胚胎及新生期大鼠胃腸道胰島淀粉樣多肽與生長抑素的免疫組織化學

1、    胚胎及新生期大鼠胃腸道胰島淀粉樣多肽與生長抑素的免疫組織化學定位梁文妹石愛榮* (貴陽醫(yī)學院組織學胚胎學教研室，貴陽550004；*北京醫(yī)科大學組織學胚胎學系) 摘要為探討胚胎期及新生期大鼠胃腸道的胰島淀粉樣多肽(IAPP)與其他生物活性物質(zhì)的關系，用免疫組織化學PAP法，在相鄰切片上分別顯示第1521d大鼠胚胎及新生大鼠胃腸道的IAPP免疫反應性(IR)細胞和生長抑素(SS)IR細胞，觀察了IAPP與SS在胚胎及新生大鼠胃腸道的定位分布。結果表明：第15d胚胎，胃腸道內(nèi)未見IAPP-和SS-IR細胞。第17d胚胎，IAPP-與SS-IR細胞均很

2、少，免疫染色較弱，著色較淺，免疫反應性細胞散布于分化未完全的腸上皮細胞間。胚胎19d，IAPP-和SS-IR細胞出現(xiàn)于胃和小腸，以十二指腸為多。胚胎第21d及新生期，胃腸道各段均可見到IAPP-和SS-IR細胞。經(jīng)鄰片比較證明，胚胎第19d始至新生期，十二指腸和空腸中部分IAPP-IR細胞與部分SS-IR細胞的定位相同，表明IAPP與SS在十二指腸和空腸D細胞中有共存。胃、回腸、結腸和直腸未見到IAPP與SS有細胞內(nèi)共存的現(xiàn)象。本文對上述結果的意義進行了討論。 關鍵詞胰島淀粉樣多肽生長抑素胃腸道胚胎和新生大鼠 胰島淀粉樣多肽(islet amyloid polypeptide, IAPP)是一

3、種主要分布于胰腺的多肽激素，由37個氨基酸殘基組成1，2。目前關于IAPP在胰腺外定位的報道仍然很少。我們曾報道IAPP免疫反應性細胞在大鼠胚胎期、新生期及生后發(fā)育期胃腸道的個體發(fā)生和定位分布3，4。已有實驗證明，IAPP在胰腺內(nèi)與胰島素(insulin,Ins)和生長抑素(somatostatin, SS)均有細胞內(nèi)共存的關系57，但IAPP在胃腸道內(nèi)與SS在D細胞中有無共存以及相互關系如何目前尚未見報道。 本研究用鄰片單染免疫組織化學PAP法，觀察了IAPP、SS在大鼠胃腸道的分布及其在D細胞中是否共存，將為進一步了解胃腸內(nèi)分泌細胞中生物活性物質(zhì)間的相互關系提供形態(tài)學依據(jù)。 材料和方法 1

4、. 動物分組與標本制備 正常Wistar大鼠胚胎20只，新生Wistar大鼠5只，雌雄不拘。胚胎大鼠以查見母鼠有陰栓之日起計算受孕日期為0d，分為胚胎第15、17、19、21d組和新生期組，每組5只。孕鼠經(jīng)三氯甲烷吸入麻醉后，打開腹腔取出胎鼠。將第15、17d組胃腸道全長一起取材。第19d組按胃至十二指腸及其余腸道兩部分取材。第21d胎鼠及新生大鼠分別取胃體、胃竇、十二指腸、空腸、回腸、結腸和直腸。組織塊入Bouin液固定，石蠟包埋，連續(xù)切片，厚4m。將相同胎齡組同一組織的切片各取1片，裱于同一載片上，按順序編號，每例觀察切片3張以上，切片間隔36m。 2. 免疫組織化學方法 取相鄰組織切片，

5、用Sternberger PAP法分別顯示IAPP-及SS-IR細胞。切片常規(guī)脫蠟至水，用甲醇-H2O2封閉后，正常羊血清(150)室溫30min；兔IAPP抗血清(14 000，Peninsula Lab, USA產(chǎn)品)，兔SS抗血清(11 000，第二軍醫(yī)大學提供)，于4過夜；羊抗兔IgG(150)3745min；兔PAP復合物(1100)3745min；DAB-H2O2液顯色：蘇木精復染胞核，樹膠封片。 方法對照：以PBS分別代替IAPP和SS抗血清，其余步驟同上述。 結果 用PAP法顯示的IAPP-和SS-IR細胞，其反應產(chǎn)物為棕褐色細顆粒狀，存在于胞質(zhì)內(nèi)。方法對照均為陰性。 1. I

