遺傳實驗（Word）

1、實驗五 細菌質(zhì)粒DNA的提取一 實驗?zāi)康?掌握堿裂解法提取質(zhì)粒的方法。二、實驗內(nèi)容 本實驗涉及細菌內(nèi)質(zhì)粒的提取方法。三、實驗要求 采用集中授課、學生自主訓練并重的模式組織教學。四、實驗準備 學生需要與質(zhì)粒相關(guān)的知識。五、實驗原理、方法和手段 質(zhì)粒(Plasmid)是一種染色體外的穩(wěn)定遺傳因子，大小從1-200kb 不等，為雙鏈、閉環(huán)的DNA 分子，并以超螺旋狀態(tài)存在于宿主細胞中。質(zhì)粒主要發(fā)現(xiàn)于細菌、放線菌和真菌細胞中，它具有自主復(fù)制和轉(zhuǎn)錄能力，能在子代細胞中保持恒定的拷貝數(shù)并表達所攜帶的遺傳信息。質(zhì)粒的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄要依賴于宿主細胞編碼的某些酶和蛋白質(zhì)，如離開宿主細胞則不能存活。質(zhì)粒通常含有編碼某

2、些酶的基因，如抗生素抗性基因、大腸桿菌素基因、腸毒素基因某些限制性內(nèi)切酶與修飾酶基因等，因而它的存在使宿主具有一些額外的特性。F 質(zhì)粒（又稱F 因子或性質(zhì)粒）、R 質(zhì)粒(抗藥性因子)和Col 質(zhì)粒（產(chǎn)大腸桿菌素因子）等都是常見的天然質(zhì)粒。質(zhì)粒在細胞內(nèi)的復(fù)制一般有兩種類型：緊密控制型（Stringent contro l）和松馳控制型（Relaxed control）。前者只在細胞周期的一定階段進行復(fù)制，當染色體不復(fù)制時，它也不能復(fù)制，通常每個細胞內(nèi)只含有1 個或幾個質(zhì)粒分子，如F 因子。后者的質(zhì)粒在整個細胞周期中隨時可以復(fù)制，在每個細胞中有許多拷貝，一般在20 個以上，如Col E1 質(zhì)粒。在

3、使用蛋白質(zhì)合成抑制劑氯霉素時，細胞內(nèi)蛋白質(zhì)合成、染色體DNA 復(fù)制和細胞分裂均受到抑制，緊密型質(zhì)粒復(fù)制停止，而松馳型質(zhì)粒繼續(xù)復(fù)制質(zhì)?？截悢?shù)可由原來的20 多個擴增至1000-3000個，此時質(zhì)粒DNA 占總DNA 的含量可由原來的2%增加至40-50%。利用同一復(fù)制系統(tǒng)的不同質(zhì)粒不能在同一宿主細胞中共同存在，當兩種質(zhì)粒同時導(dǎo)入同一細胞時,它們在復(fù)制及隨后分配到子細胞的過程中彼此競爭，在一些細胞中，一種質(zhì)粒占優(yōu)勢，而在另一些細胞中另一種質(zhì)粒卻占優(yōu)勢。當細胞生長幾代后，占少數(shù)的質(zhì)粒將會丟失，因而在細胞后代中只有兩種質(zhì)粒的一種，這種現(xiàn)象稱質(zhì)粒的不相容性（Incompatibility）。但利用不同復(fù)

4、制系統(tǒng)的質(zhì)粒則可以穩(wěn)定地共存于同一宿主細胞中。把一個有用的目的DNA片段通過重組DNA技術(shù)，送進受體細胞中去進行繁殖和表達的工具叫載體（Vector）。細菌質(zhì)粒是重組DNA 技術(shù)中常用的載體。質(zhì)粒載體是在天然質(zhì)粒的基礎(chǔ)上為適應(yīng)實驗室操作而進行人工構(gòu)建的。一個理想的克隆載體大致應(yīng)有下列一些特性：（1）分子量小、多拷貝、松馳控制型；（2）具有多種常用的限制性內(nèi)切酶的單切點；（3）能插入較大的外源DNA 片段；（4）具有容易操作的檢測表型。常用的質(zhì)粒載體大小一般在1kb 至10kb 之間，如PBR322、PUC 系列、PGEM 系列和pBS等。與天然質(zhì)粒相比，質(zhì)粒載體通常帶有一個或一個以上的選擇性標

