熒光光度法測定血卟啉在荷瘤小鼠體內(nèi)的分布

1、西北大學(xué)學(xué)報 (自然科學(xué)版 2005年 8月 , 第 35卷第 4期 , Aug . , 2005, Vol . 35, No . 4Journal of North west University (Natural Science Editi on 收稿日期 :200321229 基金項目 :國家自然科學(xué)基金資助項目 (39870240; 30270383 ; 陜西師范大學(xué)研究生培養(yǎng)創(chuàng)新基金資助項目 作者簡介 :湯 薇 (19812 , 女 , 陜西西安人 , 陜西師范大學(xué)碩士生 , 從事生物醫(yī)學(xué)超聲研究 。熒光光度法測定血卟啉在荷瘤小鼠體內(nèi)的分布湯 薇 , 劉全宏 , 劉書瑗(陜西師范大學(xué)

2、 生命科學(xué)學(xué)院 , 陜西 西安 710062摘要 :目的 通過測定血卟啉 (HpD 在荷瘤小鼠體內(nèi)的分布 , 為聲動力療法處理不同部位腫瘤的 時間點提供依據(jù) 。 方法 利用熒光分光光度計測定組織提取液中血卟啉的熒光強度 , 根據(jù)標準曲線計算其在組織中的含量 。 結(jié)果 腫瘤組織中 HpD 的含量低于肝 、 腎組織而高于皮膚 、 肌肉 。與 其他組織相比 , 腫瘤組織中 HpD 代謝速度最緩慢 , 說明其對 HpD 的潴留能力 根據(jù)各組織 內(nèi)的不同代謝情況 , 提出不同部位的腫瘤 , , 認為聲動力療 法抗腫瘤處理的時間點應(yīng)選擇在 2472h 之間 。關(guān) 鍵 詞 :熒光光度法 ; 血卟啉 ; S1

3、80; 中圖分類號 :Q274 文獻標識碼 : (2005 0420436204 日本學(xué)者 Ume (Sonodyna m ic , 即利用超聲激 胞內(nèi) 的血卟 啉 (HpD 殺傷癌細胞的方法 1。由于該方法對于治 療腫瘤細胞有較強的針對性以及對正常組織的無創(chuàng) 傷性 , 所以對于治療腫瘤 , 特別是組織深層腫瘤有著 較好的應(yīng)用前景2。由于 HpD 是受超聲激活后產(chǎn)生對癌細胞的殺 傷作用 , 所以 HpD 在組織內(nèi)的濃度變化是恰當選擇 超聲處理時間點的重要依據(jù) , 它直接關(guān)系到治療腫 瘤的有效性 。 國內(nèi)外學(xué)者在進行此方面研究時曾利 用同位素標記 HpD 來追蹤代謝過程 3, 4, 雖然準確性高

4、 , 但同位素實驗標記復(fù)雜 、 易受半衰期影響 、 耗資較多且對人體不安全 。HpD 作為一種光敏劑 , 受一定波長的光激發(fā)后會產(chǎn)生紅色熒光 , 而且在一定范圍內(nèi)熒光強度與 HpD 濃度成正線性關(guān)系 , 所以可采用熒光光度法檢測腫瘤組織內(nèi)光敏劑含量 。但是 , 目前用此法測定 荷瘤小鼠體內(nèi) HpD 代謝狀況的報道在國內(nèi)尚不多 見 。 本實驗擬設(shè)置不同時間段 、 多檢測點取材 , 采用 熒光光度法測定組織內(nèi) HpD 的濃度變化 。通過測 定 , 為聲動力療法處理不同部位腫瘤的時間點提供 依據(jù) 。1 材料和方法1. 1 材 料實驗所用 HpD 衍生物為單羥乙基單乙烯基次 卟啉 , 由 Sig ma

5、 公司提供 , 0. 1mol/l P BS (pH 7. 27. 4 避光溶解 , 使其終濃度為 2. 5mg/mL,過濾滅菌 , 分裝于 Eppendof 管中 , 避光 -20 保存 。 S180腫瘤細胞系由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所引進 , 陜 西省中醫(yī)藥研究院實驗動物中心提供 。 MCR 系小 白鼠 (雌性 , 體重 1822g , 由陜西省中醫(yī)藥研究 院實驗動物中心提供 。 F 22500型熒光分光光度計 是日本 H itachi 公司產(chǎn)品 。 1. 2 方 法接種 S180腫瘤細胞于小鼠右前肢皮下 , 約一周 后 , 將小鼠隨機分為 8組 , 每組 3只 , 尾靜脈注射 HpD 0