6、APP-IR細胞和SS-IR細胞的定位 第15d胚胎，胃腸道未見IAPP-和SS-IR細胞。第17d胚胎，胃腸道免疫反應性細胞很少，散在分布于分化未完全的上皮細胞間。第19d胚胎，IAPP-IR細胞仍少，見于胃和小腸，以十二指腸稍多，形狀多為錐形和柱狀。鄰片顯示的SS-IR細胞也見于胃和小腸，在胃中單個散在，小腸中也以十二指腸為多，存在于絨毛上皮及腸腺上皮細胞間，此時SS-IR胞體較小，多呈卵圓形，反應顆粒位于細胞的基底部(圖1)。第21d胚胎及新生期，胃腸道各段均可見到IAPP-及SS-IR細胞，兩種細胞仍以十二指腸為多。胃粘膜的SS-IR細胞仍較少，分布于上皮細胞基部間，靠近上皮，胞體較小

7、，胞體卵圓形(圖2)。在小腸，SS-IR細胞較多，形態(tài)多樣，有圓、卵圓、錐形等(圖3，5，7)。偶于絨毛固有層結締組織中可見到SS-IR細胞。結腸和直腸中也見到SS-IR細胞，數(shù)量較少，分散存在于粘膜上皮內(nèi)。 圖17免疫組織化學PAP法，蘇木精復染胞核 圖1第19d胚胎大鼠小腸。()示位于小腸絨毛上皮細胞間的SS-IR細胞。×268 圖2第21d胚胎大鼠胃。()示位于胃粘膜上皮細胞間的SS-IR細胞。×268 圖3新生大鼠十二指腸。()示位于腸絨毛上皮細胞間的SS-IR細胞。×268 圖4第21d胚胎大鼠十二指腸。()示腸絨毛上皮內(nèi)的IAPP-IR細胞。×

8、;268 圖5為圖4的鄰片。()示與IAPP-IR細胞定位相同的SS-IR細胞。×268 圖6新生大鼠十二指腸。()示腸絨毛上皮內(nèi)的IAPP-IR細胞。×134 圖7為圖6的鄰片。()示與IAPP-IR細胞定位相同的SS-IR細胞。×134 Fig.17 Immunohistochemical PAP method. Hematoxylin counterstain. Fig.1The small intestine of a rat embryo on the 19th day. showing the SS-IR cell located between ep

9、ithelial cells of a intestinal villus. ×268 Fig.2The stomach of a rat embryo on the 21st day. showing the SS-IR cell between gastric epithelium cells.×268 Fig.3The duodenum of a newborn rat. showing the SS-IR cell between epithelial cells of a intestinal villus.×268 Fig.4The duodenum

10、of a rat embryo on the 21st day. showing the IAPP-IR cell () in the epithelium of a intestinal villus.×268 Fig.5The adjacent section of Fig 4. showing the SS-IR cell had the same location as the one of IAPP-IR cells.×268 Fig.6The duodonum of a newborn rat. showing the IAPP-IR cell in the e

11、pithelial of a intestinal villus. ×134 Fig.7The adjacent section of Fig 6 showing the SS-IR cell () had a same location with IAPP-IR cells.×134 在胚胎和新生期大鼠胃腸道，IAPP-IR細胞與SS-IR細胞的發(fā)育比較相似。經(jīng)鄰片觀察，在各發(fā)育時間IAPP-IR細胞的數(shù)量均少于SS-IR細胞，免疫染色強度也較SS-IR細胞弱些，細胞形態(tài)也有不同，IAPP-IR細胞以錐形為多，而SS-IR細胞則以卵圓形為多。 2. IAPP與SS共存的形

12、態(tài)學觀察 經(jīng)相鄰切片觀察比較，第17d胚胎，胃腸道上皮分別有較少的IAPP-和SS-IR細胞，未見IAPP與SS在同一細胞內(nèi)有共存。第19d胚胎，發(fā)現(xiàn)十二指腸有少數(shù)細胞內(nèi)IAPP與SS定位相同。第21d胚胎至新生期大鼠，于十二指腸和空腸可見一些細胞既呈IAPP-IR又呈SS-IR，其中以十二指腸多見，多位于絨毛上皮內(nèi)(圖47)，但免疫染色強度有一定差異，即IAPP-IR細胞較SS-IR的染色弱些。在胃、回腸、結腸和直腸，則未見有上述現(xiàn)象。 討論 IAPP與Ins共存于胰島B細胞已為較多實驗所證實2，5。De Vroede等6曾在分離的大鼠胰島細胞中發(fā)現(xiàn)SS-IR細胞也顯示IAPP-IR。Ahr

