谷氨酸菌體蛋白的酶解條件優(yōu)化_圖文

1、2011No. 2Serial No. 227China Brewing味精產(chǎn)業(yè)是我國(guó)食品行業(yè)中的重要支柱產(chǎn)業(yè)之一, 目前我國(guó)共有味精廠 200家左右,年產(chǎn)味精約 110×104t , 每 生產(chǎn) 1t 味精可從發(fā)酵液中提取干菌體 200kg250kg, 其菌 體蛋白質(zhì)含量為 70%左右, 因此每年可以產(chǎn)生廢棄的菌體 蛋白 22×104t 1。谷氨酸菌體是一種單細(xì)胞蛋白, 目前我國(guó)味精廠的發(fā) 酵廢液中含有大量的谷氨酸菌體, 許多工廠將其直接排放, 既造成嚴(yán)重的環(huán)境污染又浪費(fèi)了大量的蛋白質(zhì) 。 許多國(guó) 外的味精廠則是將谷氨酸菌體回收作為飼料蛋白 。 據(jù)報(bào) 道, 近年來日本及其美

2、國(guó)消費(fèi)的調(diào)味品中, 蛋白質(zhì)水解物 因其豐富的氨基酸含量和較高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值, 實(shí)測(cè)消費(fèi)量已 相當(dāng)于甚至超過味精的消費(fèi)量 。 在我國(guó),這方面的消費(fèi)目 前不是很多, 但隨著人們生活水平的提高, 蛋白質(zhì)水解物 將會(huì)有廣闊的市場(chǎng) 2。 目前對(duì)谷氨酸菌體蛋白進(jìn)行水解的 方法主要有化學(xué)和酶法 。 化學(xué)方法雖然簡(jiǎn)單,谷氨酸菌體濃縮液:蓮花味精廠提供 。XMTB 型恒溫水浴鍋:天津市中環(huán)實(shí)驗(yàn)電爐有限公司;蛋白水解度 =N N 2×100%式中:N 1為水解后生成的氨基酸態(tài)氮; N 2為投入的樣品總氮 。采用凱氏定氮法 5。2結(jié)果與討論時(shí)間對(duì)菌體蛋白水解率的影響見圖 1。 時(shí)間與水解進(jìn) 行程度密切相關(guān),

3、反應(yīng)時(shí)間短, 水解不充分; 反應(yīng)時(shí)間長(zhǎng),水解液易腐敗 。 水解開始后,蛋白質(zhì)的水解度隨時(shí)間的延 長(zhǎng)而增加, 隨著水解的進(jìn)行酶促反應(yīng)速度逐漸減慢, 從而 使水解率變得平緩甚至?xí)陆?。 一般認(rèn)為酶反應(yīng)時(shí)間越 長(zhǎng), 水解越充分, 但考慮到工藝可行性, 節(jié)省能耗, 試驗(yàn)控谷氨酸菌體蛋白的酶解條件優(yōu)化周大偉, 肖冬光 *, 郭學(xué)武, 呂鴻雁, 杜麗平(工業(yè)微生物教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 天津市工業(yè)微生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院, 天津 300457摘 要:采用響應(yīng)面法對(duì)谷氨酸菌體蛋白的酶解條件進(jìn)行優(yōu)化, 以蛋白水解度為參考指標(biāo), 確定最佳酶解工藝為酸性蛋白酶與 -葡文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:A文章編號(hào):02

4、54-5071(2011 02-0128-03Optimization of the enzymatic hydrolysis of cell protein of Corynebacteria glutamic acidZHOU Dawei, XIAO Dongguang*,GUO Xuewu, LV Hongyan, DU Liping(KeyLab of Industrial Microbiology of Ministry of Education, Tianjin Industrial Microbiology Key Lab, College of Biotechnology,Ti

5、anjin University of Science and Technology, Tianjin 300457, ChinaAbstract:Using hydrolysis of protein as reference, enzymatic hydroly sis of cell protein of Corynebacteria glutamic acid was optimized with Plackett-Burman design. The results showed that optimum conditions were as follows:ratios of ac