6、. 2mL /只 , 使其終濃度為 25mg/kg, 避光飼養(yǎng) 。 分別于 2h, 8h, 12h, 24h, 36h, 48h, 72h, 96h 取材 。 取材時進行背部脫毛 , 摘眼球取血法取血 , 頸 椎離斷法處死小鼠 , 取肝臟 、 腎臟 、 背部皮膚 、 大腿肌 肉和腫瘤組織放于冷生理鹽水中洗滌 。 將余血洗凈 后制得樣品 , 將樣品稀釋至線形范圍內(nèi)后 , 用熒光光 度法 (激發(fā)波長 405n m , 發(fā)射波長 598nm 測定各 樣品熒光強度57(以正常荷瘤小鼠相應(yīng)組織為零 對照 , 根據(jù)標準曲線得出其在組織內(nèi)的濃度 。2 結(jié) 果2. 1 標準曲線繪制配制不同濃度的 HpD 溶液

7、測定熒光值繪制標 準曲線 (表 1, 圖 1 , 并做相關(guān)回歸分析 。回歸方 程 :y =241. 04x +3. 5257(r =0. 9947, p 0. 05 。 表 1 Hp D 梯度濃度和熒光強度Tab . 1 Grad i en t concen tra ti on and fluorescencei n ten sity of Hp D濃度 /g mL -1熒光強度 濃度 /g mL -1熒光強度 0. 0110. 090. 5116. 90. 02514. 231. 0209. 20. 0523. 441. 2319. 40. 126. 971. 4. 2. 2 HpD 2.

8、2. 1 HpD 的熒光強度和濃度 (表 2, , 利用熒光圖 1 HpD 標準曲線Fig . 1 Standard graph of HpD分光光度計測定 HpD 在各組織內(nèi)熒光強度隨時間的變化 , 結(jié)果見表 2。 經(jīng)回歸方程計算 , 得到 HpD 在 血漿和各組織內(nèi)的濃度 , 結(jié)果見表 3。 2. 2. 2 HpD 的濃度 -時間曲線 (圖 2, , 血漿中 HpD 代 , 8迅速分布于各組織 , 848h 后 , 平臺區(qū)濃度幾乎無 腎組織在靜脈注射 2h 后 , HpD 濃度最 高 , 然后迅速下降 。 12h 時有小回升 , 隨后繼續(xù)下 降 。 皮膚和肌肉中的 HpD 含量不高 , 同

9、樣在靜脈注 射 2h 后迅速下降 , 然后曲線基本趨于平緩 , 在低水 平狀態(tài)維持 。 腫瘤組織中的 HpD 濃度在靜脈注射 后逐漸上升 , 12h 時達最大值 , 隨后緩慢下降 。 36h表 2 靜脈注射后 Hp D 在體內(nèi)的熒光強度變化Tab . 2 Changes of fluorescence i n ten sity of Hp D after i n travenous i n jecti on時 間 /h血漿 /g mL -1肝臟 /g g -1腎臟 /g g -1腫瘤 /g g -1皮膚 /g g -1肌肉 /g g -12305. 2082. 8576. 7643. 4941

10、. 8916. 62894. 4658. 4449. 5547. 4918. 4812. 081270. 1356. 1257. 3754. 3416. 718. 552430. 9451. 0743. 1738. 7312. 798. 383612. 7645. 3436. 1026. 6612. 507. 71488. 6341. 0029. 8030. 6610. 246. 07728. 2638. 0928. 8829. 938. 346. 43964. 5834. 1525. 0623. 019. 204. 82表 3 靜脈注射后 Hp D 在血漿和各組織內(nèi)的濃度Tab . 3 Co

11、ncen tra ti on of Hp D i n pl a s ma and tissues after i n travenous i n jecti on時 間 /h血漿 /g mL -1肝臟 /g g -1腎臟 /g g -1腫瘤 /g g -1皮膚 /g g -1肌肉 /g g -1250. 0613. 1612. 156. 636. 372. 17815. 099. 117. 647. 302. 481. 421211. 058. 738. 948. 432. 190. 84244. 557. 896. 585. 841. 540. 81361. 536. 945. 413. 8

