骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分離培養(yǎng)和生物學(xué)特性的研究進(jìn)展

1、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分離培養(yǎng)和生物學(xué)特性的研究進(jìn)展邴愛英 宋文剛(泰山醫(yī)學(xué)院 , 山東 泰安 271016關(guān)鍵詞 :骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞 ; 分離培養(yǎng) ; 生物學(xué)特性中圖分類號(hào) :R392文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 :A 文章編號(hào) :1004-7115(2011 07-0549-04骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞 (bone marrow mesenchymal stem cells , BMSCs 亦稱骨髓基質(zhì)干細(xì)胞 (bone mar-row stromal cells , BMSCs , 是主要存在于機(jī)體骨髓 腔中的一種干細(xì)胞 , 在一定的誘導(dǎo)條件下 , 可分化 為多種胚層細(xì)胞 12, 更重要的是骨髓間充質(zhì)干細(xì) 胞具有較強(qiáng)的

2、免疫調(diào)節(jié)功能 , 進(jìn)行異體移植時(shí)可避 免免疫排斥反應(yīng) 3, 故對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的研究 越來(lái)越受到廣泛的關(guān)注 。20世紀(jì) 70年代中期 , Friedenstein 等首次報(bào)道 , 骨髓標(biāo)本中小部分貼壁細(xì)胞在培養(yǎng)過(guò)程中能夠分化 形成類似骨 、 軟骨的集落 , 并將之稱為骨髓多能間充 質(zhì)干 細(xì) 胞 (marrow pluripotent stromal cells , 又 稱 BMSCs 。 1997年 , Prockop 成功分離出 BMSCs , 發(fā)現(xiàn) 其具有多向分化潛能 , 可分化為成骨細(xì)胞 、 軟骨細(xì) 胞 、 脂肪細(xì)胞 、 神經(jīng)樣細(xì)胞和成肌細(xì)胞等 。 近年來(lái) , 人們?cè)谘芯恐薪⒘巳?、

3、 猴 、 兔 、 大鼠等不同種屬 BMSCs 的培養(yǎng)體系 , 其取材部位及方式等各有不 同 。1骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的分離與培養(yǎng)BMSCS 的 含 量 很 低 , 約 占 骨 髓 有 核 細(xì) 胞 的 0. 001% 0. 010%左右 , 并且隨著年齡增長(zhǎng)遞減 , 要 利用 BMSCS 就必須實(shí)現(xiàn) BMSCS 的體外分離培養(yǎng)和 擴(kuò)增 。 目前對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的分離 、 純化 、 培養(yǎng) 還沒有統(tǒng)一的方法 , 現(xiàn)在較為常用的分離方法主要 有 :貼壁篩選法 、 密度梯度離心法 、 流式細(xì)胞儀和免 疫磁珠分離法 。 前兩種方法獲得的骨髓間充質(zhì)干細(xì) 胞成分復(fù)雜 , 純度不夠高 。 而用流式細(xì)胞儀和免疫 磁

4、珠分離技術(shù)雖然可獲得高純度的骨髓間充質(zhì)干細(xì) 胞 , 但對(duì)細(xì)胞活性和分化能力有較大影響 , 而且實(shí)驗(yàn) 條件要求高 , 需要骨髓量較大 。 目前最常用的是貼 壁篩選法與密度梯度離心法相結(jié)合的方法 , 既可以 增加分離 BMSCs 的純度 , 又避免影響 BMSCs 的活 性 , 而且操作簡(jiǎn)便 , 成本不高 4。11貼壁篩選法 貼壁篩選法是骨髓間充質(zhì)干細(xì) 胞最初的分離培養(yǎng)方法 , 是由 Friedenstein 在 19世 紀(jì) 70年代中期建立的 。 它是根據(jù) BMSCs 在塑料培 養(yǎng)瓶中貼壁生長(zhǎng)的特性 , 通過(guò)定期換液除去不貼壁 細(xì)胞 , 從而達(dá)到分離 、 純化 BMSCs 的目的 。 Fried

