SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳簡(jiǎn)單原理和步驟

1、實(shí)驗(yàn)十五、實(shí)驗(yàn)十五、SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳聚丙烯酰胺凝膠電泳一、概述一、概述 蛋白質(zhì)的聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）是蛋白質(zhì)分析過(guò)程中最常用的技術(shù)，通常在電泳分離時(shí)，其遷移率主要取決于蛋白質(zhì)本身所帶的電荷多少、分子量大小和形態(tài)。但如在PAGE中加入陰離子去污劑SDS, SDS將蛋白質(zhì)的二硫鍵、氫鍵及梳水鍵打開(kāi)，使蛋白質(zhì)變性， SDS將包裹在變性蛋白表面，使蛋白質(zhì)成為剛性分子；同時(shí)，由于SDS帶有大量負(fù)電荷，使蛋白質(zhì)本身帶有的電荷可忽略。至此情況下，不同蛋白質(zhì)分子的遷移率主要決定于帶有的SDS量，即蛋白質(zhì)分子的大小。因此利用SDS-PAGE可測(cè)定蛋白質(zhì)的分子量。二、試劑二、試劑A. 丙烯酰胺

2、和甲叉雙丙烯酰胺單體溶液(Acr和Bis) 稱取丙烯酰胺30g，甲叉雙丙烯酰胺0.8g，加水至100ml，過(guò)濾后存于棕色瓶中，于4保存。B. 4X分離膠緩沖液分離膠緩沖液 稱取Tris 1817g，加入10%SDS貯備液4ml，用12mol/L HCl調(diào)pH至8，8，定容至100ml。C. 4X濃縮膠緩沖液濃縮膠緩沖液 稱取Tris 6.06g，加入10%SDS 4ml，用l2mol/L HCI調(diào)pH至68，定容至100ml。D. 10%過(guò)硫酸銨過(guò)硫酸銨 稱取過(guò)硫酸銨0.5g，加水至5ml。本儲(chǔ)存液應(yīng)現(xiàn)配現(xiàn)用。E. 10X電極緩沖液 稱取Tris 30g、甘氨酸144g，加入10%SDSl00

3、ml，定容至1000ml。F. 2X樣品緩沖液 稱取蔗糖2g(或甘油2m1)，加入10% SDS 2ml，溴酚藍(lán)0.25mg，濃縮膠緩沖液2.5ml、-巰基乙醇0.5ml，加水定容至10ml。G. 染色液 稱取考馬斯亮藍(lán)R-250 2.5g，加入甲醇450ml，冰乙酸l00ml、水650ml。 H. 脫色液 甲醇100ml，冰乙酸100ml，加水800m1.三、操作步驟三、操作步驟1、分離膠的制備、分離膠的制備(1). 根據(jù)所分離的蛋白質(zhì)分子量選擇分離膠分離膠的濃度，制備不同濃度的凝膠所需的儲(chǔ)備液可參考下表，該配方可配制0.75mm厚、10cm X 7cm的凝膠。在配制凝膠時(shí)，將水、30Acr

4、和Bis儲(chǔ)液、4X分離膠儲(chǔ)液混合完全后，真空脫氣5分鐘，然后加入過(guò)硫酸胺和TEMED，立即準(zhǔn)備灌制凝膠。 (2). 將混合液充分混合后，緩慢地倒入已經(jīng)固定在夾心垂直平板電泳槽里的狹槽中，注意在本操作過(guò)程中不能產(chǎn)生任何氣泡。然后盡快地在分離膠的上面輕輕地覆蓋一層水。(3). 置于室溫下15-30分鐘，使凝膠聚合完全 (在水相和凝膠的交界處有一明顯的亮線)。除去上層水相，然后再用水或濃縮膠緩沖液(0.125mol/m1Tris-HCI，pH6.8, 0.1%SDS) 洗凝膠表面，準(zhǔn)備灌制濃縮膠。不同濃度凝膠的制備不同濃度凝膠的制備 成 份不同濃度所需的儲(chǔ)備液體積 8.5%10%12.51517.5

5、%H2030% Acr和Bis分離膠4X緩沖液10% 過(guò)硫酸銨TEMED3.5ml2.0mll.9ml112 u15 ul3.1ml2.4ml1.9ml112 ul5 ul2.5ml3.Oml1.9ml112 ul5 ul1.8ml3.7ml1.9ml112 ul5 ul1.2ml4.3ml1.9ml112ul5ul 2. 濃縮膠制備的方法濃縮膠制備的方法(1). 將丙烯酰胺和甲叉雙丙烯酰胺單體儲(chǔ)備液0.6ml，濃縮膠緩沖液888u1、水2ml、10過(guò)硫酸銨56ul、TEMEDl0ul混合均勻后，立即灌膠。(2). 將預(yù)先制備好的濃縮膠濃縮膠慢慢地灌進(jìn)狹槽中， 然后將所需的樣品梳(形成加樣孔)

6、插于夾心槽上部，并上下輕輕拉動(dòng)梳子，小心地去除粘附在梳齒頂部的小氣泡，待聚合完全后即可拔去梳子，準(zhǔn)備電泳。3. 樣品制備及電泳樣品制備及電泳(1). 樣品處理樣品處理：蛋白質(zhì)樣品和分子量標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)在上樣電泳前均需變性。通常是將樣品蛋白質(zhì)溶液與等體積的樣品緩沖液混合后置于eppendorf管中，將混合物置于95-100加熱5分鐘，立即置于冰上，或于-20儲(chǔ)存，以便再次分析時(shí)使用。(2). 上樣上樣：樣品制備好以后，即可上樣電泳。先將樣品梳子移去，用雙蒸水淋洗每個(gè)樣品孔，然后在樣品孔中加入電泳緩沖液，同時(shí)在電泳槽中也加滿電泳緩沖液。處理完畢后，根據(jù)實(shí)驗(yàn)的需要加樣電泳。(3). 電泳電泳：通常使用穩(wěn)流的方式進(jìn)行電泳，電流一般為18mA，時(shí)間大約3-4小時(shí)。4、凝膠的染色與脫色、凝膠的染色與脫色A. 電泳完畢后，倒去電泳緩沖液，取出夾心槽。小心地取出凝膠，置于染色液中染色4小時(shí)，并不時(shí)地輕輕晃動(dòng)。染色完畢后，倒去染色液，用少量水淋洗凝膠，然后置于脫色液中脫色，并輕