12、41. 490. 69480. 856. 224. 364. 501. 110. 42720. 795. 744. 214. 380. 800. 48960. 185. 083. 573. 230. 940. 22734 第 4期 湯 薇等 :熒光光度法測定血卟啉在荷瘤小鼠體內(nèi)的分布 圖 2 靜脈注射后血漿內(nèi) HpD 濃度隨時間的變化Fig . 2 Change of HpD concentrati on in p las ma after intrave 2nous injecti on圖 3 HpD 在組織中的濃度變化Fig . 3 Change of HpD concentrati on

13、 in tissues after intrave 2nous injecti on后保持在一定濃度 , 曲線基本無變化 。可見 HpD 在 肝 、 腎組織中含量較高 , 皮膚和肌肉中含量較少 , 實 體瘤與血漿 、 皮膚和肌肉相比 , 靜脈注射 24h 后濃 度相對較高 , 48h 后濃度高于腎 , 肝臟中的 HpD 濃 度一直高于腫瘤 。與其他組織相比 , 腫瘤組織中 HpD 代謝速度最緩慢 , 說明其對 HpD 有較強的潴留能力 。3討論與結(jié)論根據(jù) HpD 在體內(nèi)隨時間的分布情況可知 , 靜脈 注射 2h 時血漿內(nèi) HpD 濃度最高 , 并且其他組織內(nèi) HpD 的含量大于或近似于腫瘤組織

14、 , 故不宜進行超聲處理 。靜脈注射 12h 時 , 腫瘤中 HpD 濃度達最 大值 , 皮膚 、 肌肉中的濃度遠低于腫瘤組織 。 雖然血 漿中的濃度仍較高 , 但皮膚中血管分布很少 , 血流量 小 , 故可對淺表腫瘤進行超聲處理 。靜脈注射 48h 時 , 血漿 、 皮膚 、 肌肉中 HpD 濃度均遠小于腫瘤組織 , 應(yīng)為相對安全的超聲處理時間點 , 此時處理對周 圍正常組織損傷最小 , 且可有效殺傷腫瘤組織 , 但 肝 、 腎中 HpD 濃度仍與腫瘤組織相近 。 靜脈注射 72h 后 , 其他組織和腫瘤內(nèi) HpD 濃度均降到較低值 ,此時處理雖然安全 , 但殺傷效果降低 。這可能是由于血卟

15、啉主要經(jīng)肝膽腸系統(tǒng)及腎臟排泄 , 所以肝 、 腎 中 HpD 濃度一直高于或近似于腫瘤組織 , 超聲處理 應(yīng)特別注意肝 、 腎腫瘤 。 由此可見 , 不同部位的腫瘤 在選擇最佳超聲處理時間點應(yīng)不同 。許多學(xué)者 利用 其 他 方 法 也 得 到 了 類 似 的 結(jié) 果 8, 9, 但也有學(xué)者認為 , 靜脈注射 8h 后 , 腫瘤組織 中 HpD 分布較多 , 血漿中 HpD 濃度低于腫瘤組 織 3。 實驗結(jié)果表明 , 在靜脈注射 12h 后 , 血漿仍 保持較高的 HpD 濃度 。因此 , 我們認為 , 聲動力療法抗腫瘤處理的時間點應(yīng)選擇在 24h 72h 之間 。與同位素測定相比 , 熒光法更

16、加簡便易行 , 靈敏準 確 , , 且穩(wěn) 定性高 , 。:MURA S, Y UM I T A N, N ishiqaki R, et al . Mecha 2nis m of cell da mage by ultras ound in combinati on with he 2mat opor phyrin J .Jap J Cancer Res, 1990, 81(9 :9622966.2 孫世惠 , 劉全宏 , 齊 浩 , 等 . 低強度超聲激活血卟啉對 S180細胞的殺傷作用 J .西北大學(xué)學(xué)報 (自然科 學(xué)版 , 2002, 32(2 :2112213.3 靖士俠 , 竇明金 ,