6、idic protease and -glucanase 3:1,total addition of enzymes 2%,temperature 50 , pH value 4.0, concentration of substrate 15%and hydrolysis 10h. Under these conditions, the hydrolysis degree of protein reached 18.01%.Key words:Corynebacteria glutamic acid ; enzymatic hydrolysis; response surface收稿日期:2

7、010-10-28作者簡(jiǎn)介:周大偉 (1985- , 男, 遼寧朝陽人, 在讀碩士研究生, 研究方向?yàn)榘l(fā)酵工程; 肖冬光 *, 教授, 通訊作者 。Research Report128··中 國(guó) 釀 造 2011年 第 2期 總第 227期制酶解反應(yīng)時(shí)間為 10h 。2.1.2pH 值對(duì)蛋白水解度的影響pH 值對(duì)蛋白水解度的影響見圖 2。 酶促反應(yīng)結(jié)果隨溶 液 pH 值的改變而發(fā)生變化, 每一酶促反應(yīng)均存在一個(gè)最適 宜作用 pH 值, 在低于最適 pH 值時(shí), 蛋白質(zhì)水解度隨 pH 值 的增大而提高, 當(dāng)達(dá)到最適 pH 值后, 隨 pH 值的增大, 水解 度反而下降, 由圖

8、 2可看出, 當(dāng) pH 值為 4時(shí), 酶解效果最好 。酶的添加比例對(duì)蛋白水解度的影響見圖 3。 從圖 3可 得出, 蛋白質(zhì)水解度隨著酸性蛋白酶與 -葡聚糖酶的添加 比例的增加而增加, 當(dāng)加酶比為 3 1時(shí)蛋白的水解度最高 ?？偧用噶繉?duì)蛋白水解的影響見圖 4。 由圖 4得出, 蛋白 質(zhì)水解度隨著加量酶的增大而提高, 這是因?yàn)槊讣恿康脑?大提高了酶對(duì)底物的作用能力, 由此可引起水解度的提高, 當(dāng)酶加量增大到一定數(shù)值時(shí), 蛋白質(zhì)分子對(duì)酶的需求量達(dá) 到飽和, 酶不再是提高蛋白質(zhì)水解率的限制性因素, 所以 水解率隨著酶加量的增大變得平緩 。 考慮生產(chǎn)成本等因 素, 選擇加酶量 2%比較合適 。底物濃度對(duì)

9、蛋白水解度的影響見圖 5。 底物濃度是影 響蛋白質(zhì)水解的重要因素, 加水量的多少直接影響酶與蛋 白質(zhì)互相作用的機(jī)率, 也影響互相作用的傳質(zhì)速度 。 加水 量少, 溶液的黏度大, 將影響傳質(zhì)過程的進(jìn)行, 水解不徹 底, 適當(dāng)增大加水量, 雖然蛋白質(zhì) -酶之間的互相作用機(jī)會(huì) 減少, 但加快了傳質(zhì)過程, 降低了體系的黏度, 有助于酶 解, 蛋白質(zhì)水解度也提高了 。 產(chǎn)物濃度過低難以濃縮, 不利 于生產(chǎn) 。 試驗(yàn)控制最大底物濃度為 15%。溫度對(duì)蛋白水解度的影響見圖 6。 在保持酶活力情況研究報(bào)告圖 1時(shí)間對(duì)蛋白水解度的影響Figure 1. Effect of time on hydrolysis

10、degree of cell protein圖 2pH 值對(duì)蛋白水解度的影響Figure 2. Effect of pH value on hydrolysis degree of cell protein圖 3酶添加比例對(duì)蛋白水解度的影響Figure 3. Effect of addition ratio of enzymes on hydrolysis degree of cell protein圖 4酶的添加總量對(duì)蛋白水解度的影響Figure 4. Effect of total addition of enzymes on hydrolysis degree of cell prote

11、in圖 5底物濃度對(duì)蛋白水解度的影響Figure 5. Effect of concentration of substrate on hydrolysis degree of cell protein圖 6溫度對(duì)蛋白水解度的影響Figure 6. Effect of temperature on hydrolysis degree of cell protein 129··2011No. 2Serial No. 227China Brewing根據(jù) Box-Benhnken 中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理, 進(jìn)行 4因 素 3水平的響應(yīng)面分析試驗(yàn), 以 pH 值 、 底物濃度 、

