端粒酶作為腫瘤標志物的研究進展

1、端粒酶作為腫瘤標志物的研究進展     長期以來，普遍認為癌癥是由破壞細胞正常生長調(diào)節(jié)的多種基因突變引起。盡管不同的癌癥可能涉及到一個特定的基因突變，個體的癌癥往往表現(xiàn)為以多基因突變?yōu)樘卣?。除了這種特殊的病因?qū)W外，最近的研究支持一種新的模式，即端粒酶的激活可能是許多惡性腫瘤發(fā)生的先決條件1。    1 端粒、端粒酶與細胞永生    端粒是真核細胞染色體末端的特殊DNA-蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，其DNA的特殊是含有大量的（TTAGGG）n串聯(lián)重復(fù)并富含G的重復(fù)序列，這些序列在進化中高度保守

2、。端粒結(jié)構(gòu)功能主要有2個：一是可保護染色體基因組免受被降解或有害重組，其二是端粒重復(fù)可為染色體末端提供一種可消耗的非編碼序列以暫時緩沖或取消末端復(fù)制問題所帶來的染色體DNA進行性縮短。大多數(shù)普通體細胞的端粒會隨周期性復(fù)制而逐漸縮短，最終達到一個使染色體完整性喪失的臨界點，細胞增殖停止。說明端粒的縮短與高等真核生物中正常體細胞增生受到限制相關(guān)，在細胞衰老中扮演“分裂鐘”的作用1。    與體細胞不同，生殖細胞要為將來產(chǎn)生新的有機體而保存基因組的全部信息。為此它們必須解決端?？s短所引起的不良后果，方法是在染色體末端補充新的端粒重復(fù)序列。端粒酶就是行使這種功能

3、的DNA聚合酶，它是由RNA、蛋白質(zhì)構(gòu)成的核酸蛋白，可在體內(nèi)以酶結(jié)構(gòu)中的RNA成份（與端粒重復(fù)序列互補）為模板，在染色體末端催化添加TTAGGG重復(fù)序列。在生殖細胞中由于有端粒酶表達，其端粒不隨年齡增長而縮短，故生殖細胞為永生細胞1。    由于端?？s短和端粒酶無活性，體細胞通常逐漸衰老死亡。僅有極少數(shù)細胞偶然通過激活端粒酶而逃避程序性老化，其生存延長可能給另外的基因損傷的積累提供機會，導(dǎo)致進行性腫瘤性發(fā)展2。在大多數(shù)癌細胞系和腫瘤細胞中端粒酶均有高水平表達3。表明端粒酶的激活表達與細胞的無限增殖有密切關(guān)系，通過解除細胞衰老過程中的增生受限，端粒酶的重新

4、活化可能是體細胞向腫瘤轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵步驟。    2 正常組織器官端粒酶表達    一些正常需要更新的組織表達低水平的端粒酶，其作用僅是部分補償末端復(fù)制問題造成的端粒進行性縮短1。已發(fā)現(xiàn)有端粒酶表達的正常組織有外周血淋巴細胞、造血干細胞、生殖細胞、胚胎體細胞、毛發(fā)、皮膚、子宮內(nèi)膜等分裂旺盛的組織。正常外周血單個核細胞表達端粒酶的水平僅為無限增殖的癌細胞的1%2%4。Hiyama等5發(fā)現(xiàn)正常的腸道粘膜有端粒酶活性，他認為這種酶表達起源于腸道基底干細胞，但其水平比癌性粘膜低10倍100倍。盡管造血祖細胞和激活的淋巴細胞表達

5、很強的端粒酶活性，但端粒仍然逐漸縮短，提示在這些細胞是以一種與端粒長度無關(guān)的方式上調(diào)酶活性6。    由于組織樣品通常是不同類型細胞的混合物，其中可能含有表達端粒酶的正常細胞，如果不了解由正常細胞產(chǎn)生的背景表達水平，就有可能將正常細胞的表達誤判為腫瘤細胞的表達。    3 端粒酶作為腫瘤標志物早期診斷腫瘤    研究表明，大多數(shù)腫瘤組織細胞均有較高水平的端粒酶表達。而且在一些前侵襲性病變（如發(fā)育異常、原位癌）端粒酶表達的頻率很高2，3，表明端粒酶激活是癌癥多步驟形成過程中的早

