蠶豆根尖微核監(jiān)測技術(shù)

1、1 水體中葉綠素a的測定2主要內(nèi)容一、實驗?zāi)康募耙蠖?、實驗原理三、實驗材料及用品四、實驗步驟五、寫出報告，分析樣點水質(zhì):3一一 、實驗?zāi)康募耙?、實驗?zāi)康募耙?：（1）初步了解葉綠素a測定的原理和方法；（2）熟練掌握抽濾裝置及分光光度計的使用；（3）通過葉綠素a的含量估算水體中植物的數(shù)量，通過植物數(shù)量來評價水的質(zhì)量二、實驗原理二、實驗原理 采用纖維微孔濾膜過濾水中藻類，用乙醇浸泡截留了藻類的纖維膜，將藻類細(xì)胞中的葉綠素萃取出來，將萃取液離心獲得澄清液，以乙醇做參比，用分光光度計測定萃取液在665nm，645nm，630nm處的吸光度數(shù)值，采用計算公式計算水中葉綠素a的含量，從而分析了解水質(zhì)

2、情況4三、實驗材料及用品：三、實驗材料及用品： 纖維濾膜、漏斗、真空泵、抽濾瓶、研缽、碳酸鎂（0.1g/L）、乙醇（10ml）、離心機、722N可見光分光光度計四、實驗步驟：四、實驗步驟： 1.去青年湖采集樣點各采集500ml水樣，（進(jìn)行等分采樣，每個樣點采三個平行樣）分別用纖維濾膜抽濾，抽濾時可加入少量碳酸鎂（0.1g/L）；MgCO3的作用是使葉綠素處于弱堿性環(huán)境,因為在酸性環(huán)境下,葉綠素a中的鎂原子容易被氫離子取代,形成脫鎂葉綠素，即防止測定過程葉綠素分解。 2.將濾膜剪碎、研磨、放入定量的乙醇中溶解； 3.將溶解液進(jìn)行離心分離（3000r），然后用722N分光光度計測定665nm，64

3、5nm，630nm波段的吸光度； 5 4.按Ca=11.57A665-1.31A645-0.13A630計算葉綠素a的濃度。（式中Ca為葉綠素a的濃度，單位為mg/L，A665、A645、A630為葉綠素溶在波長為665nm、645nm、630nm時的吸光度）五、五、寫出報告，分析樣點水質(zhì)寫出報告，分析樣點水質(zhì): 葉綠素a含量在（0.10.6）mg/m3為貧營養(yǎng)； （0.61.6）mg/m3時為貧中營養(yǎng)； （1.64.1）mg/m3為中富營養(yǎng)； （4.110） mg/m3為富營養(yǎng)。注意事項注意事項：1.離心機的配平 2.分光光度計每換一次波長，都要重新調(diào)零6蠶豆根尖微核監(jiān)測技術(shù)（VMT）7主要

4、內(nèi)容一、實驗?zāi)康亩?、原理三、器材與試劑四、操作步驟五、實驗數(shù)據(jù)的統(tǒng)計處理和污染程度的劃分六、注意事項8一、實驗?zāi)康囊?、實驗?zāi)康?學(xué)習(xí)如何利用高等植物間期體細(xì)胞遺傳檢測系統(tǒng)以監(jiān)測環(huán)境中的致突變物。二、原理二、原理 在細(xì)胞分裂早期，若受到有害理化因子的攻擊，使染色體發(fā)生斷裂，產(chǎn)生染色體片段。在這些片段中，有些可能重新愈合恢復(fù)正常，隨細(xì)胞分裂進(jìn)入子細(xì)胞，有些則由于缺乏著絲點，不能移向細(xì)胞的極部而變成圓球體，像衛(wèi)星一樣分布在主核的周圍，這便是微核，由于染色體片段的大小和數(shù)量不一，所以微核的大小和數(shù)量也不相同。而蠶豆根尖細(xì)胞的染色體大，DNA含量多，因而對誘發(fā)物的反應(yīng)敏感，通過顯微鏡下的觀察和計數(shù)，便可

5、監(jiān)測環(huán)境污染。9三、器材與試劑三、器材與試劑（一）器材顯微鏡、溫箱、恒溫水浴箱、冰箱、手撳計數(shù)器、解剖盤、鑷子、解剖針、載玻片、蓋玻片、試劑瓶、燒杯等顯微鏡壓片實驗用具。（二）試劑1. 5N HCl2. 45%醋酸3. 卡諾氏液（無水乙醇3份加冰醋酸1份配成，固定根尖時隨用隨備）4. 席夫氏（Schiff）試劑5. SO2洗滌液（現(xiàn)用現(xiàn)配）10四、操作步驟四、操作步驟（一）蠶豆浸種催芽 （1）浸種：將當(dāng)年或前一年的蠶豆種子按需要量放入盛有有自來水的燒杯中，置25溫箱內(nèi)，浸泡2030小時，此期間至少換水2次，換用的水最好事先置于25溫箱中預(yù)溫。 （2）催芽：待種子吸脹后，用紗布松松包裹置解剖盤內(nèi)

