凝固酶陰性葡萄球菌

1、凝固酶陰性葡萄球菌凝固酶陰性葡萄球菌致病性分子標(biāo)志物的建立與應(yīng)用致病性分子標(biāo)志物的建立與應(yīng)用11、立題依據(jù)、立題依據(jù)u凝固酶陰性葡萄球菌（凝固酶陰性葡萄球菌（CoNS）廣泛存在于人體皮膚、）廣泛存在于人體皮膚、黏膜等組織表面，常在血液、痰液、尿液、深靜脈置黏膜等組織表面，常在血液、痰液、尿液、深靜脈置管等各種標(biāo)本中檢出。管等各種標(biāo)本中檢出。 文獻(xiàn)報(bào)道，文獻(xiàn)報(bào)道，1995-1996年美國(guó)年美國(guó)48個(gè)醫(yī)學(xué)中心個(gè)醫(yī)學(xué)中心2596份份血標(biāo)本中，血標(biāo)本中， CoNS的分離率達(dá)的分離率達(dá)32.2%。 盡管血液等無(wú)菌體液培養(yǎng)出盡管血液等無(wú)菌體液培養(yǎng)出CoNS臨床意義較大，臨床意義較大，但據(jù)報(bào)道單次血培養(yǎng)但據(jù)

2、報(bào)道單次血培養(yǎng)CoNS污染的可能性仍高達(dá)污染的可能性仍高達(dá)85%。第一部分第一部分 研究背景和意義研究背景和意義2u近年來(lái)由于介入性診療操作、免疫抑制劑及廣譜抗生素近年來(lái)由于介入性診療操作、免疫抑制劑及廣譜抗生素的廣泛使用，的廣泛使用，CoNS已成為院內(nèi)感染的重要病原菌，而已成為院內(nèi)感染的重要病原菌，而且耐藥菌株比金黃色葡萄球菌更為多見(jiàn)。且耐藥菌株比金黃色葡萄球菌更為多見(jiàn)。 葉聯(lián)華等報(bào)道人工瓣膜術(shù)后心內(nèi)膜炎中，約有葉聯(lián)華等報(bào)道人工瓣膜術(shù)后心內(nèi)膜炎中，約有40%-50%由凝固酶陰性葡萄球菌引起；由凝固酶陰性葡萄球菌引起； 2009年中國(guó)年中國(guó)CHINET細(xì)菌耐藥監(jiān)測(cè)結(jié)果細(xì)菌耐藥監(jiān)測(cè)結(jié)果MRCoN

3、S檢檢出率平均為出率平均為71.7%,大于大于MRSA的的52.7%。研究背景和意義研究背景和意義3uCoNS CoNS 作為皮膚黏膜定植菌，在越來(lái)越多的標(biāo)本中被作為皮膚黏膜定植菌，在越來(lái)越多的標(biāo)本中被分離出來(lái)，常常引起臨床困惑。其是否能作為感染的分離出來(lái)，常常引起臨床困惑。其是否能作為感染的病原菌是臨床關(guān)心的問(wèn)題。病原菌是臨床關(guān)心的問(wèn)題。u有鑒于此，有鑒于此，實(shí)驗(yàn)室建立對(duì)實(shí)驗(yàn)室建立對(duì)CoNS污染菌和致病菌界定污染菌和致病菌界定的方法十分必要，是臨床明確診斷和制定合理治療方的方法十分必要，是臨床明確診斷和制定合理治療方案的重要前提案的重要前提 。研究背景和意義研究背景和意義4CoNS致病物質(zhì)u

