用純化的INH抗體包被微孔板制成固相載體往微孔中依次

1、用純化的 INH 抗體包被微孔板，制成固相載體，往微孔中依次加入標(biāo)本或標(biāo)準(zhǔn)品、生物素化的INH抗體、 HRP 標(biāo)記的親和素，經(jīng)過(guò)徹底洗滌后用底物（TMB）顯色。 TMB 在過(guò)氧化物酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成最終的黃色。 顏色的深淺和樣品中的 INH 呈正相關(guān)。用酶標(biāo)儀在 450nm 波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度（ 值），計(jì)算樣品濃度。試劑盒組成及試劑配制1、酶標(biāo)板： 一塊（ 96 孔）2、標(biāo)準(zhǔn)品 （凍干品）： 2瓶，請(qǐng)臨用前15 分鐘內(nèi)配制。每瓶以樣品稀釋液稀釋至0.5ml ，蓋好后室溫靜置大約 10 分鐘，同時(shí)反復(fù)顛倒 / 搓動(dòng)以助溶解，其濃度為 4,000 pg/ml ，然后做系列倍比

2、稀釋?zhuān)ㄗⅲ翰灰苯釉诎逯羞M(jìn)行倍比稀釋?zhuān)?，分別配制成 4,000 pg/ml ，2,000 pg/ml ，1,000 pg/ml ， 500 pg/ml ， 250 pg/ml ，125 pg/ml ，62.5 pg/ml ，樣品稀釋液直接作為空白孔 0 pg/ml 。如配制 2,000 pg/ml標(biāo)準(zhǔn)品：取 0.3ml（不要少于 0.3ml） 4,000 pg/ml的上述標(biāo)準(zhǔn)品加入含有 0.3ml樣品稀釋液的Eppendorf管中，混勻即可，其余濃度以此類(lèi)推。1、酶標(biāo)儀（建議儀器使用前提前預(yù)熱）2、微量加液器及吸頭，EP 管3、蒸餾水或去離子水，濾紙標(biāo)本的采集及保存1、 血清：全血標(biāo)本請(qǐng)于室

3、溫放置 2 小時(shí)或 4 過(guò)夜后于 1000 g 離心 20 分鐘，取上清即可檢測(cè)，或?qū)⑸锨逯糜?-20 或-80 保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融。2、 血漿：可用 EDTA 或肝素作為抗凝劑，標(biāo)本采集后 30 分鐘內(nèi)于 1000 g 離心 15 分鐘，取上清即可檢測(cè)，或?qū)⑸锨逯糜?-20 或 -80 保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融。3、其它生物標(biāo)本：請(qǐng) 1000g 離心 20 分鐘，取上清即可檢測(cè)，或?qū)⑸锨逯糜?-20或-80保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融。操作步驟實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前， 各試劑均應(yīng)平衡至室溫， 試劑不能直接在 37 溶解；試劑或樣品配制時(shí)， 均需充分混勻，混勻時(shí)盡量避免起泡。實(shí)驗(yàn)前應(yīng)預(yù)測(cè)樣品含量，如樣品濃度過(guò)

4、高時(shí)，應(yīng)對(duì)樣品進(jìn)行稀釋?zhuān)允瓜♂尯蟮臉悠贩显噭┖械臋z測(cè)范圍，計(jì)算時(shí)再乘以相應(yīng)的稀釋倍數(shù)。1、 加樣：分別設(shè)空白孔、標(biāo)準(zhǔn)孔、待測(cè)樣品孔。空白孔加樣品稀釋液100，余孔分別加標(biāo)準(zhǔn)品或待測(cè)樣品 100 ，注意不要有氣泡，加樣 時(shí)將樣品加于酶標(biāo)板底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動(dòng)混勻，酶標(biāo)板加上蓋或覆膜， 37 溫育 2 小時(shí)。 ELISA 試劑盒性，每次實(shí)驗(yàn)請(qǐng)使用新的標(biāo)準(zhǔn)品溶液。2、棄去液體，甩干，不用洗滌。每孔加ELISA試劑盒100（臨用前配制），酶標(biāo)板加上覆膜，37 溫育 1 小時(shí)。3、 棄去孔內(nèi)液體，甩干，洗板 3 次，每次浸泡 1-2 分鐘，大約 400 / 每孔，甩干（也可輕拍將孔內(nèi)液體拍

5、干）。4、每孔加 檢測(cè)溶液 B 工作液 （臨用前配制） 100，加上覆膜， 37溫育 1 小時(shí)。5、棄去孔內(nèi)液體，甩干，洗板5 次，方法同步驟3。6、 每孔加 底物溶液 90 ，酶標(biāo)板加上覆膜 37 避光顯色 （反應(yīng)時(shí)間控制在 15-30分鐘，當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)孔的前 3-4 孔有明顯的梯度藍(lán)色，后 3-4 孔梯度不明顯時(shí)，即可終止）。7、 每孔加 終止溶液 50 ，終止反應(yīng)，此時(shí)藍(lán)色立轉(zhuǎn)黃色。終止液的加入順序應(yīng)盡量與底物液的加入順序相同。8、 立即用酶標(biāo)儀在 450nm 波長(zhǎng)測(cè)量各孔的光密度（值）注：5、在使用前請(qǐng)手甩幾下或少時(shí)離心處理，以使管壁或瓶蓋的液體沉積到管底。標(biāo)準(zhǔn)品、ELISA試劑盒工作液、

