幾種PCR擴(kuò)增的比較

1、普通PCR、原位PCR、反向PCR和反轉(zhuǎn)錄PCR的基本原理和操作步驟普通PCR1概述 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Polymerase Chain Reaction)，簡(jiǎn)稱(chēng)PCR，是一種分子生物學(xué)技術(shù)，用于放大特定的DNA片段。可看作生物體外的特殊DNA復(fù)制。DNA聚合酶（DNA polymerase I）最早于1955年發(fā)現(xiàn)，而較具有實(shí)驗(yàn)價(jià)值及實(shí)用性的Klenow fragment of E. Coli 則是于70年代的初期由Dr. H. Klenow 所發(fā)現(xiàn)，但由于此酶不耐高溫，高溫能使之變性, 因此不符合使用高溫變性的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)?，F(xiàn)今所使用的酶(簡(jiǎn)稱(chēng)Taq polymerase), 則是于197

2、6年從溫泉中的細(xì)菌（Thermus aquaticus）分離出來(lái)的。它的特性就在于能耐高溫，是一個(gè)很理想的酶，但它被廣泛運(yùn)用則于80年代之后。PCR最初的原始雛形概念是類(lèi)似基因修復(fù)復(fù)制，它是于1971年由 Dr. Kjell Kleppe 提出。他發(fā)表了第一個(gè)單純且短暫性基因復(fù)制（類(lèi)似PCR前兩個(gè)周期反應(yīng)）的實(shí)驗(yàn)。而現(xiàn)今所發(fā)展出來(lái)的PCR則于1983由 Dr. Kary B. Mullis發(fā)展出的，Dr. Mullis當(dāng)年服務(wù)于PE公司，因此PE公司在PCR界有著特殊的地位。Dr. Mullis 并于1985年與Saiki 等人正式發(fā)表了第一篇相關(guān)的論文。此后，PCR的運(yùn)用一日千里，相關(guān)的論文

3、發(fā)表質(zhì)量可以說(shuō)是令眾多其它研究方法難望其項(xiàng)背。隨后PCR技術(shù)在生物科研和臨床應(yīng)用中得以廣泛應(yīng)用，成為分子生物學(xué)研究的最重要技術(shù)。Mullis也因此獲得了1993年諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。 2 PCR原理 PCR技術(shù)的基本原理類(lèi)似于DNA的天然復(fù)制過(guò)程，其特異性依賴于與靶序列兩端互補(bǔ)的寡核苷酸引物。PCR由變性-退火-延伸三個(gè)基本反應(yīng)步驟構(gòu)成：模板DNA的變性：模板DNA經(jīng)加熱至93左右一定時(shí)間后，使模板DNA雙鏈或經(jīng)PCR擴(kuò)增形成的雙鏈DNA解離，使之成為單鏈，以便它與引物結(jié)合，為下輪反應(yīng)作準(zhǔn)備；模板DNA與引物的退火(復(fù)性)：模板DNA經(jīng)加熱變性成單鏈后，溫度降至55左右，引物與模板DNA單鏈的互補(bǔ)序

4、列配對(duì)結(jié)合；引物的延伸：DNA模板-引物結(jié)合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP（脫氧核糖核苷三磷酸）為反應(yīng)原料，靶序列為模板，按堿基互補(bǔ)配對(duì)與半保留復(fù)制原理，合成一條新的與模板DNA 鏈互補(bǔ)的半保留復(fù)制鏈，重復(fù)循環(huán)變性-退火-延伸三過(guò)程就可獲得更多的“半保留復(fù)制鏈”，而且這種新鏈又可成為下次循環(huán)的模板。每完成一個(gè)循環(huán)需24分鐘，23小時(shí)就能將待擴(kuò)目的基因擴(kuò)增放大幾百萬(wàn)倍。 3. PCR反應(yīng)體系與反應(yīng)條件3.1標(biāo)準(zhǔn)的PCR反應(yīng)體系 10擴(kuò)增緩沖液 10l 4種dNTP混合物 200l 引物 10100l 模板DNA 0.12g Taq DNA聚合酶 2.5 l Mg2+ 1.5mmol/

5、L 加雙或三蒸水 100 l 3.2 PCR反應(yīng)五要素參加PCR反應(yīng)的物質(zhì)主要有五種即引物(PCR引物為DNA片段，細(xì)胞內(nèi)DNA復(fù)制的引物為一段RNA鏈)、酶、dNTP、模板和緩沖液（其中需要Mg2+)。PCR步驟標(biāo)準(zhǔn)的PCR過(guò)程分為三步： 1.DNA變性（90-96）：雙鏈DNA模板在熱作用下，氫鍵斷裂，形成單鏈DNA 2.退火（25-65）：系統(tǒng)溫度降低，引物與DNA模板結(jié)合，形成局部雙鏈。 3.延伸（70-75）：在Taq酶（在72左右，活性最佳）的作用下，以dNTP為原料，從引物的5端3端延伸，合成與模板互補(bǔ)的DNA鏈。 每一循環(huán)經(jīng)過(guò)變性、退火和延伸，DNA含量即增加一倍?，F(xiàn)在有些PC