13、en等7也在大鼠胰腺發(fā)現(xiàn)，除胰島B細胞外，D細胞也顯示IAPP免疫反應性。關于IAPP與SS是否也共存于胃腸道同一細胞，目前尚未見報道。本實驗觀察到從第19d胚胎至新生期大鼠十二指腸和空腸中部分IAPP-IR細胞與相鄰切片中部分SS-IR細胞定位一致，表明IAPP與SS在胚胎及新生大鼠胃腸道的D細胞中有共存現(xiàn)象。這一結果為拓寬IAPP的研究提供了新的形態(tài)學資料。 已有實驗證實，IAPP主要與糖穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)有關8，9。氨基酸序列分析顯示，IAPP與降鈣素基因相關肽(calcitonin generelated peptide, CGRP)有約50%的同源性，CGRP和IAPP都可抑制B細胞釋放Ins

14、并對Ins分泌起著局部旁分泌的調(diào)節(jié)作用10。病理學研究證明，IAPP與非胰島素依賴型糖尿病的發(fā)病密切相關1，2，一些神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤如類癌等也顯示IAPP免疫反應性11。早有文獻報道，生長抑素細胞可釋放CGRP12。本實驗結果發(fā)現(xiàn)IAPP與SS也共存于腸道D細胞，表明D細胞與IAPP和CGRP的釋放可能均有關系。Dharmsathaphorn等13曾報道SS可緩解類癌綜合癥引起的分泌性腹瀉，Davis等14也有類似觀察。有實驗證明，在糖的刺激下IAPP和Ins同時釋放，但IAPP的釋放又為SS所抑制8。因此我們推測，IAPP和SS在D細胞中有共存，有可能是通過自分泌的方式相互進行調(diào)節(jié)，在功能上可

15、能相互影響。但對于在腸道D細胞中IAPP與SS共存究竟發(fā)揮何種生物學反應及其調(diào)控機制，有待進一步研究。 收稿 1997-09修回 1997-12 參考文獻 1Westermark P, Wernstedt C, O'Brien TD, et al. Islet amylois in type 2 human diabetes mellitus and adult diabetic cats in composed of a novel putative polypeptide hormone. Am J Pathol, 1987, 127(3):414 2Sanke T, Nishi

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18、 gene related peptide and islet amyloid polypeptide in the rat and mouse pancreas. Cell Tissue Res, 1992, 269(2):315 8Mitsukawa T, Takemura J, Asai J, et al. Islet amyloid polypeptide response to glucose, insulin and somatostatin analogue administration. Diabetes, 1990, 39(5):639 9Bretherton- Watt D

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20、armacol, 1995,17(1):35 11Bretherton- Watt D, Chatel MA, Suda K, et al. IAPP(Amylin) in normal human tissues and neuroendocrine tumours. J Endocrinol, 1990, 124(suppl):109 12潘國宗.胃腸激素研究的進展.生理科學進展，1989，20(2)：182 13Dharmsathaphorn K.Sherwin RS,Cataland S,et al.Somatostatin inhibits diarrhea in the carci

21、niod syndrome.Ann Int Med,1980,92(1):68 14Davis GR,Camp RC,Raskin P,et al.Effect of somatostatin infusion on jejunal water and electrolyte transport in a patient with secretory diarrhea due to malignant carcinoid syndrome.Gastroenterology,1980,78(2):346 IMMUNOHISTOCHEMICAL LOCALIZATION OF IAPP AND S

22、S IN THE GASTROINTESTINAL TRACT OF FETAL AND NEWBORN RATS Liang Wenmei Shi Airong (Department of Histology and Embryology, Guiyang Medical College, Guiyang; Department of Histology and Embryology, Beijing Medical University, Beijing) In order to explore the relationship between islet amyloid polypep

23、tide (IAPP) and classical transmitters in the gastrointestinal tract of fetal and newborn rat, the distribution of IAPP immunoreactive (IR) cells and somatostatin (SS)-IR cells were shown on serial adjacent sections separately by use of the immunohistochemical PAP method in this study. The coexisten

24、ce of IAPP and SS in the gastrointestinal tract of fetal and newborn rat was examinaed. The result showed that no IAPP-or SS-IR cell was found in the gastrointestinal tract on the 15th day. On the 17th day, a few IAPP-and SS-IR cells could be observed in the differentiating intestinal epithelium. On the 19th day, IA