4、在在 CoNS 感染的發(fā)病過(guò)程中，細(xì)菌先黏附繼而形成難以感染的發(fā)病過(guò)程中，細(xì)菌先黏附繼而形成難以清除的生物膜是其最為重要的致病機(jī)制清除的生物膜是其最為重要的致病機(jī)制 ；u其中其中CoNS產(chǎn)生的產(chǎn)生的多糖胞間黏附素（多糖胞間黏附素（polysacchatide intercellular adhesion，PIA）是細(xì)菌生物膜形成聚集階是細(xì)菌生物膜形成聚集階段所必需的物質(zhì)，在感染過(guò)程中起重要的作用，是鑒定段所必需的物質(zhì)，在感染過(guò)程中起重要的作用，是鑒定其致病性的物質(zhì)基礎(chǔ)。其致病性的物質(zhì)基礎(chǔ)。u Heilmann 等發(fā)現(xiàn)等發(fā)現(xiàn) ica 操縱子操縱子對(duì)合成對(duì)合成 PIA 以及在細(xì)菌形以及在細(xì)菌形成成

5、熟的生物膜中起到非常重要的作用。成成熟的生物膜中起到非常重要的作用。 研究背景和意義研究背景和意義5ica 基因結(jié)構(gòu)uica 基因座定位于細(xì)菌染色體，全長(zhǎng)基因座定位于細(xì)菌染色體，全長(zhǎng) 3.4 kb，包括，包括 icaR 調(diào)節(jié)調(diào)節(jié)基因及串聯(lián)存在的基因及串聯(lián)存在的 icaA、icaD、icaB 和和 icaC 結(jié)構(gòu)基因。結(jié)構(gòu)基因。 其中，其中，icaADBC 4 個(gè)基因構(gòu)成一個(gè)操縱子，可以通過(guò)檢測(cè)個(gè)基因構(gòu)成一個(gè)操縱子，可以通過(guò)檢測(cè) icaADBC 基因來(lái)反映基因來(lái)反映ica 操縱子的存在。操縱子的存在。 icaB 不直接參與胞間黏附素的合成不直接參與胞間黏附素的合成,因?yàn)橹亟M因?yàn)橹亟MicaADC

6、就能就能使細(xì)胞積聚；使細(xì)胞積聚； icaA 單獨(dú)呈現(xiàn)低的單獨(dú)呈現(xiàn)低的N-乙酰葡糖胺轉(zhuǎn)移酶活性；乙酰葡糖胺轉(zhuǎn)移酶活性； icaC涉及到把不斷合成的多糖物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞表面；涉及到把不斷合成的多糖物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞表面； 生物膜的形成要求生物膜的形成要求icaD編碼的產(chǎn)物具有最佳活性。編碼的產(chǎn)物具有最佳活性。 因此因此,我們選擇了我們選擇了icaD 作為本試驗(yàn)的目的基因片段。作為本試驗(yàn)的目的基因片段。研究背景和意義研究背景和意義6u獲得獲得CoNS特異的致病性分子標(biāo)志物；特異的致病性分子標(biāo)志物；u確立敏感、準(zhǔn)確、快速的醫(yī)院感染相關(guān)性確立敏感、準(zhǔn)確、快速的醫(yī)院感染相關(guān)性CoNS特異基因診斷方法；特異基因診

7、斷方法；u能夠準(zhǔn)確鑒定致病性與非致病性能夠準(zhǔn)確鑒定致病性與非致病性CoNS。研究背景和意義研究背景和意義 2、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?、?shí)驗(yàn)?zāi)康?7 研究研究CoNS的生物標(biāo)志物對(duì)該菌在醫(yī)院獲的生物標(biāo)志物對(duì)該菌在醫(yī)院獲得性感染中的臨床微生物學(xué)診斷與鑒定，追得性感染中的臨床微生物學(xué)診斷與鑒定，追蹤傳染源，探索其在醫(yī)院感染中的確切作用蹤傳染源，探索其在醫(yī)院感染中的確切作用和地位、傳播與感染規(guī)律，從而對(duì)控制傳播和地位、傳播與感染規(guī)律，從而對(duì)控制傳播途徑、建立準(zhǔn)確有效的防治措施具有重要實(shí)途徑、建立準(zhǔn)確有效的防治措施具有重要實(shí)際意義和經(jīng)濟(jì)價(jià)值。際意義和經(jīng)濟(jì)價(jià)值。研究背景和意義研究背景和意義 3、臨床意義、臨床意義8u陰