5、記基因（如抗生素抗性基因）和一個人工合成的含有多個限制性內(nèi)切酶識別位點的多克隆位點序列，并去掉了大部分非必需序列，使分子量盡可能減少，以便于基因工程操作。大多數(shù)質(zhì)粒載體帶有一些多用途的輔助序列，這些序列可用于產(chǎn)生序列測定的單鏈DNA、體外轉(zhuǎn)錄外源DNA、鑒定片段的插入方向、外源基因的大量表達等。從細菌中分離質(zhì)粒DNA 的方法都包括3 個基本步驟：培養(yǎng)細菌使質(zhì)粒擴增；收集和裂解細胞；分離和純化質(zhì)粒DNA。采用溶菌酶可以破壞菌體細胞壁，十二烷基磺酸鈉（SDS）和Triton X-100 可使細胞膜裂解。經(jīng)溶菌酶和SDS 或Triton X-100 處理后，細菌染色體DNA 會纏繞附著在細胞碎片上，

6、同時由于細菌染色體DNA 比質(zhì)粒大得多，易受機械力和核酸酶等的作用而被切斷成不同大小的線性片段。當用強熱或酸、堿處理時，細菌的線性染色體DNA 變性，而共價閉合環(huán)狀DNA（covalently closed circular DNA，簡稱cccDNA）的兩條鏈不會相互分開，當外界條件恢復(fù)正常時，線狀染色體DNA 片段難以復(fù)性,，而是與變性的蛋白質(zhì)和細胞碎片纏繞在一起。而質(zhì)粒DNA 雙鏈又恢復(fù)原狀，重新形成天然的超螺旋分子，并以溶解狀態(tài)存在于液相中。在細菌細胞內(nèi)，共價閉環(huán)質(zhì)粒以超螺旋形式存在。在提取質(zhì)粒過程中，除了超螺旋DNA 外，還會產(chǎn)生其它形式的質(zhì)粒DNA。如果質(zhì)粒DNA 兩條鏈中有一條鏈發(fā)

7、生一處或多處斷裂，分子就能旋轉(zhuǎn)而消除鏈的張力，形成松馳型的環(huán)狀分子，稱開環(huán)DNA（Open circular DNA, 簡稱ocDNA）；如果質(zhì)粒DNA 的兩條鏈在同一處斷裂，則形成線狀DNA（Linear DNA2 / 14）。當提取的質(zhì)粒DNA 電泳時，同一質(zhì)粒DNA 其超螺旋形式的泳動速度要比開環(huán)和線狀分子的泳動速度快。六、實驗條件（一）菌株含PUCm-T 質(zhì)粒的大腸桿菌（E. coli）DH5菌株。（二）實驗儀器及用具1.5 mL Eppendorf離心管，微量取液器，臺式高速離心機，恒溫振蕩搖床，高壓蒸汽消毒器(滅菌鍋)，渦旋振蕩器，電泳儀，瓊脂糖平板電泳裝置和恒溫水浴鍋等。（三）藥

8、品和試劑1LB 液體培養(yǎng)基（Luria-Bertani）：稱取蛋白胨（Tryptone）10 g，酵母提取物（Yeast extract） 5 g，NaCl 10 g，溶于800 mL去離子水中，用NaOH調(diào)pH至7.5, 加去離子水至總體積1 L，高壓下蒸氣滅菌20 分鐘。2LB 固體培養(yǎng)基：液體培養(yǎng)基中每升加12 g瓊脂粉，高壓滅菌。3氨芐青霉素（Ampicillin，Amp）)母液：配成5 mg/ml水溶液, -20保存?zhèn)溆谩?溶菌酶溶液：用10 mmol/L Tris·HCl（pH8.0）溶液配制成10 mg/mL，并分裝成小份保存于-20，每一小份一經(jīng)使用后便予丟棄。53

9、mol/L NaAc（pH5.2）： 50 mL水中溶解40.81 g NaAc·3H2O，用冰醋酸調(diào)pH至5.2, 加水定容至100 mL, 分裝后高壓滅菌，于4貯存?zhèn)溆谩?溶液：50 mmol/L葡萄糖，25 mmol/L Tris-HCl（pH8.0），10 mmol/L EDTA （pH8.0）。 溶液可成批配制，每瓶100 mL，壓滅菌15 分鐘，于4貯存?zhèn)溆谩?溶液：0.2 mol/L NaOH（臨用前用10 mol/L NaOH母液稀釋），1 SDS。8溶液：5 mol/L KAc 60 mL，冰醋酸 11.5 mL，H2O 28.5 mL，定容至100 mL, 并高壓

