯酚：使蛋白質(zhì)變

16、性，同時(shí)抑制了 DNase 的降解作用。用苯酚處理勻漿液時(shí) ,由 于蛋白與 DNA 聯(lián)結(jié)鍵已斷 ,蛋白分子表面又含有很多極性基團(tuán)與苯酚相似相溶。蛋白分子溶于酚相，而 DNA 溶于水相。 使用酚的優(yōu)點(diǎn)：有效變性蛋白質(zhì)；抑制了 DNase 的降解作用。缺點(diǎn)：能 溶解 10-15%的水，從而溶解一部分 poly（A）RNA 。不能完全抑制 RNase 的活 性。2. 氯仿的作用？ 氯仿：克服酚的缺點(diǎn)；加速有機(jī)相與液相分層。 最后用氯仿異丙醇抽提：去除核酸溶液中的跡量酚。 （酚易溶于氯仿中）3. 用酚 -氯仿抽提細(xì)胞基因組 DNA 時(shí)，通常要在酚 -氯仿中加少許異戊醇，為什 么？異戊醇：減少蛋白質(zhì)變性

17、操作過程中產(chǎn)生的氣泡。 異戊醇可以降低表面張力， 從 而減少氣泡產(chǎn)生。另外，異戊醇有助于分相，使離心后的上層含 DNA 的水相、 中間的變性蛋白相及下層有機(jī)溶劑相維持穩(wěn)定。4. 用乙醇沉淀 DNA 時(shí)，為什么加入單價(jià)的陽離子？用乙醇沉淀 DNA 時(shí)，通常要在溶液中加入單價(jià)的陽離子，如 NaCl 或 NaAc， Na+中和 DNA 分子上的負(fù)電荷， 減少 DNA 分子之間的同性電荷相斥力， 而易于 聚集沉淀。5. DNA 樣品不純，抑制后續(xù)酶解和 PCR反應(yīng)。 DNA 提取常見問題：材料不新 鮮或反復(fù)凍融、未很好抑制內(nèi)源核酸酶的活性、提取過程操作過于劇烈， DNA 被機(jī)械打斷，外源核酸酶污染反復(fù)

18、凍融。 盡量取新鮮材料， 低溫保存材料避免反 復(fù)凍融，液氮研磨或勻漿組織后， 應(yīng)在解凍前加入裂解緩沖液。 在提取內(nèi)源核酸 酶含量豐富的材料的 DNA 時(shí)，可增加裂解液中螯合劑的含量，細(xì)胞裂解后的后 續(xù)操作應(yīng)盡量輕柔。所有試劑用無菌水配制，耗材經(jīng)高溫滅菌。將 DNA 分裝保 存于緩沖液中 ,避免反復(fù)凍融。6. DNA 降解， DNA 提取常見問題。實(shí)驗(yàn)材料不佳或量少，破壁或裂解不充分， 吸附或沉淀不完全，洗滌時(shí) DNA 丟失。盡量選用新鮮 （幼嫩 ）的材料，動(dòng)植物要 勻漿研磨充分； G+菌，酵母裂解前先用生物酶或機(jī)械方式破壁。高溫裂解時(shí)， 時(shí)間適當(dāng)延長 （對(duì)于動(dòng)物細(xì)胞 ,細(xì)菌可增加 PK 的用量 ）。增加吸附的時(shí)間、或低溫 沉淀小心操作。7. 要用冰凍材料提出高質(zhì)量的基因組 DN