6、期事件。常見惡性腫瘤端粒酶表達情形見附表。癌組織端粒酶表達有以下特點。    3.1 癌組織表達陽性率很高，除少數(shù)腫瘤外，陽性率均在80%以上。而癌旁組織和正常相應(yīng)組織陽性率低于10%，為低水平表達?？傮w上，端粒酶表達與臨床特征無明顯關(guān)系，但與臨床病理學(xué)特征有一定聯(lián)系。一些研究表明端粒酶活性反映了細胞的惡變程度。例如SCLC的惡性程度高于NSCLC，故端粒酶的檢出率和活性均高于NSCLC7。胃癌中端粒酶陽性腫瘤惡性程度較高8。前列腺癌組織中端粒酶活性相對水平與病理分化有關(guān)，高水平端粒酶活性在分化差的前列腺癌中更常見9。   

7、 3.3 在一些前侵襲性病變中端粒酶表達水平增加，如結(jié)腸腫瘤10、口腔原位癌和發(fā)育異常病灶1約半數(shù)表現(xiàn)端粒酶活性，盡管前侵襲病變并非都進展為癌，但其中端粒酶表達陽性者似乎可列為密切監(jiān)控的對象。    3.4 迄今為止的資料提示端粒酶可預(yù)測腦膜 瘤、急性髓性白血病和胃腸道癌癥的預(yù)后。Langford等12報道在端粒酶陽性的普通腦膜瘤患者中端粒酶活性與預(yù)后顯著相關(guān)，這些形態(tài)學(xué)上良性的普通腦膜瘤中端粒酶的出現(xiàn)提示其中含有一群無限增殖細胞。在急性髓性白血病，端粒酶活性水平與特定的預(yù)后差的細胞遺傳學(xué)特征（11q異常、染色體5和7缺失）相關(guān)13。 

8、;   由于端粒酶在大部分惡性腫瘤檢出率很高，有可能用作癌癥篩查的標志物。但是以侵入性方法獲取腫瘤組織樣品十分困難，非創(chuàng)傷性或微創(chuàng)傷性獲取樣品確定其端粒酶表達已受到積極關(guān)注。    kinoshita等14比較了一組膀胱癌腫瘤樣品與隨意尿、膀胱沖洗脫落細胞的端粒酶表達。腫瘤組織樣品、膀胱沖洗液、隨意尿中端粒酶檢出率分別為98%（41/42）、84%（36/43）、55%（23/42）。而45例膀胱癌尿脫落細胞學(xué)僅42%檢出癌細胞。無癌者的膀胱沖洗液未檢出端粒酶。尿液和沖洗液脫落細胞端粒酶在I級癌檢出率為75%（9/12），I

9、I級為96%（27/28），而細胞學(xué)檢出癌細胞率I級為8%（1/12），II級為46%（13/28）。表明端粒酶檢測癌癥的敏感性顯著高于細胞學(xué)檢查，對膀胱癌的早期診斷和隨訪十分有用。    yoshita等5對有或無結(jié)腸癌的住院患者的結(jié)腸沖洗物檢測端粒酶，其敏感性為60%（9/15），特異性為100%。在頭頸部癌患者的口腔沖洗物中，端粒酶陽性率達32%（14/42），未發(fā)現(xiàn)口腔沖洗物陽性而癌組織是陰性的現(xiàn)象11。    作為微創(chuàng)傷性方法的細針穿刺在腫瘤的診斷取樣中被常規(guī)采用。Hiyama等16在15例后來經(jīng)術(shù)后標本

10、組織病理學(xué)確診的乳腺癌的針吸標本中全部檢出端粒酶表達。在有或無乳腺癌的患者中，細針抽吸樣品端粒酶檢測的診斷敏感性為67%，特異性90%17。Nouso等18用21G針活檢取肝癌患者肝組織，端粒酶陽性率80%（8/10），與手術(shù)標本的端粒酶陽性率87%（20/23）無明顯差異。說明細針活組織取樣檢測端粒酶可作為癌癥早期檢出的有力手段。    4 端粒酶測定方法    端粒酶由RNA和酶蛋白組成，其活性依賴于其RNA成分，用RNA酶處理后活性大部分喪失1。目前檢測端粒酶表達有二種方法：一是以測其DNA聚合酶活性的端粒重