10、滅菌。9RNA 酶A 母液：將RNA 酶A 溶于10 mmol/L Tris-HCl（pH7.5），15 mmol/L NaCl 中,配成10 mg/mL的溶液，于100加熱15 分鐘，使混有的DNA 酶失活。冷卻后用1.5 mL Eppendorf 管分裝成小份保存于-20。10Tris飽和酚：市售酚中含有醌等氧化物，這些產(chǎn)物可引起磷酸二酯鍵的斷裂及導(dǎo)致RNA 和DNA的交聯(lián)，應(yīng)在160用冷凝管進行重蒸。重蒸酚加入0.1的8-羥基喹啉（作為抗氧化劑），并用等體積的0.5 mol/L Tris-HCl（pH8.0）和0.1 mol/L Tris-HCl l（pH8.0）緩沖液反復(fù)抽提使之飽和并

11、使其pH 值達到7.6以上，因為酸性條件下DNA 會分配于有機相。11按氯仿異戊醇241體積比在氯仿中加入異戊醇。氯仿可使蛋白變性并有助于液相與有機相的分開，異戊醇則可起消除抽提過程中出現(xiàn)的泡沫。 按體積/體積11 混合上述飽和酚與氯仿即得酚/氯仿（11）。酚和氯仿均有很強的腐蝕性，操作時應(yīng)戴手套。12TE 緩沖液：10 mmo/L Tris-HCl（pH8.0），1 mmol/L EDTA（pH8.0）。高壓滅菌后儲存于4。13STET：0.1 mol/L NaCl，10 mmol/L Tris-HCl（pH8.0），10 mmol/L EDTA（pH8.0），5% Triton X-100

12、。14STE：0.1 mol/L NaCl，10 mmol/L Tris-HCl（pH8.0），1 mmol/L EDTA（pH8.0）。七、實驗步驟（一）細菌的培養(yǎng)和收集期。將含有質(zhì)粒pUCm-T 的DH5菌種接種在LB 固體培養(yǎng)基（含50 g/mL Amp）中，37培養(yǎng)12-24小時。用無菌牙簽挑取單菌落接種到5 mL LB液體培養(yǎng)基（含50 g/mL Amp）中，37振蕩培養(yǎng)約12小時至對數(shù)生長后期。（二）質(zhì)粒DNA 的提取質(zhì)粒DNA 小量提取法對于從大量轉(zhuǎn)化子中制備少量部分純化的質(zhì)粒DNA 十分有用。這些方法共同特點是簡便、快速，能同時處理大量樣品，所得DNA 有一定純度，可滿足限制酶

13、切割、電泳分析的需要。1煮沸法（1）將1.5 mL 培養(yǎng)液倒入Eppendorf 管中，4下12 000 rpm（revolutions per minute，轉(zhuǎn)/分）離心30秒。（2）棄上清，將管倒置于衛(wèi)生紙上幾分鐘，使液體流盡。（3）將菌體沉淀懸浮于120 L STET溶液中，渦旋混勻。（4）加入10 L新配制的溶菌酶溶液（10 mg/mL），渦旋振蕩3秒鐘。（5）將Eppendorf 管放入沸水浴中，50秒后立即取出。（6）用微量離心機4下12 000 rpm 離心10分鐘。（7）用無菌牙簽從Eppendorf 管中去除細菌碎片。（8）取20L 進行電泳檢查。 注意（

14、1）對大腸桿菌可從固體培養(yǎng)基上挑取單個菌落直接進行煮沸法提取質(zhì)粒DNA。（2）提取的質(zhì)粒DNA 中會含有RNA，但RNA 并不干擾進一步實驗，如限制性內(nèi)切酶消化,，亞克隆及連接反應(yīng)等。2堿法（乙醇沉淀）（1）取1.5mL培養(yǎng)液倒入1.5mL Eeppendorf 管中，4下12000 rpm 離心30 秒。（2）棄上清，將管倒置于衛(wèi)生紙上數(shù)分鐘，使液體流盡。（3）菌體沉淀重懸浮于100L 溶液中(需劇烈振蕩)，室溫下放置5-10分鐘。（4）加入新配制的溶液200L, 蓋緊管口，快速溫和顛倒Eppendorf管數(shù)次，以混勻內(nèi)容物，冰浴5 分鐘。（5）加入150L 預(yù)冷的溶液，蓋緊管口，并倒置離心