6、R因?yàn)閿U(kuò)增區(qū)很短，即使Taq酶活性不是最佳也能在很短的時(shí)間內(nèi)復(fù)制完成，因此可以改為兩步法，即退火和延伸同時(shí)在60-65間進(jìn)行，以減少一次升降溫過(guò)程，提高了反應(yīng)速度。 4 PCR反應(yīng)特點(diǎn)4.1特異性強(qiáng) PCR反應(yīng)的特異性決定因素為： 底物與模板DNA特異正確的結(jié)合； 堿基配對(duì)原則； Taq DNA聚合酶合成反應(yīng)的忠實(shí)性； 基因的特異性與保守性。 其中引物與模板的正確結(jié)合是關(guān)鍵。引物與模板的結(jié)合及引物鏈的延伸是遵循堿基配對(duì)原則的。聚合酶合成反應(yīng)的忠實(shí)性及Taq DNA聚合酶耐高溫性，使反應(yīng)中模板與引物的結(jié)合(復(fù)性)可以在較高的溫度下進(jìn)行，結(jié)合的特異性大大增加，被擴(kuò)增的靶基因片段也就能保持很高的正確

7、度。再通過(guò)選擇特異性和保守性高的靶基因區(qū)，其特異性程度就更高。 4.2 靈敏度高PCR產(chǎn)物的生成量是以指數(shù)方式增加的，能將皮克(pg=10-12)量級(jí)的起始待測(cè)模板擴(kuò)增到微克(g=10-6)水平。能從100萬(wàn)個(gè)細(xì)胞中檢出一個(gè)靶細(xì)胞；在病毒的檢測(cè)中，PCR的靈敏度可達(dá)3個(gè)RFU(空斑形成單位)；在細(xì)菌學(xué)中最小檢出率為3個(gè)細(xì)菌。4.3簡(jiǎn)便、快速PCR反應(yīng)用耐高溫的Taq DNA聚合酶，一次性地將反應(yīng)液加好后，即在DNA擴(kuò)增液和水浴鍋上進(jìn)行變性-退火-延伸反應(yīng)，一般在24 小時(shí)完成擴(kuò)增反應(yīng)。擴(kuò)增產(chǎn)物一般用電泳分析，不一定要用同位素，無(wú)放射性污染、易推廣。4.4對(duì)標(biāo)本的純度要求低不需要分離病毒或細(xì)菌及

8、培養(yǎng)細(xì)胞，DNA 粗制品及RNA均可作為擴(kuò)增模板?？芍苯佑门R床標(biāo)本如血液、體腔液、洗嗽液、毛發(fā)、細(xì)胞、活組織等DNA擴(kuò)增檢測(cè)。 5 PCR常見(jiàn)問(wèn)題 5.1假陰性，不出現(xiàn)擴(kuò)增條帶PCR反應(yīng)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)有模板核酸的制備，引物的質(zhì)量與特異性，酶的質(zhì)量， PCR循環(huán)條件。尋找原因亦應(yīng)針對(duì)上述環(huán)節(jié)進(jìn)行分析研究。 模板：模板中含有雜蛋白質(zhì)，模板中含有Taq酶抑制劑，模板中蛋白質(zhì)沒(méi)有消化除凈，特別是染色體中的組蛋白，在提取制備模板時(shí)丟失過(guò)多，或吸入酚。模板核酸變性不徹底。在酶和引物質(zhì)量好時(shí)，不出現(xiàn)擴(kuò)增帶，極有可能是標(biāo)本的消化處理，模板核酸提取過(guò)程出了毛病，因而要配制有效而穩(wěn)定的消化處理液，其程序亦應(yīng)固定不宜隨

9、意更改。 酶失活：需更換新酶，或新舊兩種酶同時(shí)使用，以分析是否因酶的活性喪失或不夠而導(dǎo)致假陰性。需注意的是有時(shí)忘加Taq酶或溴乙錠。 引物：引物質(zhì)量、引物的濃度、兩條引物的濃度是否對(duì)稱(chēng)，是PCR失敗或擴(kuò)增條帶不理想、容易彌散的常見(jiàn)原因。有些批號(hào)的引物合成質(zhì)量有問(wèn)題，兩條引物一條濃度高，一條濃度低，造成低效率的不對(duì)稱(chēng)擴(kuò)增，對(duì)策為：選定一個(gè)好的引物合成單位。引物的濃度不僅要看OD值，更要注重引物原液做瓊脂糖凝膠電泳，一定要有引物條帶出現(xiàn)，而且兩引物帶的亮度應(yīng)大體一致，如一條引物有條帶，一條引物無(wú)條帶，此時(shí)做PCR有可能失敗，應(yīng)和引物合成單位協(xié)商解決。如一條引物亮度高，一條亮度低，在稀釋引物時(shí)要平衡