12、酸性蛋白 酶與葡聚糖酶的添加比例和水解溫度 4個(gè)重要因素為自 變量, 各因素編碼水平見表 1; 試驗(yàn)結(jié)果見表 2; 方差分析見 表 3。27個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)可以分為 2類, 其一是析因點(diǎn), 自變量取值 在 X 1、 X 2、 X 3、 X 4所構(gòu)成的三維頂點(diǎn), 共有 24個(gè)析因點(diǎn); 其二 是零點(diǎn), 為區(qū)域的中心點(diǎn), 零點(diǎn)試驗(yàn)重復(fù) 3次, 用以估計(jì)試 驗(yàn)誤差 。顯著; 失擬項(xiàng)反映的是試驗(yàn)數(shù)據(jù)與模型不相符的情況, p =0.1121>0.1,失擬不顯著, 因此模型選擇正確 。 同時(shí), 在模 型各參數(shù)中, 除 X 3、 X 1X 2、 X 1X 3、 X 1X 4、 X 2X 3、 X 2X 4、 X

13、 3X 4對(duì)蛋白 水解度無顯著影響外, 其他各項(xiàng)對(duì)響應(yīng)值均有較顯著的 影響 (可信度大于 90 。模型可信度分析表 4中復(fù)相關(guān)系數(shù)的平方 R 2=94.92%, 說明模型可以解釋 94.92%試驗(yàn)所得蛋白水解度的變化, 表明方程擬合較好 。 CV (YI 的變異系數(shù) 表示試驗(yàn)的精確 度, CV 值越高, 試驗(yàn)的可靠性越低, 試驗(yàn)中 CV=6.615353%, 較低, 說明試驗(yàn)操作可信 。 綜上說明回歸方程程給蛋白水 解提供了一個(gè)合適的模型 。以蛋白水解度為響應(yīng)值, 利用 statistica 軟件, 對(duì) Box-hehnken 試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行二次多項(xiàng)回歸擬合, 獲得多元二次回 歸方程:Y 1=1

14、6.52333+0.438333X1+3.400833X2+0.330833X3-0.508333X 4-2.305417X 1X 1-0.225X 1X 2+0.0475X1X 3+0.1525X1X 4-1.974167X 2X 2-0.115X2X3+0.4525X2X 4-0.819167X 3X 3-0.065X 3X 4-1.235417X 4X 4變量名稱 水平-101X 1pH 值3.54.04.5X 2濃度 /(g ·100mL -1 51015X 3酶的添加比例 2:13:14:1X 4水解溫度 /455055表 1Box-Behnken 試驗(yàn)因素水平Table

15、1. Factors and levels of Box-Behnken test 表 2Box-Behnken 試驗(yàn)結(jié)果 Table 2. Results of Box-Behnken test表 3響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果方差分析 Table 3. Variance analysis of RSM result X 112.3056332.3056332.8036680.119892X 21138.788138.788168.76730.0001X 311.3134081.3134081.5971150.230312X 413.1008333.1008333.7706370.076004X 1X

16、 1128.3463828.3463834.469420.0001X 1X 210.20250.20250.2462420.628698X 1X 310.0090250.0090250.0109740.918298X 1X 410.0930250.0930250.1131190.742429X 2X 2120.7857820.7857825.275670.000295X 2X 310.05290.05290.0643270.804077X 2X 410.8190250.8190250.9959410.337994X 3X 313.5788483.5788484.3519070.058979X

17、3X 410.01690.01690.0205510.888389X 4X 418.1400238.1400239.8983310.008435Model 14184.482213.177316.02370.0001(Linear 4145.507936.3769744.234680.0001(Quadratic 437.780999.44524811.485490.000454(Cross Product (Pure Error Total26方差來源 自由度 總偏差平 方和 平均偏差平 方和 F Pr >F 表 4模型的可信度分析 Table 4. Reliability analy

18、sis of modelsMaster Model平均值 0.906842復(fù)相關(guān)系數(shù) R 294.92%校正后的 R 289.00%變異系數(shù) CVResearch Report130··中 國(guó) 釀 造2011年 第 2期 總第 227期 對(duì)回歸模型求一階偏導(dǎo), 并令其等于零, 通過曲面的 嶺嵴分析可知, X 1, X 2, X 3, X 4的編碼值分別為 (0.053495, 0.848196, 0.145967, -0.05094 , 即 pH 值, 底物濃度, 酶的添 加比例和酶解溫度的最佳條件為 pH 值為 4.0, 底物濃度 15%, 酸性蛋白酶與 -葡聚糖酶的添加

