HPLC同時測定血漿中頭孢氨芐和甲氧芐啶的濃度

1、    作者：夏登寧 夏艷姣 尹佳 賀英菊【摘要】 采用高效液相色譜紫外檢測器同時檢測血漿中頭孢氨芐和甲氧芐啶的濃度。以0.5倍血漿體積，濃度為10%(v/v)的高氯酸為蛋白沉淀劑。色譜條件：Diamonsil C18(250mm×4.6mm，5m)，柱溫：30，流動相：pH3.0的0.05mol/L的磷酸鹽緩沖液乙腈甲醇(76168)，流速1.0ml/min，進樣量20l，檢測波長240nm。頭孢氨芐、甲氧芐啶及內(nèi)源性物質(zhì)分離良好。頭孢氨芐血藥濃度線性范圍為0.550.0g/ml，檢測限為50ng/ml，高、中、低濃度的相對回收率在97.3%

2、100.5%之間(n=5)，日內(nèi)RSD6.5%(n=5)，日間RSD8.3%(n=5)。甲氧芐啶血藥濃度線性范圍為0.2525.0g/ml，檢測限為25ng/ml，高、中、低濃度的相對回收率在96.5%99.3%之間(n=5)，日內(nèi)RSD6.9%(n=5)，日間RSD8.6%(n=5)。本法樣品處理簡單、靈敏、準確，適合于同時測定兩者的體內(nèi)濃度。 【關(guān)鍵詞】 頭孢氨芐； 甲氧芐啶； 血藥濃度； 高效液相色譜法。 ABSTRACT To establish an HPLC method for the simultanecous determination of cefalexin and tr

3、imethoprin in rabbits plasma. The protein was precipitated by perchloric acid. Chromatographic separation of analytes was achieved on a C18 column at the temperature of 30, using a mixture of 0.05mol/L PBS (pH=3.0), acetonirile and methanol (76168, v/v/v) as mobile phase and detection was performed

4、at 240 nm. The linearity was obtained over the concentration range of 0.550.0g/ml for cefalexin and 0.2525.0g/ml for trimethoprim. The relative recoveries of cefalexin and trimethoprim at high, medium and low concentrations were 97.3%100.5% and 96.5%99.3% respectively. Both interand intraday RSD (n=

5、5) were 8.3% for cefalexin and 8.6% for trimethoprim. The limits of detection for cefalexin and trimethoprim were 50ng/ml and 25ng/ml respectively. The present HPLC method is simple, sensitive, accurate, and was successfully applied to the simultaneous determination of cefalexin and trimethoprim in

6、rabbits plasma. KEY WORDS Cefalexin; Trimethoprim; Plasma drug concentration; HPLC 頭孢氨芐為口服頭孢菌素類藥物，作用機制主要是通過干擾細菌細胞壁主要成分肽聚糖的合成發(fā)揮抗菌作用。甲氧芐啶作用機制為干擾細菌的葉酸代謝，選擇性抑制細菌的二氫葉酸還原酶的活性，使二氫葉酸不能還原為四氫葉酸，阻止細菌核酸和蛋白質(zhì)的合成。頭孢氨芐與甲氧芐啶聯(lián)用(51)能擴大抗菌譜，提高抗菌活性，現(xiàn)有相應(yīng)產(chǎn)品上市。國內(nèi)外有較多的文獻報道了高效液相紫外檢測器檢測頭孢氨芐的血藥濃度2，3，和使用紫外檢測器、質(zhì)譜檢測器5、高效毛細管電泳法6檢測甲

7、氧芐啶的血藥濃度。由于兩者的物理化學(xué)性質(zhì)差異較大，以及生物樣品內(nèi)源物質(zhì)干擾較多，高效液相色譜紫外檢測器同時測定兩者血藥濃度有一定的困難，國內(nèi)外文獻報道較少。本實驗采用外標法，建立了一個簡單、靈敏、準確，可同時測定兩者血藥濃度的方法。 1 材料與方法 1.1 儀器與試藥 高效液相色譜儀：LC10ATvp泵，SPD10Avp紫外可見光檢測器(日本島津)，電子天平BP211D(德國Sartorius公司)，pHS2C型酸度計(成都方舟科技開發(fā)公司)。 頭孢氨芐(山東淄博新華肯孚制藥有限公司，批號01051100223)，甲氧芐啶(廣州僑光制藥有限公司，批號50010)，甲醇(色譜純)，乙腈(色譜純)