10、其濃度。引物應(yīng)高濃度小量分裝保存，防止多次凍融或長(zhǎng)期放冰箱冷藏部分，導(dǎo)致引物變質(zhì)降解失效。引物設(shè)計(jì)不合理，如引物長(zhǎng)度不夠，引物之間形成二聚體等。Mg2+濃度：Mg2+濃度對(duì)PCR擴(kuò)增效率影響很大，濃度過(guò)高可降低PCR擴(kuò)增的特異性，濃度過(guò)低則影響PCR擴(kuò)增產(chǎn)量甚至使PCR擴(kuò)增失敗而不出擴(kuò)增條帶。反應(yīng)體積的改變：通常進(jìn)行PCR擴(kuò)增采用的體積為20ul、30ul、50ul或100ul，應(yīng)用多大體積進(jìn)行PCR擴(kuò)增，是根據(jù)科研和臨床檢測(cè)不同目的而設(shè)定，在做小體積如20ul后，再做大體積時(shí)，一定要模索條件，否則容易失敗。 物理原因：變性對(duì)PCR擴(kuò)增來(lái)說(shuō)相當(dāng)重要，如變性溫度低，變性時(shí)間短，極有可能出現(xiàn)假陰性

11、;退火溫度過(guò)低，可致非特異性擴(kuò)增而降低特異性擴(kuò)增效率，退火溫度過(guò)高影響引物與模板的結(jié)合而降低PCR擴(kuò)增效率。有時(shí)還有必要用標(biāo)準(zhǔn)的溫度計(jì)，檢測(cè)一下擴(kuò)增儀或水溶鍋內(nèi)的變性、退火和延伸溫度。靶序列變異：如靶序列發(fā)生突變或缺失，影響引物與模板特異性結(jié)合，或因靶序列某段缺失使引物與模板失去互補(bǔ)序列，其PCR擴(kuò)增是不會(huì)成功的。 5.2假陽(yáng)性出現(xiàn)的PCR擴(kuò)增條帶與目的靶序列條帶一致，有時(shí)其條帶更整齊，亮度更高。 引物設(shè)計(jì)不合適：選擇的擴(kuò)增序列與非目的擴(kuò)增序列有同源性，因而在進(jìn)行PCR擴(kuò)增時(shí)，擴(kuò)增出的PCR產(chǎn)物為非目的性的序列。靶序列太短或引物太短，容易出現(xiàn)假陽(yáng)性。需重新設(shè)計(jì)引物。 靶序列或擴(kuò)增產(chǎn)物的交叉污染

12、：這種污染有兩種原因：一是整個(gè)基因組或大片段的交叉污染，導(dǎo)致假陽(yáng)性。這種假陽(yáng)性可用以下方法解決：操作時(shí)應(yīng)小心輕柔，防止將靶序列吸入加樣槍內(nèi)或?yàn)R出離心管外。除酶及不能耐高溫的物質(zhì)外，所有試劑或器材均應(yīng)高壓消毒。所用離心管及樣進(jìn)槍頭等均應(yīng)一次性使用。必要時(shí)，在加標(biāo)本前，反應(yīng)管和試劑用紫外線照射，以破壞存在的核酸。二是空氣中的小片段核酸污染，這些小片段比靶序列短，但有一定的同源性?？苫ハ嗥唇?，與引物互補(bǔ)后，可擴(kuò)增出PCR產(chǎn)物，而導(dǎo)致假陽(yáng)性的產(chǎn)生，可用巢式PCR方法來(lái)減輕或消除。 5.3 出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增帶PCR擴(kuò)增后出現(xiàn)的條帶與預(yù)計(jì)的大小不一致，或大或小，或者同時(shí)出現(xiàn)特異性擴(kuò)增帶與非特異性擴(kuò)增帶。非

13、特異性條帶的出現(xiàn)，其原因：一是引物與靶序列不完全互補(bǔ)、或引物聚合形成二聚體。二是Mg2+濃度過(guò)高、退火溫度過(guò)低，及PCR循環(huán)次數(shù)過(guò)多有關(guān)。其次是酶的質(zhì)和量，往往一些來(lái)源的酶易出現(xiàn)非特異條帶而另一來(lái)源的酶則不出現(xiàn)，酶量過(guò)多有時(shí)也會(huì)出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增。其對(duì)策有：必要時(shí)重新設(shè)計(jì)引物。減低酶量或調(diào)換另一來(lái)源的酶。降低引物量，適當(dāng)增加模板量，減少循環(huán)次 數(shù)。適當(dāng)提高退火溫度或采用二溫度點(diǎn)法(93變性，65左右退火與延伸)。 5.4出現(xiàn)片狀拖帶或涂抹帶PCR擴(kuò)增有時(shí)出現(xiàn)涂抹帶或片狀帶或地毯樣帶。其原因往往由于酶量過(guò)多或酶的質(zhì)量 差，dNTP濃度過(guò)高，Mg2+濃度過(guò)高，退火溫度過(guò)低，循環(huán)次數(shù)過(guò)多引起。其對(duì)策有

14、：減少酶量，或調(diào)換另一來(lái)源的酶。減少dNTP的濃度。適當(dāng)降低Mg2+濃 度。增加模板量，減少循環(huán)次數(shù)。原位PCR在科學(xué)研究中，每一項(xiàng)新技術(shù)的創(chuàng)立都會(huì)帶來(lái)一系列新的研究成果問(wèn)世，從而推動(dòng)著各學(xué)科的發(fā)展?？v觀形態(tài)研究領(lǐng)域，50年代電子顯微鏡引入形態(tài)學(xué)觀察領(lǐng)域，帶來(lái)了從細(xì)胞水平到亞細(xì)胞水平的深入研究；60-70年代，免疫組織化學(xué)與免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)的廣泛應(yīng)用，又將觀察的水平由亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)推向了蛋白質(zhì)分子水平，使細(xì)胞內(nèi)眾多的活性物質(zhì)得以進(jìn)行細(xì)胞或亞細(xì)胞水平的定位，對(duì)醫(yī)學(xué)生物學(xué)的發(fā)展無(wú)疑產(chǎn)生了深刻的影響。70年代，分子生物學(xué)技術(shù)在形態(tài)學(xué)中的廣泛應(yīng)用，隨著原位雜交技術(shù)的出現(xiàn)，使組織細(xì)胞內(nèi)特定的DNA或RNA序