8、性對(duì)照：表皮葡萄球菌陰性對(duì)照：表皮葡萄球菌ATCC12228，購(gòu)自中國(guó)，購(gòu)自中國(guó)藥品鑒定所，經(jīng)基因組測(cè)序證明其藥品鑒定所，經(jīng)基因組測(cè)序證明其ica操縱子缺失操縱子缺失 ；u陽(yáng)性對(duì)照：表皮葡萄球菌陽(yáng)性對(duì)照：表皮葡萄球菌1-97-337，瑞金醫(yī)院倪語(yǔ)，瑞金醫(yī)院倪語(yǔ)星教授惠贈(zèng)，含有完整星教授惠贈(zèng)，含有完整ica操縱子；操縱子；u待測(cè)樣本：自待測(cè)樣本：自2006年年1月至月至2007年年9月，收集我院月，收集我院臨床各科室共臨床各科室共114例疑是感染性標(biāo)本。例疑是感染性標(biāo)本。 第二部分第二部分 材料和方法材料和方法1、研究對(duì)象、研究對(duì)象92、主要試劑、主要試劑u培養(yǎng)基：培養(yǎng)基： 哥倫比亞瓊脂培養(yǎng)基、

9、哥倫比亞瓊脂培養(yǎng)基、 剛果紅瓊脂剛果紅瓊脂 培養(yǎng)基、培養(yǎng)基、 LB肉湯增菌液。肉湯增菌液。u引物：引物： SodA引物引物（ 5-CCITAYICITAYGAYGCIYTIGARCC-3 及及 5-ARRTARTAIGCRTGYTCCCAIACRTC-3）；）； icaD引物引物（5-AGGCAATA TCCAACGGTAA-3及及 5-GTCACGACCTTTCTTATATT-3）；）； 16S rDNA 引物引物（5-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3及及 5-CCGTCAATTCCATTTRAG TTT-3）。）。 材料和方法材料和方法103、主要儀器設(shè)備、主要儀器設(shè)備uPCR

10、儀：儀：PTC100 PCR儀，美國(guó)儀，美國(guó)MJ Research Inc.；u恒壓恒流電泳儀、電泳槽：恒壓恒流電泳儀、電泳槽：DF-C型，北京東方特力科貿(mào)型，北京東方特力科貿(mào)中心；中心；u凝膠成像系統(tǒng)：凝膠成像系統(tǒng)：GDS8000 ，美國(guó)，美國(guó)UVP Inc.； u核酸核酸/蛋白定量?jī)x：蛋白定量?jī)x：DU640，美國(guó)，美國(guó)Beckman；u酶標(biāo)儀：美國(guó)雷杜，深圳組裝；酶標(biāo)儀：美國(guó)雷杜，深圳組裝；uATB Expression：法國(guó)：法國(guó)bioMrieux Inc；u生物安全柜：生物安全柜：BSC-1500 B2，濟(jì)南鑫貝西生物技術(shù)有限，濟(jì)南鑫貝西生物技術(shù)有限公司；公司；u全自動(dòng)快速微生物培養(yǎng)檢