15、管，溫和振蕩10秒，使沉淀混勻，冰浴中5-10分鐘，4下12 000 rpm離心5-10 分鐘。（6）上清液移入干凈的Eppendorf管中，加入等體積的酚/氯仿，振蕩混勻，4下12 000 rpm離心5分鐘。（7）將水相移入干凈Eppendorf管中，加入2 倍體積的無水乙醇，振蕩混勻后置于-20冰箱中20分鐘，然后4下12 000 rpm 離心10 分鐘。（8）棄上清，將管口敞開倒置于衛(wèi)生紙上使所有液體流出，加入1 mL70乙醇洗沉淀一次，4下12 000 rpm 離心5-10 分鐘。（9）吸除上清液，將管倒置于衛(wèi)生紙上使液體流盡，真空干燥10 分鐘

16、或室溫干燥。（10）將沉淀溶于20L TE 緩沖液（pH8.0，含20g/mL RNase A）中，儲于-20冰箱中。注意 （1）提取過程應(yīng)盡量保持低溫。（2）提取質(zhì)粒DNA 過程中除去蛋白很重要，采用酚/氯仿去除蛋白效果較單獨用酚或氯仿好，要將蛋白盡量除干凈需多次抽提。（3）沉淀DNA 通常使用冰乙醇,，在低溫條件下放置時間稍長可使DNA 沉淀完全。沉淀DNA 也可用異丙醇（一般使用等體積），且沉淀完全，速度快，但常把鹽沉淀下來，所以多數(shù)還是用乙醇。3堿法（離心柱型質(zhì)粒提取試劑盒，TIANGEN）（1）柱平衡步驟：將吸附柱CP4放入收集管，加入500L的平衡液BL,12000 rpm離心1分

17、鐘，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱重新放入收集管中。（2）取4mL過夜培養(yǎng)的菌液，加入干凈的離心管中，12000 rpm離心1分鐘，盡量吸除上清。（3）向留有菌體沉淀的離心管中加入500l溶液P1（含RNaseA，同溶液I），使用移液器或渦旋震蕩器徹底懸浮細菌沉淀。（4）向離心管中加入500L溶液P2（同溶液II），溫和地上下翻轉(zhuǎn)4-6次使細菌細胞膜充分裂解（劇烈震蕩將打斷細菌基因組，造成提取的質(zhì)?；煊谢蚪M），此時離心管中的菌液變得清亮粘稠。（5）加入700L溶液P3（同溶液III），將管溫和顛倒6-8次混勻，充分混勻，此時將出現(xiàn)白色絮狀沉淀，12000 rpm離心10分鐘。（6）將上一步收集

18、的上清液分次加入過濾柱CS（過濾柱放入收集管中），12000 rpm離心2分鐘，小心將離心后收集到的溶液分次加入吸附柱CP4中（吸附柱放入收集管中）。（7）12000rpm離心1分鐘，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱CP4重新放入收集管中。（8）向吸附柱CP4中加入500L去蛋白液PD，12000rpm離心1分鐘，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱重新放入收集管中。（9）向吸附柱CP4中加入600L漂洗液PW（含乙醇），12000rpm離心1分鐘，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱重新放入收集管中。（10）向吸附柱CP4中加入600L漂洗液PW，12 000 rpm離心1分鐘，倒掉收集管中的廢液，將

19、吸附柱重新放入收集管中。（11）將吸附柱CP4重新放入收集管中，12 000 rpm離心2分鐘以除去吸附柱殘余的漂洗液；（12）將吸附柱CP4放入干凈的離心管中，向吸附柱的中間部位滴加100L洗脫緩沖液TB緩沖液，室溫靜置2分鐘，12 000 rpm離心1分鐘，離心管中的溶液即為質(zhì)粒溶液。 注意 （1）離心吸附柱在高鹽狀態(tài)下特異性地結(jié)合溶液中的DNA。八、實驗作業(yè) 1在堿法提取質(zhì)粒DNA操作過程中應(yīng)注意哪些問題？2染色體DNA與質(zhì)粒DNA分離的主要依據(jù)是什么？九、實驗報告 實驗報告要求包括實驗?zāi)康?、實驗原理、實驗材料、實驗步驟、實驗結(jié)果、結(jié)果分析及思考題。實驗六 DNA的瓊