15、列能夠被定位，將蛋白質(zhì)水平又提高到基因水平即核酸分子的觀察和定位，從而使人類(lèi)對(duì)許多生命現(xiàn)象在基因水平上的認(rèn)識(shí)得以深化；80年代，分子生物學(xué)領(lǐng)域中一項(xiàng)具有強(qiáng)大生命力的技術(shù)PCR多聚酶鏈反應(yīng)技術(shù)問(wèn)世了，很快地就被引入形態(tài)學(xué)觀察的領(lǐng)域，使細(xì)胞內(nèi)低拷貝或單拷貝的特定DNA或RNA得以進(jìn)行定位及觀察。這一技術(shù)的問(wèn)世，必將帶來(lái)更多的研究成果，使形態(tài)學(xué)的研究又向前邁出一大步。 1基本原理原位PCR技術(shù)的基本原理，就是將PCR技術(shù)的高效擴(kuò)增與原位雜交的細(xì)胞定位結(jié)合起來(lái)，從而在組織細(xì)胞原位檢測(cè)單拷貝或低拷貝的特定的DNA或RNA序列。 PCR技術(shù)是在DNA聚合酶的作用下，經(jīng)過(guò)模板的變性、退火和引物延伸三種循環(huán)，

16、將引物引導(dǎo)下的特異性靶序列迅速地進(jìn)行擴(kuò)增，經(jīng)過(guò)擴(kuò)增的靶序列（一般能擴(kuò)增106倍），很容易在凝膠電泳或Southern印記雜交中顯示出來(lái)，因此，PCR技術(shù)具有靈敏度高，特異性強(qiáng)的優(yōu)勢(shì)，隨著熱循環(huán)自動(dòng)化的提高與穩(wěn)定也使得PCR技術(shù)的操作簡(jiǎn)便易行。但是，PCR技術(shù)是在液相中進(jìn)行的，在擴(kuò)增前，需將細(xì)胞破壞，從中提取核酸作為模板，因此很難將PCR的結(jié)果與組織細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)聯(lián)系起來(lái)，同時(shí)，也很難判斷含特異性靶序列的細(xì)胞類(lèi)型。 原位PCR技術(shù)成功地將PCR技術(shù)和原位雜交技術(shù)結(jié)合起來(lái)，保持了兩項(xiàng)技術(shù)的優(yōu)勢(shì)又彌補(bǔ)了各自的不足。原位PCR技術(shù)的待檢標(biāo)本一般先經(jīng)化學(xué)固定，以保持組織細(xì)胞的良好形態(tài)結(jié)構(gòu)。細(xì)胞膜和核膜均

17、具有一定的通透性，當(dāng)進(jìn)行PCR擴(kuò)增時(shí)，各種成分，如引物，DNA聚合酶，核苷酸等均可進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)或細(xì)胞核內(nèi)，以固定在細(xì)胞內(nèi)或細(xì)胞核內(nèi)的RNA或DNA為模板，于原位進(jìn)行擴(kuò)增。擴(kuò)增的產(chǎn)物一般分子較大，或互相交織，不易穿過(guò)細(xì)胞膜或在膜內(nèi)外彌散，從而被保留在原位。這樣原有的細(xì)胞內(nèi)單拷貝或低拷貝的特定DNA或RNA序列在原位以呈指數(shù)極擴(kuò)增，擴(kuò)增的產(chǎn)物就很容易被原位雜交技術(shù)檢查。 2基本類(lèi)型根據(jù)在擴(kuò)增反應(yīng)中所用的三磷酸核苷原料或引物是否標(biāo)記，原位PCR技術(shù)可分為直接法和間接法兩大類(lèi)，此外，還有反轉(zhuǎn)錄原位PCR技術(shù)等。 2.1直接法原位PCR技術(shù)直接法原位PCR技術(shù)是將擴(kuò)增的產(chǎn)物直接攜帶標(biāo)記分子，即使用標(biāo)記的三

18、磷酸腺苷或引物片斷。當(dāng)標(biāo)本進(jìn)行PCR擴(kuò)增時(shí)，標(biāo)記的分子就摻入到擴(kuò)增的產(chǎn)物中，顯示標(biāo)記物，就能將特定的DNA或RNA在標(biāo)本（原位）中顯現(xiàn)出來(lái)。常用的標(biāo)記物有放射性同位素35S，生物素和地高辛，用放射性自顯影的方法或用親和組織化學(xué)及免疫組織化學(xué)的方法去顯示標(biāo)記物所在位置。直接法原位PCR技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)是操作簡(jiǎn)便，流程短，省時(shí)。缺點(diǎn)是特異性較差，易出現(xiàn)假陽(yáng)性，擴(kuò)增效率也較低，特別是在石蠟切片上，上述缺點(diǎn)更為突出。因?yàn)樵谥破^(guò)程中，無(wú)論是固定，脫水還是包埋，都會(huì)導(dǎo)致DNA的損害，而受損的DNA可利用反應(yīng)體系中的標(biāo)記三磷酸核苷進(jìn)行修復(fù)，這樣標(biāo)記物就會(huì)摻入到DNA的非靶序列中，造成假陽(yáng)性。若用標(biāo)記引物的方法進(jìn)