11、測(cè)系統(tǒng)：全自動(dòng)快速微生物培養(yǎng)檢測(cè)系統(tǒng)：BacT/ALERT 3D 60，法國(guó)法國(guó)bioMrieux Inc；材料和方法材料和方法114、實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及方法、實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及方法標(biāo)本采集標(biāo)本采集陰、陽(yáng)性對(duì)照陰、陽(yáng)性對(duì)照菌種鑒定菌種鑒定PIA檢測(cè)檢測(cè)PCR擴(kuò)增擴(kuò)增icaD基因基因sodA基因基因 16SrDNA序列序列生物膜形成實(shí)驗(yàn)生物膜形成實(shí)驗(yàn)DNA測(cè)序、測(cè)序、生物信息學(xué)分析生物信息學(xué)分析確定特征片段確定特征片段臨床驗(yàn)證臨床驗(yàn)證比較分析比較分析材料和方法材料和方法12部分樣品剛果紅試驗(yàn)結(jié)果34 1、剛果紅試驗(yàn)、剛果紅試驗(yàn)第三部分第三部分 結(jié)果和討論結(jié)果和討論13表2.1: 114例CoNS的菌種組成及剛果

12、紅試驗(yàn)結(jié)果結(jié)果和討論結(jié)果和討論14u剛果紅試驗(yàn)通過(guò)培養(yǎng)剛果紅試驗(yàn)通過(guò)培養(yǎng)48h后菌落的顏色變化來(lái)反映后菌落的顏色變化來(lái)反映 CoNS 表達(dá)多糖胞間黏附素的情況，進(jìn)而間接地反映其表達(dá)多糖胞間黏附素的情況，進(jìn)而間接地反映其致病性。致病性。u114例樣品中剛果紅試驗(yàn)陽(yáng)性率例樣品中剛果紅試驗(yàn)陽(yáng)性率21.1%，由于，由于CoNS分泌分泌的的PIA在培養(yǎng)過(guò)程中可以丟失，使陽(yáng)性結(jié)果偏低；另外，在培養(yǎng)過(guò)程中可以丟失，使陽(yáng)性結(jié)果偏低；另外，其方法學(xué)本身易于受多種因素影響，比如：蔗糖的濃其方法學(xué)本身易于受多種因素影響，比如：蔗糖的濃度、氯化鈉和瓊脂的濃度、氣體條件等，干擾了實(shí)驗(yàn)度、氯化鈉和瓊脂的濃度、氣體條件等，

13、干擾了實(shí)驗(yàn)結(jié)果的正確性，不能滿足臨床要求。結(jié)果的正確性，不能滿足臨床要求。 結(jié)果和討論結(jié)果和討論152、ica D基因片段的擴(kuò)增基因片段的擴(kuò)增 a b c d e f g20001000500250(bp)圖2.2 ：部分樣品的icaD基因片段的 PCR 擴(kuò)增結(jié)果結(jié)果和討論結(jié)果和討論16表2.2: 114例CoNS不同菌種icaD片段PCR擴(kuò)增的結(jié)果 結(jié)果和討論結(jié)果和討論17 結(jié)果和討論結(jié)果和討論18圖2.3 : 部分樣品的定性黏附性實(shí)驗(yàn)結(jié)果 3、體外黏附性實(shí)驗(yàn)、體外黏附性實(shí)驗(yàn) 結(jié)果和討論結(jié)果和討論19 表2.4 : 9例icaD（ + ）菌株半定量黏附性實(shí)驗(yàn)結(jié)果 結(jié)果和討論結(jié)果和討論20u通

14、過(guò)體外半定量黏附實(shí)驗(yàn)測(cè)得通過(guò)體外半定量黏附實(shí)驗(yàn)測(cè)得88.9%（8/9）icaD（ + ）菌株是粘附株。）菌株是粘附株。u可見(jiàn)以半定量黏附試驗(yàn)結(jié)果作為生物膜形成能可見(jiàn)以半定量黏附試驗(yàn)結(jié)果作為生物膜形成能力的判定標(biāo)準(zhǔn)，力的判定標(biāo)準(zhǔn)，ica 操縱子的存在與操縱子的存在與CoNS粘附粘附及其生物膜形成密切相關(guān)。及其生物膜形成密切相關(guān)。u體外黏附性實(shí)驗(yàn)用光吸收原理檢測(cè)生物膜成分，體外黏附性實(shí)驗(yàn)用光吸收原理檢測(cè)生物膜成分，但生物膜本身的結(jié)構(gòu)會(huì)受到破壞；且由于方法但生物膜本身的結(jié)構(gòu)會(huì)受到破壞；且由于方法比較復(fù)雜，需要嚴(yán)格控制實(shí)驗(yàn)條件才能獲得較比較復(fù)雜，需要嚴(yán)格控制實(shí)驗(yàn)條件才能獲得較好的重復(fù)性，不適合臨床常規(guī)