5、en-stein 等的工作創(chuàng)建了一種體外分離和培養(yǎng)的簡(jiǎn)便 可行的方法 。 至今該方法仍是一種得到廣泛應(yīng)用的 經(jīng)典途徑 。12密度梯度離心法 梯度離心法的核心主要是 基于密度梯度離心技術(shù) 。 梯度離心法是根據(jù)骨髓中 細(xì)胞成分的比重不同 , 使用淋巴細(xì)胞分離液提取單 個(gè)核細(xì)胞 , 再進(jìn)行貼壁培養(yǎng) , 從而達(dá)到分離 、 純化 BMSCs 的目的 。 Pittenger 等的研究發(fā)現(xiàn)通過(guò)密度梯 度離心分離培養(yǎng)的間充質(zhì)干細(xì)胞在第一代時(shí)純度可 以達(dá)到 95%。13流式細(xì)胞儀和免疫磁珠法 常用方法為免疫 磁珠法 , 是利用免疫學(xué)的技術(shù)分離 BMSCS , 分離細(xì) 945泰 山 醫(yī) 學(xué) 院 學(xué) 報(bào)JOURNA

6、L OF TAISHAN MEDICAL COLLEGE Vol. 32No. 72011*基金項(xiàng)目 :國(guó) 家 自 然 科 學(xué) 基 金 項(xiàng) 目 (30872322 。 山 東 省 自 然 科 學(xué) 基 金 項(xiàng) 目 (2009ZRB01841 。 泰 山 醫(yī) 學(xué) 院 科 研 計(jì) 劃 課 題 (20092RQN019 。作者簡(jiǎn)介 :邴愛英 (1977 , 女 , 山東即墨人 , 講師 , 碩士 , 主要從事醫(yī)學(xué)免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)和研究工作 。胞的純度高 。 Phinney 5用一種免疫耗損技術(shù)精確 地將造血細(xì)胞系和內(nèi)皮細(xì)胞系從基質(zhì)細(xì)胞中分離出 來(lái) , 提供了一種能高效的分離純化間充質(zhì)干細(xì)胞的 方法 ,

7、但目前仍未篩選到真正特異性的細(xì)胞表面標(biāo) 記 ; 而且 , 這兩種分離方法的操作對(duì)細(xì)胞活性都有較 大影響 , 造成 BMSCS 損傷 , 出現(xiàn)增殖緩慢等問題 , 這 些技術(shù)問題很大程度上限制了這兩種方法的應(yīng)用 。 因此 , 如何能簡(jiǎn)便高效地獲得均質(zhì)性的間充質(zhì)干細(xì) 胞和細(xì)胞群仍需要繼續(xù)探索 。14BMSCs 的培養(yǎng) 、 擴(kuò)增 最常用的是 LG-DMEM 培養(yǎng)基 , 含體積分?jǐn)?shù) 10% 20%的胎牛血清 , 其中 體積分?jǐn)?shù) 10%的胎牛血清最有利于 BMSCs 的貼 壁 、 擴(kuò)增及多系潛能的維持 , 體積分?jǐn)?shù)過(guò)高時(shí) , 血清 中含有大量促進(jìn)細(xì)胞增殖分化的因子 , 容易使細(xì)胞 過(guò)早出現(xiàn)老化 。 但如果

8、 BMSCS 要應(yīng)用于臨床治療 , 則 BMSCS 應(yīng)盡量避免和胎牛血清或新生牛血清的 接觸 , 以避免污染瘋牛病毒和異體蛋白增加的過(guò)敏 風(fēng)險(xiǎn) 。 目前已有多項(xiàng)研究使用臍帶血血清或人自體 血清替代胎牛血清用于 BMSCs 的培養(yǎng) , 這樣既可以 避免上述風(fēng)險(xiǎn) , 又因此類血清中含多種細(xì)胞因子 , 可 促進(jìn) BMSCs 的增殖 、 分化 , 因此為臨床提供了一種 安全有效的培養(yǎng)方法 。 此外 , 種植密度 、 氧體積分?jǐn)?shù) 及細(xì)胞因子都對(duì) BMSCs 的培養(yǎng)有一定影響 , Lennon 等認(rèn)為低密度種植有益于細(xì)胞擴(kuò)增 , 氧體積分?jǐn)?shù)低 于 20%有利于干細(xì)胞功能的存留 , 血小板衍生生長(zhǎng) 因子 、