11、復(fù)擴增法（TRAP）；二是用RT-PCR測RNA組份。一些人認為人端粒酶RNA組份可能比酶本身更與前侵襲性侵襲性腫瘤相關(guān)，但目前組織細胞端粒酶檢測仍是采用TRAP法為主。現(xiàn)將標準的TRAP分析步驟介紹如下3：（1）用特殊緩沖液裂解待檢細胞制備出含端粒酶的抽提物；（2）用抽提物延伸引物TS（5-AATCCGTCGAGC aGAGTT-3）。由于端粒酶表現(xiàn)為步進活性（progressive activity），每延伸一個TTAGGG序列便終止，進入下一次延伸，因而產(chǎn)生了6bp差異的長度異質(zhì)產(chǎn)物。（3）端粒酶反應(yīng)產(chǎn)物用引物CX（5-CCCTTACCC tTACCCTTACCCTAA-3）進行PCR擴

12、增（9430、5030、7245，31個周期）。此步反應(yīng)摻入-32P dCTP以便顯示。（4）PCR產(chǎn)物用PAG分離，放射自顯影顯示。結(jié)果出現(xiàn)RNAse敏感的6bp梯子DNA帶為端粒酶陽性。    附表 惡性腫瘤組織端粒酶活性    腫瘤部位或類型 正常良性組織    癌旁組織 腫瘤組織（%） 頭頸扁平細胞癌 0/17正常組織 54/64（84.3） 肺 癌 3/68癌旁組織 109/136 (80.1) 肝 癌 4/46無癌肝組織 22/26 (85) 胃 癌 2/34癌旁

13、組織 58/66 (85) 賁門食管癌 0/8正常組織 9/9 胰 腺 癌 0/11良性瘤組織&nbs p;41/43 (95.3) 結(jié) 腸 癌 5/35對應(yīng)正常組織 22/23 (95.6) 腎 癌 0/10正常組織 40/56 (71) 前列腺癌 0/10正常和良性增生    1/10癌旁良性增生 28/31 (90) 膀 胱 癌 0/17非病灶 41/42 (98) 婦科惡性腫瘤 37/39 (95) 血液腫瘤 14/16 (87) ALL 14/16 (87) AML 41/56 (73) 皮 膚 癌 1/10正常皮膚 91 黑色素瘤 5

14、/17良性黑痣 15/21 (71.4)    5 結(jié) 語    大量的研究已證實惡性腫瘤組織細胞中端粒酶活性增高與腫瘤發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，檢測端粒酶活性用于惡性腫瘤早期診斷顯示出誘人的前景。但有關(guān)端粒酶與腫瘤發(fā)生的過程有許多問題尚待闡明，如端粒酶是怎樣激活的？同一種腫瘤為何有的表達有的則不表達端粒酶？無端粒酶表達的細胞是如何逃避衰老而成為無限增殖細胞？端粒酶、端粒酶RNA二者究竟誰最能真實反映端粒酶在腫瘤中的表達？端粒酶分析方法尚缺乏標準化等。    今后，應(yīng)在常見惡性腫瘤中

15、進一步研究何種腫瘤是端粒酶診斷應(yīng)用的最佳靶腫瘤，進行檢測方法的標準化，發(fā)展端粒酶定量檢測和原位檢測方法，研究端粒酶表達在癌癥監(jiān)測、療效和預(yù)后判斷中的作用。    參考文獻    1 Rhyu MS. JNCI, 1995;87:884-894    2 Breslow RA, Shay JW, Gazdar AF, et al. JNCI, 1997;89:618-623    3 kim NW, Piatyszek MA, Prows

16、e KR, et al. Science, 1994;266:2011-2015    4 Counter CM, Gupta J, harley CB, et al. Blood, 1995;85;2315-2320    5 hiyama E, Hiyama K, Tasumoto N, et al. Int J Oncol, 1996;9:453-458    6 norrback KF, Roose G. Eur J Cancer, 1997;33 PartA:774

17、    7 hiyama K, Hiyama E, Ishioka S, et al. JNCI, 1995;87:895    8 hiyama E, Yokoyama T, Tatsumoto N, et al, Cancer Res, 1995;55:3258    9 lin Y, J Urol, 1997;157:1161-1165    10 tahara H, Kuniyasu H, Yokozaki W, et al.

18、Clin Cancer Res, 1995;1:1245-1251    11Czlitano j, Ahrendt SA, Meiningor G, et al. Cancer Res, 1996;56:5720-5722    12 langford LA, Piatyszek MA, Xu R, et al. Human Pathol, 1997;28:416-420    13 zhang W, Piatyszek MA, Kobayashi T, et al. Clin Cancer Res, 1996;2:799-803    14 Kinoshita H. JNCI, 1997;89:724    15 yoshita K, Sugino T, Goodison S, et al. Br J Cancer