20、脂糖凝膠電泳一 實驗?zāi)康?掌握瓊脂糖凝膠電泳的方法。二、實驗內(nèi)容 本實驗涉及DNA的水平槽電泳檢驗方法。三、實驗要求 采用集中授課、學生自主訓練并重的模式組織教學。四、實驗準備 學生需要掌握DNA的相關(guān)知識概念。五、實驗原理、方法和手段瓊脂糖（agarose）是由半乳糖及其衍生物構(gòu)成的中性物質(zhì)，常作為電泳支持物。瓊脂糖凝膠電泳是常用的核酸、蛋白質(zhì)分離與鑒定方法，它具有操作方便，設(shè)備簡單，需樣品量少及電泳速度快等優(yōu)點。瓊脂糖凝膠電泳對核酸的分離作用主要是依據(jù)它們的相對分子量質(zhì)量及分子構(gòu)型，同時與凝膠的濃度也有關(guān)系。在瓊脂糖凝膠（堿性溶液）中，DNA帶有負電荷，在電場作用下朝正極移動，其遷移距離（

21、遷移率）與堿基對數(shù)的對數(shù)成反比，因此通過已知大小的標準物移動的距離與未知片段的移動距離時行比較，便可測出未知片段的大小。因此，不同大小的DNA需要用不同濃度的瓊脂糖凝膠進行電泳分離（表6-1）。但是當DNA分子大小超過20kb時，DNA的電泳遷移率不再依賴于分子大小，普通瓊脂糖凝膠就很難將它們分開。表6-1 DNA在瓊脂糖凝膠中的有效分離范圍瓊脂糖濃度（%）0.30.60.70.91.21.52.0線狀DNA相對分子質(zhì)量（kb）60-520-110-0.87-0.56-0.44-0.23-0.1不同構(gòu)型DNA的移動速度不同，其次序為：共價閉環(huán)DNA（covalently closed circ

22、ular，cccDNA）>直線DNA>開環(huán)的雙鏈環(huán)狀DNA。當瓊脂糖濃度太高時，環(huán)狀DNA（一般為球形）不能進入膠中，相對遷移率為0，而同等大小的直線雙鏈DNA（剛性棒狀）則可以長軸方向前進。溴化乙錠可插入到DNA分子的雙鏈中。在紫外光的照射下，插入溴化乙錠的DNA呈橙紅色熒光，所以溴化乙錠可以作熒光指示劑指示DNA含量（檢測限約為10 ng）和位置。用于分離核酸的瓊脂糖凝膠電泳可分為垂直型及水平型。由于水平型凝膠具有制膠和加樣方便的優(yōu)點，因而使用更多。水平型電泳時，凝膠板完全浸泡在電極緩沖液下1-2 mm，故又稱為潛水式。六、實驗條件（一）材料 質(zhì)粒DNA或其它分子量不同的DNA

23、片段。（二）實驗儀器及用具電泳儀、電泳槽、膠帶、微波爐、凝膠成像儀（或紫外燈）等。（三）藥品和試劑1TBE 緩沖液 (5×)：稱取 Tris 54g，硼酸27.5g，并加入 0.5M EDTA (pH8.0) 20mL，定溶至1000mL。注意：緩沖液中缺少離子時，電流太小，DNA遷移慢；相反，高離子強度的緩沖液由于電流太大會大量產(chǎn)熱，嚴重時，會造成膠熔化和DNA的變性。2上樣緩沖液 (6×)：0.25% 溴酚藍，40% (w/v) 蔗糖水溶液。310 gmL溴化乙錠（EB）或者GoldenView溶液。注意：溴化乙錠是一種強烈的誘變劑并有中度毒性。使用含有該染料的溶液時必

24、須戴手套。使用完后應(yīng)該進行凈化處理。通常用水配制成 10 mgmL的貯存液在室溫下避光儲存，使用終濃度為。七、實驗步驟（一）瓊脂糖凝膠的制備1用膠帶將洗凈、干燥的玻璃板的邊緣（或電泳裝置所配備的塑料盤的開口）封住，形成一個膠膜。將膠膜放在工作臺的水平位置上。在距離底板0.5-1.0 mm的位置上放置梳子，以便加入瓊脂糖后可以形成完好的加樣孔。如果梳子距離玻璃板太近，則拔出梳子時孔底有破裂的危險，最后導(dǎo)致樣品滲漏。2配制一定濃度的凝膠。在電泳緩沖液中加入瓊脂糖，在沸水浴或微波爐中將懸浮液加熱至瓊脂糖溶解。3使溶液冷卻至60，加入溴化乙錠（終濃度0.5 gmL），迅速充分混勻后倒入膠膜中。檢查一下