15、應(yīng)用。好的重復(fù)性，不適合臨床常規(guī)應(yīng)用。 結(jié)果和討論結(jié)果和討論214、16S rDNA及及sodA基因片段擴(kuò)增基因片段擴(kuò)增 a b c d e 20001000500100(bp)圖2.5：部分樣品的16S rDNA片段 PCR擴(kuò)增結(jié)果 結(jié)果和討論結(jié)果和討論22 圖圖2.6： 部分樣品的部分樣品的sodA 片段片段PCR 擴(kuò)增結(jié)果擴(kuò)增結(jié)果 a b c d e 20001000500250(bp) 結(jié)果和討論結(jié)果和討論23圖7： 部分樣品sodA PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的測(cè)序圖譜 結(jié)果和討論結(jié)果和討論24u 37例例CoNS樣品進(jìn)行了樣品進(jìn)行了16S rDNA基因及基因及sodA基因片段基因片段的的PCR

16、擴(kuò)增，電泳檢測(cè)結(jié)果顯示全部樣品均能準(zhǔn)確地?cái)U(kuò)增，電泳檢測(cè)結(jié)果顯示全部樣品均能準(zhǔn)確地?cái)U(kuò)增出相應(yīng)的片段，其片段大小分別為擴(kuò)增出相應(yīng)的片段，其片段大小分別為16S rDNA 926bp及及sodA 482bp，且均為單一條帶；，且均為單一條帶；u序列測(cè)定表明所有樣品序列測(cè)定表明所有樣品16S rDNA 及及sod A PCR產(chǎn)物序產(chǎn)物序列均相同，未發(fā)現(xiàn)與感染相關(guān)的特異性分子序列。列均相同，未發(fā)現(xiàn)與感染相關(guān)的特異性分子序列。 結(jié)果和討論結(jié)果和討論25uica操縱子可出現(xiàn)在多種操縱子可出現(xiàn)在多種CoNS中，臨床實(shí)驗(yàn)室中，臨床實(shí)驗(yàn)室建立并常規(guī)進(jìn)行建立并常規(guī)進(jìn)行CoNS致病性分子標(biāo)志物的檢致病性分子標(biāo)志物的檢

17、測(cè)方法是有意義、有必要的；測(cè)方法是有意義、有必要的；u通過(guò)本實(shí)驗(yàn)我們確立了的敏感、準(zhǔn)確、快速的通過(guò)本實(shí)驗(yàn)我們確立了的敏感、準(zhǔn)確、快速的醫(yī)院感染相關(guān)性醫(yī)院感染相關(guān)性CoNS基因診斷新方法，即基因診斷新方法，即ica D基因擴(kuò)增方法；基因擴(kuò)增方法； 第四部分第四部分 結(jié)論結(jié)論26結(jié)論結(jié)論u本研究首次報(bào)道了除表皮葡萄球菌以外的其本研究首次報(bào)道了除表皮葡萄球菌以外的其他種的凝固酶陰性葡萄球菌產(chǎn)生多糖胞間粘他種的凝固酶陰性葡萄球菌產(chǎn)生多糖胞間粘附因子的情況；附因子的情況；u表皮葡萄球菌在臨床表皮葡萄球菌在臨床CoNS中檢出最多，是攜中檢出最多，是攜帶帶icaD操縱子的主要菌種，其致病性應(yīng)引起操縱子的主要菌種，其致病性應(yīng)引起足夠重