6、檢測(cè)溶液 B 工作液請(qǐng)依據(jù)所需的量配制使用，并使用相應(yīng)的稀釋液配制，不能混淆。請(qǐng)精確配制標(biāo)準(zhǔn)品及工作液，盡量不要微量配制（如吸取檢測(cè)溶液 A 時(shí)，一次不要小于10 ），以避免由于不準(zhǔn)確稀 釋而造成濃度誤差；請(qǐng)勿重復(fù)使用已稀釋過(guò)的標(biāo)準(zhǔn)品、檢測(cè)溶液 A 工作液、 檢測(cè)溶液 B 工作液。6、 反應(yīng)時(shí)間的控制： 加入底物后請(qǐng)定時(shí)觀察反應(yīng)孔的顏色變化（比如，每隔10 分鐘），如顏色較深，請(qǐng)?zhí)崆凹尤虢K止液終止反應(yīng)，避免反應(yīng)過(guò)強(qiáng)從而影響酶標(biāo)儀光密度讀數(shù)。7、 底物： 底物請(qǐng)避光保存，在儲(chǔ)存和溫育時(shí)避免強(qiáng)光直接照射洗板方法1、 手工洗板方法：將推薦的洗滌緩沖液至少0.4ml注入孔內(nèi)，浸泡1-2分鐘，吸去（不可

7、觸及板壁）或甩掉酶標(biāo)板內(nèi)的液體，在實(shí)驗(yàn)臺(tái)上鋪墊幾層吸水紙，酶標(biāo)板朝下用力拍幾次；根據(jù)需要，重復(fù)此過(guò)程數(shù)次。2、自動(dòng)洗板：如果有自動(dòng)洗板機(jī)，應(yīng)在熟練使用后再用到正式實(shí)驗(yàn)過(guò)程中。特異性本試劑盒可同時(shí)檢測(cè)重組或天然的人INH ，且與其它相關(guān)蛋白無(wú)交叉反應(yīng)。計(jì)算各標(biāo)準(zhǔn)品及樣本值扣除空白孔值后作圖（七點(diǎn)圖），如設(shè)置復(fù)孔，則應(yīng)取其平均值計(jì)算。以標(biāo)準(zhǔn)品的濃度為縱坐標(biāo)（對(duì)數(shù)坐標(biāo)），值為橫坐標(biāo)（對(duì)數(shù)坐標(biāo)），在對(duì)數(shù)坐標(biāo)紙上繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線。推薦使用專(zhuān)業(yè)制作曲線軟件進(jìn)行分析，如curve expert 1.3，根據(jù)樣品值，由標(biāo)準(zhǔn)曲線查出相應(yīng)的濃度，乘以稀釋倍數(shù)； 或用標(biāo)準(zhǔn)物的濃度與 值計(jì)算出標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程式， 將樣

8、品的 值代入方程式，計(jì)算出樣品濃度，再乘以稀釋倍數(shù)，即為樣品的實(shí)際濃度。檢測(cè)范圍：2,000 pg/ml62.5 pg/ml - 4,000 pg/ml， 1,000 pg/ml，500 pg/ml，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線請(qǐng)取用以下濃度值：4,000 pg/ml，250 pg/ml， 125 pg/ml，62.5 pg/ml。，最低檢測(cè)限 ： 15.6 pg/ml說(shuō)明1 、 由于現(xiàn)有條件及科學(xué)技術(shù)水平尚不能對(duì)所有供貨商提供的所有原料進(jìn)行全面的鑒定與分析，本產(chǎn)品可能存在一定的質(zhì)量技術(shù)風(fēng)險(xiǎn)。2 、 最終的實(shí)驗(yàn)結(jié)果與試劑的有效性、實(shí)驗(yàn)者的相關(guān)操作以及當(dāng)時(shí)的實(shí)驗(yàn)環(huán)境密切相關(guān)，請(qǐng)務(wù)必準(zhǔn)備充足的標(biāo)本備份。3 、 只有全部使用ELISA試劑盒才能保證檢測(cè)效果，因?yàn)樗性噭┒际怯嘘P(guān)聯(lián)的，不能混用其他制造商的產(chǎn)品。只有嚴(yán)格遵守 ELISA 試劑盒的實(shí)驗(yàn)說(shuō)明才會(huì)得到最佳的檢測(cè)結(jié)果。如果由于實(shí)驗(yàn)者的操作失誤或試劑盒保存不當(dāng)導(dǎo)致結(jié)果不佳，不屬產(chǎn)品質(zhì)量問(wèn)題。4 、在儲(chǔ)存及溫育過(guò)程中避免將試劑暴露在強(qiáng)光中。所有試劑瓶蓋須蓋緊以防止蒸發(fā)和微生物的污染，因?yàn)榈鞍姿饷傅母蓴_將導(dǎo)致出現(xiàn)錯(cuò)誤的結(jié)果。5、 試劑盒保存：請(qǐng)收到試劑盒后盡快將標(biāo)準(zhǔn)品、檢測(cè)溶液A 和檢測(cè)溶液 B 保存于 -20，其余試劑短期保存請(qǐng)置于4 ，長(zhǎng)期保存則置于 -20 。開(kāi)封后的