19、行直接法原位PCR，其擴(kuò)增的效率比不標(biāo)記更低。 2.2間接法原位PCR技術(shù) 間接法原位PCR技術(shù)師現(xiàn)在細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行特定DNA或RNA擴(kuò)增，再用標(biāo)記的探針進(jìn)行原位雜交，明顯提高了特異性，是目前應(yīng)用最為廣泛的原位PCR技術(shù)。間接法原位PCR與直接法不同的是，反應(yīng)體系與常規(guī)PCR相同，所用的引物或三磷酸腺苷均不帶任何標(biāo)記物。即實(shí)現(xiàn)先擴(kuò)增的目的，然后用原位雜交技術(shù)去檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)已擴(kuò)增的特定的DNA產(chǎn)物，因此，實(shí)際上是將PCR技術(shù)和原位雜交技術(shù)結(jié)合起來(lái)的一種新技術(shù)，故又稱(chēng)之為PCR原位雜交(PCR in situ hybridization , PISH)。 間接法PCR技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)是特異性較高，擴(kuò)增效率也較

20、高。缺點(diǎn)是操作步驟較直接法繁瑣。 2.3原位反轉(zhuǎn)錄PCR技術(shù)原位反轉(zhuǎn)錄PCR(in situ reverse transcription PCR, In Situ RT-PCR)是將液相的RT-PC技術(shù)應(yīng)用到組織細(xì)胞標(biāo)本中的一種新技術(shù)，與RT-PCR（液相）不同點(diǎn)在于，進(jìn)行原位反轉(zhuǎn)錄PCR反應(yīng)之前，組織標(biāo)本要先用DNA酶處理，以破壞組織中的DNA酶，這樣才能保證擴(kuò)增的模板是從mRNA反轉(zhuǎn)錄合成的cDNA，而不是細(xì)胞中原有的DNA。其它基本步驟與液相的RT-PCR相似。 3基本步驟原位PCR技術(shù)的基本步驟包括標(biāo)本的制備。原位擴(kuò)增（PCR）及原位檢測(cè)等基本環(huán)節(jié)，現(xiàn)分述如下（重點(diǎn)以石蠟切片為例）。

21、3.1標(biāo)本的制備原位PCR技術(shù)可應(yīng)用于細(xì)胞懸液、細(xì)胞涂片、冰凍切片以及石蠟切片。相比較而言，以懸浮的完整細(xì)胞做原位PCR效果最好，石蠟切片效果最差。隨著技術(shù)方面的一些問(wèn)題被解決，近年也有從石蠟切片中得到滿意的PCR效率的報(bào)道。效果不好的原因是多方面的，如：玻片上做PCR，熱傳導(dǎo)較差，熱對(duì)流不均勻，TaqDNA酶被玻璃片吸附等，更為主要的原因，可能是標(biāo)本經(jīng)制片后，細(xì)胞缺乏完整的胞漿或核膜，擴(kuò)增產(chǎn)物易發(fā)生彌漫而導(dǎo)致擴(kuò)增的產(chǎn)物在原位不易保留。絕大多數(shù)的病理標(biāo)本都是以福爾馬林固定，石蠟包埋的形式保存的，若能很好地解決石蠟切片原位PCR的有關(guān)技術(shù)問(wèn)題，意義顯然是十分重大的。 組織細(xì)胞的固定:一般認(rèn)為組織

22、細(xì)胞以10%的緩沖福爾馬林或4%的多聚甲醛固定后進(jìn)行原位PCR效果較好。固定的時(shí)間一般不宜過(guò)長(zhǎng)，視組織的大小，一般以44-6小時(shí)為宜。 切片的厚度:一般而言，切片若厚一些，原位PCR的效果也較好一些，因?yàn)榍衅胶瘢蠨NA的含量也就越多，同時(shí)膜結(jié)構(gòu)也較多，防止擴(kuò)增產(chǎn)物彌散的作用也越明顯。但厚切片細(xì)胞重疊多，形態(tài)學(xué)觀察的效果就差了，分辨率也將下降。 玻片的處理:為防止石蠟切片在PCR和原位雜交過(guò)程中脫落，在玻片應(yīng)作防脫片處理，常用的方法是涂以多聚賴氨酸或用硅烷化處理，一般能防止組織脫落。 蛋白酶的消化作用:在進(jìn)行原位擴(kuò)增之前，組織標(biāo)本需經(jīng)蛋白酶處理。經(jīng)蛋白酶消化的組織細(xì)胞，可增加其通透性，充分允