25、梳子的齒下或齒間是否有氣泡。4在凝膠完全凝固后，小心移去梳子和膠帶，將凝膠放入電泳槽中。5在電泳槽中加入沒過膠面1 mm以上的足夠的電泳緩沖液(0.5×TBE)。（二）點樣與電泳1DNA樣品與加樣緩沖液混合后，用微量取液器一次加入樣品槽中。一般DNA樣品最好控制在0.51.0 g之間。2加完所有樣品后，蓋上電泳槽蓋并通電，使DNA向陽極移動。采用一定電壓（按照兩極間距離計算，2-4 V/cm），幾分鐘后，溴酚藍從加樣孔中移出。繼續(xù)電泳，直至溴酚藍在凝膠中遷移出適當?shù)木嚯x。 3切斷電流，打開槽蓋，在紫外燈下檢查凝膠。八、實驗作業(yè) 1圖示電泳檢測結(jié)果并分析。九、實驗報告 實驗報告要求包括

26、實驗?zāi)康?、實驗原理、實驗材料、實驗步驟、實驗結(jié)果、結(jié)果分析及思考題。實驗七 同功酶遺傳標記分析一 實驗?zāi)康?掌握聚丙烯酰胺凝膠電泳技術(shù)；2同工酶遺傳標記的分析。二、實驗內(nèi)容 本實驗涉及同工酶概念，遺傳標記知識，鯽魚解剖及組織提取、和蛋白垂直電泳分離檢驗方法。三、實驗要求 采用集中授課、學生自主訓練并重的模式組織教學。四、實驗準備 學生需要蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)知識以及酶反應(yīng)相關(guān)知識。五、實驗原理、方法和手段同工酶是一類由具有不同分子結(jié)構(gòu)和大小但具有相同催化功能的酶。同工酶分子的多種形式是由基因決定的，也即同工酶是基因表達的直接產(chǎn)物。由同一基因座的不同等位基因編碼的各種同工酶又稱為等位酶，它們從分子水平上反

27、映了等位基因的相對差異。因此，同工酶不僅是一種生理生化指標，而且也是一種可靠的遺傳標記。在同工酶分析和鑒定中，電泳法是最為廣泛應(yīng)用，它能簡便、快捷地分離某類酶的各同工酶組分，而不破壞酶的活力。電泳的支持介質(zhì)聚丙烯酰胺是目前最常用的。是由丙烯酰胺（acrylamide）單體和交聯(lián)劑甲叉雙丙烯酰胺（bisacrylamide）在催化劑的作用下聚合成含酰胺基側(cè)鏈的脂肪族長鏈，相鄰的兩個鏈通過甲叉橋交鏈起來，鏈縱橫交錯，形成三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。丙烯酰胺的單體和雙體的聚合有兩種類型，一種是化學聚合，常采用過硫酸胺四甲基乙二胺（TEMED）催化系統(tǒng)。過硫酸胺是引發(fā)基團，供給游離氧基，TEMED是催化加速劑。另一

28、種是光照聚合，常采用核黃素TEMED催化系統(tǒng)。核黃素在光下形成無色基，TEMED放氧再氧化，產(chǎn)生自由基，從而引發(fā)聚合作用。制備丙烯酰胺凝膠時其凝膠的孔徑由凝膠濃度決定。當采用垂直平板不連續(xù)聚丙烯酰胺凝膠電泳體系時，一般上層是大孔徑的濃縮膠（pH 6.7），下層為小孔徑的分離膠（pH 8.9），電泳緩沖液為Tris甘氨酸緩沖液（pH 8.3）。在這種不連續(xù)系統(tǒng)里，存在著電荷效應(yīng)，分子篩效應(yīng)和濃縮效應(yīng)。蛋白質(zhì)（酶）按其電荷效應(yīng)和分子篩效應(yīng)而被分離在凝膠的不同位置上。用此凝膠板與酶反應(yīng)底物進行催化反應(yīng)，再用生物染料染色便形成肉眼可見的各種酶帶。圖7-1乳酸脫氫酶催化的反應(yīng)乳酸脫氫酸（lactate