9、 堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子亦有較強(qiáng)的促進(jìn)增 殖作用 。2骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的生物學(xué)特性骨髓基質(zhì)是骨髓腔中為造血干細(xì)胞提供結(jié)構(gòu)和 功能支持的結(jié)締組織 , 由基質(zhì)細(xì)胞和細(xì)胞間基質(zhì)構(gòu) 成 。 BMSCS 主要有如下特性 : 形態(tài)學(xué)特征 ; 具 有自我復(fù)制 、 增殖能力 ; 間充質(zhì)干細(xì)胞的表面抗原 標(biāo)記 ; 具有多向分化的能力 。21骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的形態(tài)學(xué)特征體外培養(yǎng)的 BMSCS 體積小 , 成梭形或多角形 , 核漿比大 , 多為平行排列生長(zhǎng)或漩渦狀生長(zhǎng) , 部分貼 壁細(xì)胞可以快速形成集落 , 一些呈典型的紡錘形樣 的 BMSCS 增殖迅速 , 形態(tài)均一 。 細(xì)胞傳代后 , 傳代 細(xì)胞較原代細(xì)胞的貼壁

10、速度快 , 細(xì)胞傳到第 3代時(shí) , 細(xì)胞形態(tài)比較一致 。在光鏡和相差顯微鏡下 , BMSCS 為長(zhǎng)梭形 , 類 似成纖維細(xì)胞外觀 。 透射電鏡下 BMSCS 可表現(xiàn)為 兩種不同的形態(tài)結(jié)構(gòu)類型 :一種是處于相對(duì)靜息狀 態(tài)的細(xì)胞 , 核較大 , 核質(zhì)比大 , 胞質(zhì)內(nèi)細(xì)胞器少 ; 另一 種是處于相對(duì)活躍期細(xì)胞 , 細(xì)胞體積大于前者 , 核不 規(guī)則 , 含 2 3個(gè)核仁 , 核質(zhì)比小 , 胞質(zhì)中有豐富的細(xì) 胞器 。22骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞自我復(fù)制 、 增殖能力BMSCS 在體外培養(yǎng)條件下生長(zhǎng)與其它細(xì)胞一 樣 , 經(jīng)歷生長(zhǎng)滯緩期 、 對(duì)數(shù)增殖期和生長(zhǎng)平臺(tái)期 。 對(duì) 細(xì)胞周期的研究顯示 , 只有 10%的 B

11、MSCS 復(fù)制活 躍 , 而大多數(shù)細(xì)胞處于 G/G1期 , 高比例的 G 0/G 1期細(xì)胞暗示 BMSCS 具有高度的分化潛能 6。 BM-SCS 能在體外多次傳代仍保留其染色體核型和端粒 酶活性 。 Conget 等對(duì)培養(yǎng)條件下 BMSCS 的生長(zhǎng)增 殖進(jìn)行了實(shí)驗(yàn) , 發(fā)現(xiàn)成體 BMSCS 可以在體外分裂 (38 4 次 , 并且保持紡錘形態(tài)和成骨潛能直至細(xì) 胞衰竭 。 細(xì)胞進(jìn)行冷凍復(fù)蘇后培養(yǎng)可傳代達(dá) 15次 , 細(xì)胞的增殖分化潛能未受影響 。 作為組織工程種子 細(xì)胞 , 必須攜帶正常且完整的遺傳信息 , 多次傳代后 這些遺傳信息沒有改變 。23骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的表面標(biāo)記與造血干細(xì)胞不同 ,