19、比例為 3 1, 加酶量為 2%, 水解溫度 50 。 此時(shí), 響應(yīng)值 Y 達(dá)到最大值, 即蛋白的水解度 最大, 為 18.01%。在優(yōu)化條件下重復(fù)試驗(yàn) 3次, 蛋白水解度分別為 17.88、 18.15、 17.98, 與理論值相近, 從而驗(yàn)證了模型的正確性 。 3結(jié)論試驗(yàn)以酶解時(shí)間 、 加酶量 、 酶的添加比例 、 酶解溫度以 及酶解的 pH 值為因子, 以蛋白水解度為響應(yīng)值, 采用響應(yīng)面分析法得到回歸方程, 通過響應(yīng)面中心組合試驗(yàn), 得到 酶解谷氨酸菌體蛋白的最佳工藝:酸性蛋白酶與 -葡聚糖 酶的添加比例為 3 1, 總加酶量為 2%, pH 值為 4.0, 水解 溫度 50 , 底物濃

20、度 15%, 水解時(shí)間 10h , 在上述條件下, 蛋 白水解度為 18.01%。 參考文獻(xiàn):1楊小姣, 馮雪榮, 孫金斗, 等 . 谷氨酸發(fā)酵廢水中提取菌體蛋白研究進(jìn) 展 J.中國(guó)釀造, 2009(8 :20-23.2陳 寧 . 氨基酸工藝學(xué) M.北京:中國(guó)輕工業(yè)出版社, 2008. 3趙勝年 . 酶法水解鮮牛骨骼的研究 J.食品科學(xué),1995, 16(10 :38-40. 4晏志云 . 酵母抽提物的研究 D.廣州:華南理工大學(xué)碩士論文, 1999. 5王憲澤 . 生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)原理和方法 M.北京:中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社, 2002.我國(guó)在明朝就開始利用紅曲霉培制紅曲 。 紅曲可用 于釀酒 、制

21、醋, 也可作為豆腐乳的著色劑 。 紅曲霉的代謝 產(chǎn)物凝乳酶是干酪生產(chǎn)中所需要的一種重要酶, 主要作用 是能凝結(jié)牛乳, 同時(shí)凝乳酶對(duì)干酪的構(gòu)形成及干酪特有風(fēng) 味的形成有非常重要的作用 。 凝乳酶來源廣泛, 目前國(guó)際 市場(chǎng)上凝乳酶中動(dòng)物來源的約占 70%, 微生物來源的占 30%, 植物來源的不到 1%。 傳統(tǒng)的凝乳酶來源于吃乳的小牛皺 胃 (第 4胃紅曲霉發(fā)酵液 、 粉末活性炭 、 顆粒活性炭 、 硅膠 、 硅藻土 、722型紫外分光光度計(jì):上海天普分析儀器有限公司; 離心機(jī):長(zhǎng)沙英泰儀器有限公司; pH 計(jì):上海誠(chéng)寧環(huán)保科技有限公司; 恒溫水浴鍋 、電子天平 、 分析天平 、 量筒 、 移液 管 、以蒸餾水為空白, 在特定波長(zhǎng)處, 測(cè)定樣品脫色前后 的吸光度值 。 脫色率公式:脫色率 =(A 0-A 1 /A0×100%式中:A 0和 A 1分別為脫色前后濾液的吸光度值 。1.3.2酶活的測(cè)定方法 1紅曲霉發(fā)酵產(chǎn)物的脫色任慧賢, 王成忠 *, 張代國(guó)(山東輕工業(yè)學(xué)院 食品與生物工程學(xué)院, 山東 濟(jì)南 250353摘 要:以脫色率和酶活損失率為指標(biāo), 研究了 8種脫色劑對(duì)紅曲霉發(fā)酵液脫色的影響, 最終選擇了硅膠 。 通過單因素和正交試驗(yàn)對(duì)文獻(xiàn)