29、dehydrogenase，LDH）同工酶催化生物體內(nèi)丙酮酸與乳酸之間的相互轉(zhuǎn)化，是參與糖酵解途徑的關(guān)鍵性酶，它在機體中的基本功能是調(diào)節(jié)NAD+（煙酰胺腺嘌呤二核苷酸，氧化型輔酶I）和NADH（煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸，還原型輔酶I）的比率（圖7-1），從而對細胞的一系列復(fù)雜的生化反應(yīng)起調(diào)控作用。不同樣品間譜帶的差異，反映了基因產(chǎn)物的差異。六、實驗條件 （一）材料鯽魚（市售）。（二）實驗儀器及用具直流穩(wěn)壓電泳儀（VIW-型），垂直平板電泳槽及附件，磨口梨形真空抽氣瓶，20 mL玻璃勻漿器，微量進樣槍，離心機（3500 rpm），吸管，燒杯等。（三）藥品和試劑A、凝膠組成液：130%凝膠貯液：取

30、30g丙烯酰胺、0.8 g甲叉雙丙烯酰胺，加水定容至100ml，過濾后至棕色瓶中，于4保存?zhèn)溆茫?N,N,N,N-四甲基乙二胺（TEMED），避光保存；310%過硫酸銨(APS)溶液：取1g過硫酸銨溶解后，定容至10 mL (現(xiàn)配現(xiàn)用)；4分離膠緩沖液（1.5 mol/L Tris-HCl緩沖液，pH8.8）：取18.15 g 三羥甲基氨基甲烷（Tris）溶解后，加6 mol/L HCl溶液4 mL，調(diào)pH至8.8，定容至100 mL；5濃縮膠緩沖液（0.5 mol/L Tris-HCl緩沖液，pH6.8）：取6 g Tris溶解后，加6 mol/L HCl溶液8 mL，調(diào)pH至6.8，定容至

31、100 mL；B、電極緩沖液（0.05 mol/L Tris，0.384 mol/L甘氨酸，pH=8.3）：取6 g Tris、28.8 g甘氨酸加水溶解后，調(diào)pH至8.3，定容至1000 mL；C、樣品勻漿液：100 mL 0.1 M磷酸緩沖液（pH7.2），加入20%的蔗糖，攪拌混勻后，加入1-2滴巰基乙醇，即為樣品緩沖液。圖7-2 乳酸脫氫酶顯色反應(yīng)D、染色液：1 M dl-乳酸鈉溶液（pH=7.0）5 mL，pH8.0 Tris-HCl緩沖液10 mL，蒸餾水35 mL，NBT（氯化氮藍四唑）15 mg，PMS（吩嗪硫酸甲酯）1 mg，NAD 25 mg，溶解后即為染液。顯色原理及反應(yīng)

32、如圖7-2。七、實驗步驟（一）樣品制備將鯽魚解剖，取其腎、腦、心放于培養(yǎng)皿上稱重，在低溫下按16加入緩沖液樣品進行組織勻漿，置于4冰箱中靜置沉淀。4下10000 rpm離心20分鐘，取上清液為樣品。（二）電泳1配膠根據(jù)所測定的蛋白質(zhì)相對分子量的范圍，選擇適宜的分離膠。本實驗分離膠濃度選用8%,濃縮膠濃度選用4%，按表7-1進行配制。2凝膠的灌制分離膠的配制：將已裝好的垂直板制膠玻璃板模具（1 mm厚）傾斜45°，小心傾入配制好的混勻的分離膠，至適當?shù)母叨群?，用微量注射器沿玻璃板?nèi)壁緩慢注入1 cm左右的蒸餾水進行水封。水封的目的是隔絕空氣中的氧，并消除凝膠表面的彎月面，使凝膠頂部的表

33、面平坦。室溫靜置凝膠液進行聚合反應(yīng)，凝膠與水的界面由清晰到逐漸消失，0.5-1h后聚合反應(yīng)完成，水膠界面重新清晰出現(xiàn)，再靜置30min使聚合完全，傾出凝膠層上方的水；濃縮膠的配制：分離膠聚合好后，除去水層，并用濾紙吸干。然后用凝膠液漂洗一下分離膠頂部，去除漂洗膠液后，按同樣的方法加入濃縮膠0.5-1.0 cm，排除氣泡，快速插入樣品槽模板梳子，靜置聚合約60min，待凝膠聚合后取下樣品刷，安裝到電泳槽上；表7-1 聚丙烯酰胺凝膠電泳所需溶液及其配比試劑8%分離膠用量（20 mL）4%濃縮膠用量（10 mL）凝膠貯液（mL）5.31.3分離膠緩沖液（mL）14.5濃縮膠緩沖液（mL）1.3TEM