6、，保持溫度，在25的溫箱中催芽1224小時。待種子初生根露出23mm時，再選取發(fā)芽良好的種子，放入鋪有薄層溫脫脂棉的解剖盤內(nèi)，仍置入25的溫箱中繼續(xù)催芽，注意保護濕度。再經(jīng)3648h，種子大部分初生根長至23cm，根毛發(fā)育良好，這時就可用來作為監(jiān)測水源樣品或藥物溶液突變效應(yīng)之間。11（二）被監(jiān)測液處理根尖 （1）每一處理選取68粒（每人兩粒）初生根尖生長良好，根長一致的種子，放入盛有被測液的培養(yǎng)皿中，被測液（0.5mol/L CrO3溶液）浸泡住根尖即可，用自來水（或蒸餾水）處理作對照，方法相同。 （2）處理時間46h（1h）。（三）根尖細(xì)胞恢復(fù)培養(yǎng) （1）將處理的種子，用自來水浸洗8次，每次

7、23min。 （2）洗凈后的種子再放入新鋪好濕脫脂棉的解剖盤內(nèi)，按前述培養(yǎng)條件使根尖細(xì)胞恢復(fù)2224h。（周一上午）（四）固定根尖細(xì)胞 （1）將恢復(fù)后的種子，從根尖頂端切下1cm長的幼根放12入青霉素空瓶中，加卡諾氏固定液固定24h。（周二上午） （2）固定后的幼根如不及時制片，可換入70%的乙醇中，置4的冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆?。（五）Feulgen染色（周三上午） （1）固定好的幼根，在青霉素瓶中用蒸餾水浸洗2次，每次5min。 （2）吸凈蒸餾水，再加入5N HCl將幼根泡住，連瓶放入28水浴鍋中水解幼根25min左右，至幼根被軟化即可。 （3）用蒸餾水浸洗幼根2次，每次5min。 （4）在暗室或遮

8、光條件下加Schiff試劑，每瓶用量以淹沒幼根液面高出2mm為好。 （5）除去染液，用SO2洗滌液浸洗幼根2次，每次5min。13 （6）用蒸餾水浸洗幼根1次，5min。 （7）將幼根放入新?lián)Q的蒸餾水中，置4的冰箱內(nèi)保存，可供隨時制片之用。（六）制片 （1）將幼根放在擦凈的載玻片上，用解剖針截除根冠區(qū)，截留下1mm左右的根尖分生區(qū)。 （2）滴上少許45%的醋酸溶液，用解剖針將根尖搗碎。 （3）加蓋一清潔的蓋玻片，注意不要有氣泡。 （4）再在蓋玻片上加一小塊濾紙，輕輕敲打壓片。（七）鏡檢及微核識別標(biāo)準(zhǔn) 將制片先置顯微鏡低倍鏡下，找到分生組織區(qū)細(xì)胞分散均勻，膨大、分裂相較多的部位，轉(zhuǎn)到高倍鏡（物鏡

9、40）14下進(jìn)行觀察。微核的識別標(biāo)準(zhǔn)： （1）凡是主核大小的1/3以下，并與主核分離的小核。 （2）小核著色與主核相當(dāng)或稍淺。 （3）小核形態(tài)可以是圓形、橢圓形、不規(guī)則形。每一處理觀察3個根尖，每個根尖計數(shù)1000個細(xì)胞中的微核數(shù)。五、實驗數(shù)據(jù)的統(tǒng)計處理和污染程度的劃分五、實驗數(shù)據(jù)的統(tǒng)計處理和污染程度的劃分 將微核觀察記載表上所得的數(shù)據(jù)，按如下步驟進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理。15（1）各測試樣品（包括對照組）微核千分率（MCN）的計算：（2）如果被監(jiān)測物樣品不多，可直接用各樣品率平均值與對照比較，從差異的顯著性判斷水質(zhì)污染與否。（3）如被監(jiān)測的樣品較多，可先用方差分析看各采樣點所出現(xiàn)的率平均值和對照的差異顯著性，如差異顯著，還可進(jìn)行各采樣占微核差異顯著性的多重比較，看被檢測樣品率平均值差異顯著性的分組情況，以歸納劃分這些不同采樣點不同級別的污染程度。（4）如采用已篩選出的、又專門隔離栽培，無污染的蠶豆作實驗材料，并按規(guī)范標(biāo)準(zhǔn)實驗條件，其監(jiān)測樣品污染程觀測的細(xì)胞數(shù)某測樣試點（或?qū)φ眨?shù)觀測到的某測試樣點（或?qū)φ眨?000MCNMCN16度的劃分，可不用上述兩種統(tǒng)計處理方法，而直接采用如下標(biāo)準(zhǔn)： MCN在10%以下為基本沒有污染； 10-12區(qū)間為輕污染； 10-30區(qū)間為中污染； 10以上為重污染。 污染指數(shù)判別：此方法可避免應(yīng)實驗條件等因素帶來的本底的波動，故較宜適用。平均值標(biāo)準(zhǔn)水（