23、許反應(yīng)體系中的各成分進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，并能很好的暴露靶序列，以利于擴(kuò)增。常用的蛋白酶有蛋白酶K，胰蛋白酶或胃蛋白酶。蛋白酶消化的程度就要根據(jù)組織固定的程度進(jìn)行調(diào)整。蛋白酶消化后，要注意加熱以滅活酶的活性或通過(guò)充分的洗滌將酶完全去除，因?yàn)橹灰猩倭康臍埩裘复嬖冢紝?duì)隨后進(jìn)行的PCR反應(yīng)體系的數(shù)量TaqDNA酶產(chǎn)生毀滅性的影響。蛋白酶消化處理組織細(xì)胞可提高通透性，有利于后續(xù)進(jìn)行的各反應(yīng)成分進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)或核內(nèi)，但同時(shí)也使得擴(kuò)增產(chǎn)物的彌散機(jī)會(huì)增多，有可能帶來(lái)假陽(yáng)性或假陰性的結(jié)果。 原位擴(kuò)增（PCR） 原位擴(kuò)增即在組織細(xì)胞標(biāo)本上進(jìn)行PCR反應(yīng)，其基本原理與液相PCR完全相同。 引物:PCR所用的引物一般為15

24、-30bp為宜，擴(kuò)增的片斷為100-1000bp左右。原位PCR宜用較短的引物。從石蠟切片中提取的DNA很少超過(guò)400bp，RNA很少超過(guò)200bp，較長(zhǎng)序列的擴(kuò)增易引起引物與模板的錯(cuò)配而導(dǎo)致非特異性反應(yīng)的出現(xiàn)。 反應(yīng)體系:原位PCR的反應(yīng)體系與常規(guī)的液相PCR基本相同，由于是在經(jīng)過(guò)固定的組織切片上進(jìn)行，為獲得較好的擴(kuò)增效果，有人主張反應(yīng)體系中的引物，TaqDNA聚合酶以及Mg2+的濃度均應(yīng)高于液相的PCR反應(yīng)體系。在反應(yīng)體系中要加入牛血清白蛋白（BSA）,以防止TaqDNA聚合酶與玻片的結(jié)合而降低了擴(kuò)增效率。 熱循環(huán):原位PCR的熱循環(huán)可在專(zhuān)門(mén)的熱循環(huán)儀上進(jìn)行，操作簡(jiǎn)便。也可在一般的PCR熱

25、循環(huán)儀上進(jìn)行，通常在樣品臺(tái)上覆蓋一層鋁箔，制成平臺(tái)，樣品臺(tái)上的空間用礦物油或水充填，將載玻片至于平臺(tái)上，即可進(jìn)行熱循環(huán)的步驟。為了保證進(jìn)行充分的擴(kuò)增，原位PCR熱循環(huán)中每一步驟的時(shí)間可比常規(guī)PCR略長(zhǎng)些，另外，也可采用熱啟動(dòng)（hot start）的方法，即玻片加熱到80-94時(shí)，再立即加入TaqDNA聚合酶。 為了保證反應(yīng)體系在熱循環(huán)過(guò)程不過(guò)多丟失，可用清亮的指甲油，礦物油或PAP筆把蓋片四周封閉起來(lái)。 洗滌:原位擴(kuò)增結(jié)束后，標(biāo)本應(yīng)清洗，以除去彌散到細(xì)胞外的擴(kuò)增產(chǎn)物。洗滌不充分，會(huì)導(dǎo)致擴(kuò)增產(chǎn)物在檢測(cè)時(shí)顯現(xiàn)，造成背景過(guò)深或假陽(yáng)性結(jié)果的出現(xiàn)。但是，洗滌過(guò)度，也會(huì)造成細(xì)胞內(nèi)擴(kuò)增的產(chǎn)物被洗脫，是陽(yáng)性信

26、號(hào)減弱或丟失。有作者在擴(kuò)增后用4%多聚甲醛2小時(shí)或2%戊二醛5分鐘進(jìn)行后固定，以使擴(kuò)增的產(chǎn)物在檢測(cè)時(shí)能很好地保留在細(xì)胞內(nèi)，提高檢測(cè)的敏感性和特異性。 原位檢測(cè):原位PCR的擴(kuò)增產(chǎn)物檢測(cè)方法，取決于原位PCR的設(shè)計(jì)方案，直接法則根據(jù)標(biāo)記分子的性質(zhì)對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物直接進(jìn)行原位檢測(cè)。間接法則需用原位雜交的方法進(jìn)行檢測(cè)。 4原位PCR技術(shù)的應(yīng)用 原位PCR技術(shù)的突出優(yōu)勢(shì)，就是能在組織細(xì)胞原位檢測(cè)出拷貝數(shù)較低的特異性基因序列。按照待測(cè)基因的性質(zhì)，可將原位PCR的應(yīng)用分為檢測(cè)外源性基因和內(nèi)源性基因兩方面。 4.1用于外源性基因的檢測(cè) 4.1.1病毒基因的檢測(cè) 感染病毒的細(xì)胞常無(wú)較好的檢測(cè)手段，但當(dāng)原位PCR技術(shù)