12、 BMSCS 的表面抗原并沒有 確定 。 已有數(shù)個(gè)抗體被用來(lái)鑒定 BMSCS , Stro-1陽(yáng) 性細(xì)胞具有多向分化能力 , 但是 Hung 等的研究提 示體外擴(kuò)增的 Stro-1陰性的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞同樣 具有多向分化能力 。 單克隆抗體 SH2和 SH3被認(rèn) 為是對(duì)人 BMSCS 比較特異的標(biāo)記 , SH2抗體認(rèn)為是 對(duì)應(yīng)于細(xì)胞表面的 CD105抗原決定簇 , SH3抗體對(duì) 應(yīng)于 CD73。 但是在 Lee 研究中 , 分離獲得的 BMSCS 具有典型的自我增殖和多向分化特性 , 但 CD105標(biāo) 記都為陰性 。 至今仍沒有特異的標(biāo)記物來(lái)鑒定 BM-SCS 類細(xì)胞 , 比較一致的看法是 ,

13、 對(duì)于所分離的 BM-SCS 進(jìn)行其表面抗原檢測(cè)的意義 , 僅僅在于判斷所 獲得的細(xì)胞的純度或均一性 , 或是初步判斷其為不 同于骨髓造血干細(xì)胞的一類細(xì)胞 , 即骨髓間充質(zhì)干 細(xì)胞 7。24骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的多向分化大量的體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)證明 , BMSCS 具有多向分化055泰 山 醫(yī) 學(xué) 院 學(xué) 報(bào) JOURNAL OF TAISHAN MEDICAL COLLEGE Vol. 32No. 72011潛能 , 在不同的微環(huán)境下可向不同的組織細(xì)胞分化 。 比如 , 在培養(yǎng)基中加入適量的 DXM 、 -甘油磷酸鈉 、 抗壞血酸可誘導(dǎo) BMSCS 向成骨細(xì)胞分化 8; 而加入 適量的 DXM 、 人胰

14、島素 、 1-甲基 -3-異丁基黃嘌呤 、 消 炎痛等可誘導(dǎo) BMSCS 向脂肪細(xì)胞分化 9; 另外 , 在 特定的微環(huán)境下尚可誘導(dǎo) BMSCS 向成軟骨細(xì)胞 、 平 滑肌細(xì)胞 、 星形膠質(zhì)細(xì)胞 、 神經(jīng)細(xì)胞 、 肝細(xì)胞 、 血管 內(nèi)皮細(xì) 胞 和 心 肌 細(xì) 胞 等 三 個(gè) 胚 層 的 組 織 細(xì) 胞 分 化 1012。 但是誘導(dǎo)分化出的細(xì)胞在體內(nèi)是否能有 效的歸巢到特定部位 , 并發(fā)揮有效的生理功能尚待 更多的證據(jù)進(jìn)一步研究 。3骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的鑒定BMSCs 的鑒定問題是目前的難點(diǎn)之一 , 其原因 主要在于對(duì) BMSCs 的特異性表面標(biāo)記物仍存在爭(zhēng) 議 。 在體外 BMSCs 以易于貼附

15、于塑料培養(yǎng)板為特 征 , 未分化的基質(zhì)細(xì)胞呈梭形或成纖維細(xì)胞形 。 通 常采用其特征性的形態(tài)以及分化為其它基質(zhì)細(xì)胞系 的功能來(lái)鑒定 。國(guó)際間充質(zhì)及組織干細(xì)胞委員會(huì)于 2006年對(duì) 人來(lái)源 MSCs 實(shí)驗(yàn)研究提出三條最低鑒定標(biāo)準(zhǔn) 13: 在標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)條件下 , MSCs 必須具備對(duì)塑料底物的 貼附特性 ; 通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè) , MSCs 群體表達(dá) CD105、 CD73及 CD90陽(yáng) 性 率 95%, 且 CD45、 CD34、 CD14或 CD11b 、 CD79a 或 CD19、 HLA-DR 陽(yáng) 性率表達(dá) 2%; 經(jīng)體外誘導(dǎo) , MSCs 必須能向成 骨細(xì)胞 、 脂肪細(xì)胞及軟骨細(xì)胞分化 。