34、ED（L）2515水（mL）6.3410%AP溶液（L）75503加樣排除加樣孔內(nèi)氣泡，用微量加樣器按編號向加樣孔中加入酶液樣品，加樣體積為16 µL，然后用注射器向加樣孔加入電極緩沖液至滿，以防止電泳時鄰近孔中酶液的擴散；4電泳將電泳槽一端稍傾斜（以排除電泳槽底部與電極緩沖液之間的氣泡），輕輕放入盛有500 mL的電泳緩沖液的緩沖液槽中，電泳槽的底部要與電極液相連，且不留氣泡。然后，在上部緩沖液槽中加入約500 mL電泳緩沖液。插入電源接頭，正極在下，負極在上。恒壓110 V電泳至樣品進入分離膠后，再恒壓200 V電泳大約3h后。5染色、脫色電泳結(jié)束后，移去玻璃板，取出凝膠平板，將

35、凝膠浸沒于染色液中，37保溫染色約0.5h，然后取出用蒸餾水沖洗，條帶清晰后照相，最后制版保存或放入固定液中保存。八、 實驗作業(yè) 1繪出各種樣品中同工酶譜，并說明酶譜差異。九、實驗報告 實驗報告要求包括實驗?zāi)康?、實驗原理、實驗材料、實驗步驟、實驗結(jié)果、結(jié)果分析及思考題。實驗八 人類ABO血型測定與群體分析一、實驗?zāi)康?. 學習辨別血型的方法。2. 觀察紅細胞凝集現(xiàn)象，掌握ABO血型鑒定的原理。3. 推測個自的基因型，并能對群體是否符合HardyWeinberg遺傳平衡定律進行檢驗。二、實驗內(nèi)容本實驗涉及ABO血型，復(fù)等位基因間的互作，群體遺傳，卡平方檢驗。三、實驗要求采用集中授課、學生自主訓練

36、并重的模式組織教學。四、實驗準備學生需要復(fù)習ABO血型系統(tǒng)，等位基因間的互作，卡平方檢驗，預(yù)習群體遺傳學等方面的內(nèi)容。五、實驗原理、方法和手段血型是指紅細胞的血型，是根據(jù)紅細胞膜外表面存在的特異性抗原（鑲嵌于紅細胞膜上的糖蛋白和糖脂）來確定的，這種抗原或凝集原是由遺傳決定的?？贵w或凝集素存在于血清中，它與紅細胞的不同抗原起反應(yīng)，產(chǎn)生凝集，最后溶解。人類ABO血型抗原就是是根據(jù)紅細胞膜上有無特異性抗原（凝集原）A或B來劃分的血液類型系統(tǒng)，將血型分為A型、B型、AB型、O型四種。ABO血型系統(tǒng)是1900年奧地利蘭茨泰納發(fā)現(xiàn)和確定的人類第一個血型系統(tǒng)。所謂A型指紅細胞膜上存在A抗原，其血清中存在抗B

37、抗體（凝集素），B型指紅細胞膜上存在B抗原，其血清中存在抗A抗體, AB型指紅細胞膜上存在A和B抗原，其血清中沒有抗A或抗B抗體，O型則紅細胞膜上沒有A和B抗原，血清中同時存在抗A抗B抗體。具有A抗原的紅細胞可被抗A抗體凝集；抗B抗體可使含B抗原的紅細胞發(fā)生凝集。輸血時若血型不合會使紅細胞發(fā)生凝集，引起血管阻塞和溶血反應(yīng)，造成嚴重后果。所以在輸血前必須做血型鑒定。血型鑒定可用紅細胞凝集試驗，通過正、反定型準確確定ABO血型。所謂正定型：即血清試驗，用已知抗A、抗B分型血清來確定紅細胞上有無相應(yīng)的A抗原和B抗原；所謂反定型：即細胞試驗，是用已知A細胞和B細胞來測定血清中有無相應(yīng)的抗A或抗B。ABO血型鑒定診斷血清待測者紅細胞受檢者血型待檢者血清診斷紅細胞抗A血清抗B血清A紅細胞B紅細胞O紅細胞-O+-+-A-+-+B+-+AB-哈迪-溫伯格（Hardy-Weinberg）法則是群體遺傳中最重要的原理，它解釋了繁殖如何影響群體的基因和基因型頻率。這個法則是用Hardy,G.H (英國數(shù)學家) 和Weinberg，W.（德國醫(yī)生）兩位學者的姓來命名的，他們于同一年（1908年）各自發(fā)現(xiàn)了這一法則。他們提出在一個不發(fā)生突變、遷移和選擇的無限大的相互交配的群體中，基因頻率和基因型頻率將逐