27、應(yīng)用后，使這一極為困難的問(wèn)題有望解決。 對(duì)HIV、HPV、HSV、HBV、HCV等多種病毒的檢測(cè)，使我們能夠成功等觀察到這些病毒在艾滋病、生殖系統(tǒng)腫瘤、肝炎及肝癌中的作用，能夠及時(shí)發(fā)現(xiàn)受感染的人群。 4.1.2細(xì)菌基因的檢測(cè) 最突出的應(yīng)用是在結(jié)核桿菌的檢測(cè)上，當(dāng)結(jié)核病變不夠典型時(shí)，經(jīng)過(guò)特殊染色的方法很難在鏡下找到結(jié)核桿菌，而應(yīng)用原位PCR技術(shù)可幫助明確診斷，當(dāng)結(jié)核桿菌很少時(shí)仍能在鏡下被很容易地找出來(lái)。 4.1.3導(dǎo)入基因的檢測(cè) 在轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的研究中，是否導(dǎo)入了基因，在接受基因治療的患者體內(nèi)，是否接受了導(dǎo)入的基因，均可用原位PCR技術(shù)來(lái)證實(shí)。因此，原位PCR技術(shù)成為重要的檢測(cè)手段。 4.2 用于

28、內(nèi)源性基因的檢測(cè)4.2.1異?；虻臋z測(cè) 機(jī)體內(nèi)基因的突變、重排、也可用原位PCR技術(shù)進(jìn)行檢測(cè)，原癌基因，抑癌基因的突變，惡性淋巴瘤免疫球蛋白重鏈基因的重排，對(duì)腫瘤的研究和診斷無(wú)一均提供了廣闊的應(yīng)用前景。 4.2.2固有基因的檢測(cè) 對(duì)于機(jī)體細(xì)胞內(nèi)只有單個(gè)或幾個(gè)拷貝的低表達(dá)固有基因，原位雜交技術(shù)因基因拷貝數(shù)太少而無(wú)能為力，液相PCR雖可進(jìn)行擴(kuò)增檢測(cè)出來(lái)，但不能確定含有該基因的細(xì)胞類(lèi)型，原位PCR技術(shù)則彌補(bǔ)了上述兩種技術(shù)的不足，使得我們能夠?qū)θ祟?lèi)各種基因進(jìn)行檢測(cè)，而完成人類(lèi)基因圖的繪制。 反向PCR反向PCR(reverse PCR)是用反向的互補(bǔ)引物來(lái)擴(kuò)增兩引物以外的未知序列的片段，而常規(guī)PCR

29、擴(kuò)增的是已知序列的兩引物之間DNA片段.實(shí)驗(yàn)時(shí)選擇已知序列內(nèi)部沒(méi)有切點(diǎn)的限制性內(nèi)切酶對(duì)該段DNA進(jìn)行酶切，然后用連接酶使帶有粘性末端的靶序列環(huán)化連接，再用一對(duì)反向的引物進(jìn)行PCR，其擴(kuò)增產(chǎn)物將含有兩引物外未知序列，從而對(duì)未知序進(jìn)行分析研究. 反向PCR的目的在于擴(kuò)增一段已知序列旁側(cè)的DNA，也就是說(shuō)這一反應(yīng)體系不是在一對(duì)引物之間而是在引物外側(cè)合成DNA。反向PCR可用于研究與已知DNA區(qū)段相連接的未知染色體序列，因此又可稱(chēng)為染色體緩移或染色體步移。這時(shí)選擇的引物雖然與核心DNA區(qū)兩末端序列互補(bǔ)，但兩引物3端是相互反向的。擴(kuò)增前先用限制性內(nèi)切酶酶切樣品DNA，然后用DNA連接酶連接成一個(gè)環(huán)狀DN

30、A分子，通過(guò)反向PCR擴(kuò)增引物的上游片段和下游片段；現(xiàn)已制備了酵母人工染色體（YAC）大的線狀DNA片段的雜交探針，這對(duì)于轉(zhuǎn)座子插入序列的確定和基因庫(kù)染色體上DNA片段序列的識(shí)別十分重要。 PCR只能擴(kuò)增兩端序列已知的基因片段，反向PCR可擴(kuò)增中間一段已知序列，而兩端序列未知的基因片段不擴(kuò)增。 反向PCR的目的在于擴(kuò)增一段已知序列旁側(cè)的DNA，也就是說(shuō)這一反應(yīng)體系不是在一對(duì)引物之間而是在引物外側(cè)合成DNA。反向PCR可用于研究與已知DNA區(qū)段相連接的未知染色體序列，因此又可稱(chēng)為染色體緩移或染色體步移。這時(shí)選擇的引物雖然與核心DNA區(qū)兩末端序列互補(bǔ)，但兩引物3端是相互反向的。擴(kuò)增前先用限制性內(nèi)切

31、酶酶切樣品DNA，然后用DNA連接酶連接成一個(gè)環(huán)狀DNA分子，通過(guò)反向PCR擴(kuò)增引物的上游片段和下游片段；現(xiàn)已制備了酵母人工染色體（YAC）大的線狀DNA片段的雜交探針，這對(duì)于轉(zhuǎn)座子插入序列的確定和基因庫(kù)染色體上DNA片段序列的識(shí)別十分重要。 該方法的不足是：需要從許多酶中選擇限制酶，或者說(shuō)必須選擇一種合適的酶進(jìn)行酶切才能得到合理大小的DNA片段。這種選擇不能在非酶切位點(diǎn)切斷靶DNA。大多數(shù)有核基因組含有大量中度和高度重復(fù)序列，而在YAC或Cosmid中的未知功能序列中有時(shí)也會(huì)有這些序列，這樣，通過(guò)反向PCR得到的探針就有可能與多個(gè)基因序列雜交。 利用反向PCR可對(duì)未知序列擴(kuò)增后進(jìn)行分析，探索

