血清蛋白質(zhì)醋酸纖維薄膜電泳實(shí)驗(yàn)報(bào)告

1、血清蛋白質(zhì)醋酸纖維薄膜電泳實(shí)驗(yàn)報(bào)告實(shí)驗(yàn)名稱血清蛋白醋酸纖維薄膜電泳及其定量實(shí)驗(yàn)日期實(shí)驗(yàn)地點(diǎn)XX實(shí)驗(yàn)室合作者XXX指導(dǎo)老師XXX評(píng)分教師簽名批改日期一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?.1. 學(xué)習(xí)醋酸纖維薄膜電泳的基本原理和操作方法；1.2. 了解電泳技術(shù)的一般原理；1.3. 掌握電泳分離血清蛋白質(zhì)及其定性定量的方法。二、實(shí)驗(yàn)原理2.1. 血清中各種蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)不同，一般都低于pH7.4。它們?cè)趐H8.6的緩沖液中均解離帶負(fù)電荷，在電場(chǎng)中向正極移動(dòng)。由于血清中各種蛋白質(zhì)分子大小、形狀及所帶的電荷量不同，在醋酸纖維素薄膜上電泳的速度也不同。因此可以將它們分離為清蛋 白（Albumin）、a 1-球蛋白、a 2-球蛋白

2、、B -球蛋白、丫 -球蛋白5條區(qū)帶。2.2. 血清中不同蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)、分子量及含量血清蛋白質(zhì)等電點(diǎn)分子量占總蛋白的清蛋白4.6469,0005772a 1 球蛋白5.06200,00025a 2 球蛋白5.06300,00049B 球蛋白5.1290,000150,0006.512丫 一球蛋白6.857.3156,000950,0001220緩沖液 pH=8.6, pl v pHo血清蛋白帶負(fù)電荷，在電場(chǎng)中向正極移動(dòng)。預(yù)測(cè)血清蛋白電泳區(qū)帶圖血清蛋白依次分為清蛋白，球蛋白的 a 1、a 2、B、丫五個(gè)區(qū)帶2.3. 膜條經(jīng)過(guò)氨基黑10B染色后顯出清晰色帶；各色帶蛋白質(zhì)含量與染料結(jié)合 量基本成正

3、比；可將各色帶剪開(kāi)，分別溶于堿性溶液中；用分光光度法計(jì)算各種蛋 白質(zhì)的百分?jǐn)?shù)。三、材料與方法：3.1. 實(shí)驗(yàn)材料：3.1.1. 實(shí)驗(yàn)試劑：樣品：健康人血清（新鮮、無(wú)溶血）；巴比妥-巴比妥鈉緩沖液（pH8.6,離子強(qiáng)度0.06mol/L ）;3氨基黑10B染色液；漂洗液；洗脫液： 0.4mol/NaO H 溶液。3.1.2. 實(shí)驗(yàn)器材：V-1100分光光度計(jì)（X 1）；恒溫水浴箱（X 1）；試管（X6）、試管架（X 1）；1000卩L加樣槍（X 1）、加樣槍架（X 1）；醋酸纖維薄膜（2cm*8cm厚度120卩m）:培養(yǎng)皿（X 5）;點(diǎn)樣器或載玻片（X 1）；平頭鑷 子（X 2）；剪刀（X 1）

4、；電泳槽（X 1）； ?直流穩(wěn)壓電泳儀（X 1）3.2. 實(shí)驗(yàn)步驟1 準(zhǔn)備與點(diǎn)樣：取2X 8cm的膜條；亞光面距一端1.5cm處取一點(diǎn)樣線；充分浸透在巴比妥緩沖液中；取出膜條，用濾紙吸去多余的緩沖液；點(diǎn)樣器下端粘上薄層血清；垂直點(diǎn)樣2. 電泳：放置膜條（點(diǎn)樣面向下，點(diǎn)樣端置于陰極）；膜條貼緊濾紙，拉直膜條；平衡五分鐘；通電（調(diào)節(jié)電壓 120v/電流，時(shí)間：4560 min）;關(guān)閉電源電泳槽解剖圖:3. 染色、漂洗：通電完畢；取出膜條；浸于染色液（氨基黑10B）中，5min； 取出膜條，浸于漂洗液；反復(fù)漂洗 2次，直至漂凈；濾紙吸干薄膜。4. 定量（洗脫比色法）（因?qū)嶒?yàn)室等原因，未做）四、結(jié)果與

5、討論:圖一染色后的膜條4.1. 結(jié)果分析本次實(shí)驗(yàn)得到的圖譜只能夠清晰的看出清蛋白和丫 一球蛋白的區(qū)帶，其余無(wú)法區(qū)別。原因可能如下： 醋酸纖維薄膜質(zhì)量不足 薄膜過(guò)濕，樣品擴(kuò)散迅速，導(dǎo)致樣品分離不成區(qū)帶。 點(diǎn)樣太少，區(qū)帶顯色不明顯。 電泳時(shí)間不足。 薄膜在緩沖液中浸泡的時(shí)間不足。 取出電泳后的薄膜過(guò)程中曾不慎將薄膜掉到地上。 染色時(shí)，因?yàn)楝F(xiàn)場(chǎng)混亂，可能導(dǎo)致醋酸纖維薄膜不是一張一張放入染色液的，在染色 固定前，薄膜與薄膜之間重疊，造成薄膜上還未固定的血清蛋白彼此粘連。4.2. 課后思考題1. 電泳時(shí)，點(diǎn)樣端置于電場(chǎng)的正極還是負(fù)極？為什么？答：點(diǎn)樣端置于電場(chǎng)的負(fù)極。因?yàn)槿梭w血清的蛋白質(zhì)會(huì)因電槽中溶質(zhì)呈堿性而帶負(fù)電，要成功分離出各類各類蛋白質(zhì)，理應(yīng)將點(diǎn)樣端置于電場(chǎng)的負(fù)極。2. 電泳后各區(qū)帶應(yīng)明顯分開(kāi)，如分離不清或不整齊，試分析其可能存在的原因。答：醋酸纖維薄膜質(zhì)量不足；薄膜過(guò)濕，樣品擴(kuò)散迅速，導(dǎo)致樣品分離不成區(qū)帶;點(diǎn)樣太少，區(qū)帶顯色不明顯；染色時(shí)