16、 比較公認(rèn)的鑒 定標(biāo) 志 是 BMSCs 既 不 表 達(dá) 造 血 細(xì) 胞 表 面 抗 原 CD34、 CD45、 CD14、 CD38, 也不表達(dá)淋巴細(xì)胞表面 抗原 CD11a 、 CD11b , 但表達(dá)許多粘 附 分 子 CD44、 CD166、 CD29等 , 同時(shí)表達(dá)一些基質(zhì)細(xì)胞表面抗原 CD105(SH2 、 CD73(SH3、 SH4 以及一些細(xì)胞因子 受體 IL-1R 、 IFN-R 、 TNF-, BMSCs 表達(dá) HLA- 類 抗原 , 基本不表達(dá) HLA- 類 抗 原 1417。 SH2和 SH3為 BMSCs 相對(duì)特異性抗原 , 但其單抗來(lái)源困 難 , 尚不能作為 BMSC

17、s 常規(guī)檢測(cè)指標(biāo) 。 目前鑒定 BMSCs 主要依賴其形態(tài)及功能特征 。4應(yīng)用前景骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞是一類獨(dú)特的干細(xì)胞 , 具有 非常強(qiáng)的自我增殖能力和分化的多潛能性 , 可以被 誘導(dǎo)分化成各種間充質(zhì)組織 , 包括骨 、 軟骨 、 肌肉 、 神 經(jīng) 、 血管內(nèi)皮等細(xì)胞 。 由于其多向分化的潛能 , 兼有 易于獲得 , 對(duì)機(jī)體損傷小及體外擴(kuò)增能力強(qiáng)的特點(diǎn) , BMSCs 是組織工程理想的種子細(xì)胞 , 具有廣闊的應(yīng) 用前景 1820。 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞體外培養(yǎng)系統(tǒng)的 建立有利于進(jìn)一步研究其移植及分化機(jī)制 , 具有良 好的應(yīng)用前景 。體外培養(yǎng)的 BMSCs 具有多向分化潛能 , 如成骨 細(xì)胞 、 軟骨

18、細(xì)胞 、 心肌細(xì)胞 、 骨骼肌細(xì)胞 、 神經(jīng)細(xì)胞 等 , 把 BMSCs 植入體內(nèi)不同組織內(nèi) , 可分化出多種 不同組織細(xì)胞 , 表現(xiàn)出相應(yīng)組織細(xì)胞的表型和功能 , 具有治療相應(yīng)組織臟器疾病潛在價(jià)值 。 諸多研究證 實(shí)其在治療骨軟骨缺損 、 心臟疾病 、 血管疾病 、 神經(jīng) 系統(tǒng)疾病等方面具有重要應(yīng)用價(jià)值 , 是目前研究最 廣泛的細(xì)胞之一 2123。5存在的問題目前對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的認(rèn)識(shí)和了解還在初 步階段 , 很多實(shí)驗(yàn)也表明間充質(zhì)干細(xì)胞具有其它細(xì) 胞難以比擬的優(yōu)點(diǎn) , 因此人們已迫不及待地把這些 細(xì)胞運(yùn)用于心血管疾病 、 血液系統(tǒng)疾病 、 神經(jīng)系統(tǒng)疾 病及外科損傷等領(lǐng)域的治療 。 但是在許

19、多具體應(yīng)用 過(guò)程中還有很多問題有待研究 , 例如 : 尋找和鑒定 BMSCs 所特有的細(xì)胞表面標(biāo)志分子 。 對(duì)間充質(zhì) 干細(xì)胞本身特性的研究 , 包括它的真正起源 、 如何能 夠快速獲得純的間充質(zhì)干細(xì)胞等 , 尚需進(jìn)一步研究 。 體外誘導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞多向分化效率不高 。 間 充質(zhì)干細(xì)胞的相互作用 , 如間充質(zhì)干細(xì)胞與造血干 細(xì)胞間相互作用 、 間充質(zhì)干細(xì)胞與不同成熟階段的 細(xì)胞相互作用直接對(duì)其生長(zhǎng) 、 分化產(chǎn)生的影響等 , 都 需要進(jìn)行更深一步的研究和探索 。參考文獻(xiàn) :1Dezawa MSystematic neuronal and muscle induction systems in bo

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