32、鄰接已知DNA片段的序列，并可將僅知部分序列的全長(zhǎng)cDNA進(jìn)行分子克隆，建立全長(zhǎng)的DNA探針。適用于基因游走、轉(zhuǎn)位因子和已知序列DNA旁側(cè)病毒整合位點(diǎn)分析等研究。 用傳統(tǒng)的緩沖液和其他提供者推薦的條件裂解DNA。反向PCR所擴(kuò)增的片段的大小由 PCR擴(kuò)增片段的大小決定，目前，PCR擴(kuò)增的實(shí)際上限為3-4kb。在許多情況下，首先 需要進(jìn)行Southern雜交來(lái)確定內(nèi)切酶用以產(chǎn)生大小適于環(huán)化及反向PCR的片段的末端 片段。能裂解核心區(qū)的內(nèi)切酶使反向PCR只能擴(kuò)增引物所定模板(依賴于引物)的上游 或上游區(qū)，而不裂解核心區(qū)的酶則使兩上邊側(cè)序列都擴(kuò)增，并帶有由內(nèi)切酶和環(huán)化類(lèi) 型決定的接點(diǎn)(例如，互補(bǔ)突頭

33、連接與鈍頭連接)。對(duì)于擴(kuò)增左翼或右翼序列，初試時(shí) 最好靠近識(shí)別上個(gè)堿基位位的酶，并已知在核心區(qū)有其方便的裂解位點(diǎn)。如果用反向 PCR從含有大量不同的克隆片段的同一載體中探測(cè)雜交探針，建議事先在載體中引入 合適的酶切位點(diǎn)。 用T4連接酶在稀DNA濃度下環(huán)化更容易形成單環(huán)。在一些實(shí)驗(yàn)中，為產(chǎn)生對(duì)反向 PCR大小適當(dāng)?shù)腄NA片段需要兩種內(nèi)切酶，但這樣所產(chǎn)生的片段末端則不適于連接，環(huán) 化前需用Klenow或噬菌體T4DNA聚合酶修理(鈍化)。連接前，需用酚或熱變性使內(nèi)切 酶失活。 聚合酶鏈反應(yīng)條件與經(jīng)典所用的相同，例如，94-30秒變性，58-30秒引物退火， Taq聚合酶70延伸3分鐘，進(jìn)行30個(gè)循

34、環(huán)?？筛淖働CR條件以生產(chǎn)特異產(chǎn)物。將反向 PCR用于測(cè)序時(shí)，與核心區(qū)末端后部結(jié)合的擴(kuò)增引物更為有用，它使測(cè)序引物擴(kuò)增部 分的核心序列與未知邊側(cè)序列間的接點(diǎn)更近，減少了擴(kuò)增引物的干擾。 描述一種大聚合酶鏈反應(yīng)應(yīng)用的方法，使在已知序列的核心區(qū)邊側(cè)的未知 成幾何級(jí)數(shù)擴(kuò)增用適當(dāng)?shù)南拗菩詢?nèi)切裂解含核心區(qū)的，以產(chǎn)生適合于擴(kuò) 增大小的片段，然后片段的末端再連接形成環(huán)狀分子的引物同源于環(huán)上核心區(qū) 的末端序列，但其方向性，使鏈的延長(zhǎng)經(jīng)過(guò)環(huán)上的未知區(qū)而不是分開(kāi)引物的核心區(qū)這種反向方法可用于擴(kuò)增本來(lái)就在核心區(qū)旁邊的序列，還可應(yīng)用于制備未知序列 探針或測(cè)定邊側(cè)區(qū)域本身的上下游序列。逆轉(zhuǎn)錄PCR1概念RT-PCR 為

35、反轉(zhuǎn)錄RCR（reverse transcription PCR）和實(shí)時(shí)PCR（real time PCR）共同的縮寫(xiě)。逆轉(zhuǎn)錄PCR，或者稱(chēng)反轉(zhuǎn)錄PCR(reverse transcription-PCR, RT-PCR)，是聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)的一種廣泛應(yīng)用的變形。在RT-PCR中，一條RNA鏈被逆轉(zhuǎn)錄成為互補(bǔ)DNA，再以此為模板通過(guò)PCR進(jìn)行DNA擴(kuò)增。 由一條RNA單鏈轉(zhuǎn)錄為互補(bǔ)DNA(cDNA)稱(chēng)作“逆轉(zhuǎn)錄”，由依賴RNA的DNA聚合酶（逆轉(zhuǎn)錄酶）來(lái)完成。隨后，DNA的另一條鏈通過(guò)脫氧核苷酸引物和依賴DNA的DNA聚合酶完成，隨每個(gè)循環(huán)倍增，即通常的PCR。原先的RNA模板被RNA酶 H降解，留下互補(bǔ)DNA。 RT-PCR的指數(shù)擴(kuò)增是一種很靈敏的技術(shù)，可以檢測(cè)很低拷貝數(shù)的RNA。RT-PCR廣泛應(yīng)用于遺傳病的診斷，