17、 吳思恩 , 等 .131I 2HpD 在小鼠體內(nèi)的吸收 、 分布和排泄 J .中國激光醫(yī)學(xué)雜志 , 1994, 3(5 :2632268.4G OMER C J, DOUGHERTY T J. Deter m inati on of 3H 2and14C he mat opor phyrin derivative distributi on in ma 2lignant and nor mal tissueJ .Cancer Research, 1979, 39(1 :1462151.5 王克勤 , 梁亞云 . 血卟啉衍生物在生物體內(nèi)的熒光測定法 J .藥學(xué)通報 , 1986, 21(2 :

18、84286.6 陳祖林 , 單治堂 , 羅云生 , 等 . S W 480癌細胞內(nèi)光敏劑含量檢測 J .中華物理醫(yī)學(xué)雜志 , 1997, 19(2 :72274.7 崔國輝 , 沈 琳 , 張 蕾 , 等 . 血卟啉衍生物脂質(zhì)體瘤內(nèi)注射給藥在荷瘤鼠體組織中的藥物分布 J .北 京大學(xué)學(xué)報 (醫(yī)學(xué)版 , 2001, 33(3 :2552257.8 S VANBERG K, KJE LLE N E, ANKERST J, et al . Fluo 2rescence studies of he mat opor phyrin derivative in nor mal and malignant

19、rat tissue J .Cancer Research, 1986, 46(8 :380323808.9 BUGE LSKI P J, P ORTER C W , DOUGHERTY T J. Au 2t oradi ographic distributi on of he mat opor phyrin derivative in nor mal and tu mor tissue of the mouse J .Cancer Re 2search, 1981, 41(11 :460624612.(編 輯 徐象平 834 西北大學(xué)學(xué)報 (自然科學(xué)版 第 35卷 Deter m i n a

20、ti on of Hp D distr i buti on i n tu mor beari n gmouse with fluorescence photo meterT ANG W ei, L I U Quan 2hong, L I U Shu 2yuan(Collage of L ife Science, Shaanxi Nor mal University, Xi an 710062, China Abstract:A i m T o p r ovide s ome basis for S DT t o dis pose tu mor at different positi on by

21、 deter m ining the distribu 2ti on of HpD in tu mor bearing mouse . M ethods The fluorescence intensities of tissues extracti ons were deter m ined t o esti m ate HpD concentrati on with fluorescence phot ometer based on the standard graph . Results HpD concentra 2ti on in tumor tissue was higher th

22、an that in skin and muscle but was l ower than in liver and kidney . I n comparis on with other tissues, metabolic vel ocity of HpD was the l owest in tumor tissue . Conclusi on According t o different metabolic vel ocity in each tissue, the vie w that tu mors in different positi on should be dis po

23、sed at app r op riate ti m e res pectively was put for ward and the best treat m ent ti m e was bet w een 24h 72h . Key words:fluorescence phot ometer; HpD; S180; S DT (上接第 435頁 參考文獻 :1 MONOD J L. 1980, (5 :24227.2 美 ERV I N -M.閔家胤譯 . 北京 :, 1988. 78286.3 英 鮑勃霍姆斯 . 各就各位 -預(yù)備 -進化 J .新科學(xué)家 , 2002, (9 :62

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25、準化初探 J .西北大學(xué)學(xué)報 (自然科學(xué) 版 , 1999, 29(2 :1682171.9 魏 諾 . 非線性科學(xué)基礎(chǔ)與應(yīng)用 M.北京 :科學(xué)出版社 , 2004. 1502152.10王興元 . 復(fù)雜非線性系統(tǒng)中的混沌 M.北京 :電子工業(yè)出版社 , 2003. 1142121.(編 輯 徐象平 The opti m i zi n g selecti ve mechan is m of the evoluti on of li feW E I Nuo 1, Y ANG L ian 2an2(1. School of Science, Xi an University of A rchite

26、cture &Technol ogy, Xi an 710055, China; 2. Depart m ent of U rban and Res ource,North west University, Xi an 710069, China Abstract:A i m T o p resent the op ti m izing selective mechanis m of the evoluti on of creatures and de monstrate it . M ethods Based on Dar win s theory of natural selectivit

27、y, the op ti m izing selective mechanis m of the evoluti on of creatures is p resented thr ough adop ti on of s ome ideas of non -Dar winis m and grand evoluti onary synthesis . Results The op ti m izing selective is based on the chaotic p r operty of creatures and the directi on depends on adap tati on .Considering the adap tati on t o