8、，超純水(自制)，其它試劑均為分析純。頭孢氨芐/甲氧芐啶膠囊(長春市新安藥業(yè)有限公司，批號070201)。 1.2 色譜條件 色譜柱：Diamonsil C18(250mm×4.6mm，5m)(Dikima公司)，柱溫30，流動相為pH3.0的0.05mol/L的磷酸鹽緩沖液乙腈甲醇(76168)，流速1.0ml/min，進樣量20l，檢測波長240nm。 1.3 標準曲線及線性關(guān)系 精密稱取頭孢氨芐20mg，甲氧芐啶10mg，混合，先用0.1mol/L的乙酸2ml使其快速溶解，再以10%(v/v)高氯酸為溶劑定容，逐級稀釋法配制6個不同濃度的標準儲備液。取6份100l空白血漿，分別

9、加入上述標準儲備液50l，渦旋1min后12000r/min離心5min。制得的樣品中分別含頭孢氨芐0.5、1.0、5.0、10.0、25.0和50.0g/ml，甲氧芐啶0.25、0.5、2.5、5.0、12.5和25.0g/ml。取上清液進樣，記錄峰面積(A)，以濃度(C)對峰面積進行線性回歸，得頭孢氨芐標準曲線為A=10049C-1420 R2=0.9996，線性范圍為0.5050.0g/ml；甲氧芐啶標準曲線為A=29599C-1501，R2=0.9995，線性范圍為0.2525.0 g/ml。兩者線性關(guān)系良好。 1.4 血漿樣品的處理 給藥前、后于兔耳緣靜脈處取血0.5ml，12000

10、r/min離心5min，吸取血漿100l，加入10%的高氯酸50l，渦旋1min后12000r/min再離心5min，樣品置4冰箱保存待測。 2 結(jié)果 2.1 色譜行為 按1.3項下制備標準曲線，按1.4項下處理樣品，按1.2項下色譜條件進樣測定，得空白血漿、空白血漿加對照品、服藥后血漿的色譜圖(圖1)。由圖1可見血漿中的內(nèi)源性雜質(zhì)不干擾頭孢氨芐和甲氧芐啶的測定，兩者分離良好。頭孢氨芐保留時間約5.3min，甲氧芐啶保留時間約6.6min。 2.2 方法學(xué)研究 (1)檢測限 分別制備不同濃度的頭孢氨芐和甲氧芐啶低濃度血漿樣品，各重復(fù)3次，測得峰高與噪音，取信噪比為3，得頭孢氨芐的最低檢測濃度為

11、50ng/ml，甲氧芐啶的最低檢測濃度為25ng/ml。 (2)精密度 取空白血漿數(shù)份，按標準曲線樣品制備方法配制高、中、低3種濃度的質(zhì)控樣品(分別含頭孢氨芐50.0、10.0和0.5g/ml，甲氧芐啶25.0、5.0和0.25g/ml)。測得頭孢氨芐高、中、低濃度的日內(nèi)RSD(n=5)分別為1.9%、5.2%和6.5%；日間RSD(n=5)分別為7.9%、5.8%和8.3%。甲氧芐啶高、中、低濃度的日內(nèi)RSD(n=5)分別為3.5%、3.6%和6.9%；日間RSD分別為8.6%、2.8%和5.3%(n=5)。 (3)回收率 同法配制高、中、低3種濃度的質(zhì)控樣品，每個濃度5份，由標準曲線回歸方

12、程計算檢出量評價本法的回收率。結(jié)果頭孢氨芐高、中、低濃度的相對回收率分別為100.5%、97.3%和98.5%；甲氧芐啶高、中、低濃度的相對回收率分別為98.7%、99.3%和96.5%。 (4)血漿樣品穩(wěn)定性考察 取質(zhì)控樣品分別置于室溫、4條件下儲存，于0、0.5、1.5、2.5、3.0和5.0d測定，分別計算兩者峰面積的RSD。室溫下兩者的RSD在19.0%105.4%之間，峰面積都有下降的趨勢；4下兩者的RSD在3.3%7.9%之間，RSD小于10%，表明4下存放5d兩者基本保持穩(wěn)定。 2.3 頭孢氨芐和甲氧芐啶在兔體內(nèi)的血藥濃度 6只健康新西蘭大耳兔，雌、雄各半，體重范圍2.52.8kg。實驗前禁食12h，口服頭孢氨芐/甲氧芐啶膠囊兩粒(每粒含頭孢氨芐125mg，甲氧芐啶25mg)，4h后統(tǒng)一進食。分別于0、0.5、0.67、0.83、1.0，1.5、2.0、3.0、4.0、6.0、8.0和10.0h取耳緣靜脈血0.5ml，置肝素化離心管中，按1.4項下處理，立即放入4冰箱冷藏，測定。平均藥時曲線見圖2。 3 討論 頭孢氨芐為弱酸性化合物，甲氧芐啶為弱堿性化合物，兩者物理化學(xué)性質(zhì)相差較大，再加上生物