質(zhì)粒DNA的雙酶切

1、一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?通過本實(shí)驗(yàn)讓學(xué)生掌握質(zhì)粒DNA雙酶切的原理和操作方法二、實(shí)驗(yàn)原理限制性內(nèi)切酶是一類能識(shí)別雙鏈DNA分子特異性核酸序列的DNA水解酶。每一種內(nèi)切酶能識(shí)別DNA分子中由46個(gè)核苷酸組成的特定序列多種細(xì)菌能合成限制性內(nèi)切酶，這是它們保護(hù)自己，降解外來DNA分子的重要手段。細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)的DNA由于相應(yīng)序列上的A或C堿基的甲基化而不被限制性內(nèi)切酶攻擊，而外源DNA一旦進(jìn)入細(xì)胞則立即被識(shí)別，雙股DNA螺旋都被切斷，這種現(xiàn)象被稱為寄主控制的限制與修飾現(xiàn)象限制性內(nèi)切酶是體外剪切基因片段的重要工具，常常與核酸聚合酶、連接酶以及末端修飾酶等一起稱為工具酶限制性內(nèi)切酶按限制酶的組成、與修飾酶活性關(guān)系以及

2、切斷核酸的情況不同，分為三類：型、型和型 型限制性內(nèi)切酶能識(shí)別專一的核苷酸順序，并在識(shí)別點(diǎn)附近的一些核苷酸上切割DNA分子中的雙鏈，但是切割的核苷酸順序沒有專一性，是隨機(jī)的。這類限制性內(nèi)切酶在DNA重組技術(shù)或基因工程中用處不大，無法用于分析DNA結(jié)構(gòu)或克隆基因。這類酶如EcoB、EcoK等 型限制性內(nèi)切酶能識(shí)別專一的核苷酸順序，并在該順序內(nèi)的固定位置上切割雙鏈。由于這類限制性內(nèi)切酶的識(shí)別和切割的核苷酸都是專一的。因此，這種限制性內(nèi)切酶是DNA重組技術(shù)中最常用的工具酶之一。這種酶識(shí)別的專一核苷酸順序最常見的是4個(gè)或6個(gè)核苷酸，少數(shù)也有識(shí)別5個(gè)核苷酸以及7個(gè)、8個(gè)、9個(gè)、10個(gè)和11個(gè)核苷酸的。型

3、限制性內(nèi)切酶的識(shí)別順序是一個(gè)回文對(duì)稱順序，即有一個(gè)中心對(duì)稱軸，從這個(gè)軸朝二個(gè)方向“讀”都完全相同。這種酶的切割可以有兩種方式：粘性末端：是交錯(cuò)切割，結(jié)果形成兩條單鏈末端，這種末端的核苷酸順序是互補(bǔ)的，可形成氫鍵，所以稱為粘性末端。 如EcoRI的識(shí)別順序?yàn)椋?5 GAA|TTC 3 3 C T T|AAG .5 |表示中心對(duì)稱軸，從兩側(cè)“讀”核苷酸順序都是GAATTC或CTTAAG，這就是回文順序。 表示在雙鏈上交錯(cuò)切割的位置，切割后生成兩個(gè)DNA片段，各有一個(gè)單鏈末端，兩條單鏈?zhǔn)腔パa(bǔ)的，其斷裂的磷酸二酯鍵以及氫鍵可通過DNA連接酶的作用而“粘合”平頭末端：型酶切割方式的另一種是在同一位置上切

4、割雙鏈，產(chǎn)生平頭末端。例如EcoRV 的識(shí)別位置是： 5 GAT|ATC 3 3 CTA|TAG 5 切割后形成兩種片段，片段末端同樣可以通過DNA連接酶連接起來 型限制性內(nèi)切酶也有專一的識(shí)別順序，但不是對(duì)稱的回文順序，在識(shí)別順序旁邊幾個(gè)核苷酸對(duì)的固定位置上切割雙鏈。但這幾個(gè)核苷酸對(duì)不是特異性的。因此，這種限制性內(nèi)切酶切割后產(chǎn)生的一定長(zhǎng)度DNA片段，具有各種單鏈末端。因此不能應(yīng)用于基因克隆 影響限制性內(nèi)切酶活性的因素：DNA的純度DNA的甲基化程度酶切消化反應(yīng)的溫度DNA的分子結(jié)構(gòu)溶液中離子濃度及種類緩沖液的pH值雙酶切的兩種酶介紹 Xho酶（TaKaRa公司） 識(shí)別序列和切割位點(diǎn)： EcoR酶（TaKaRa公司） 識(shí)別序列和切割位點(diǎn)：三、儀器、材料與試劑 水浴鍋 移液槍和槍頭 制冰機(jī) 浮板 R-pGEX-4T-1質(zhì)粒DNA Xho酶 EcoR酶 10H Buffer 無菌水 小離心管四、實(shí)驗(yàn)步驟質(zhì)粒DNA的雙酶切 反應(yīng)體系： 反應(yīng)條件：溫度37，酶切1.5h瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)酶切結(jié)果紫外線投射儀觀察結(jié)果UVP凝膠成像系統(tǒng)記錄結(jié)果（電泳圖）EcoR1LXho1L10H Buffer2L質(zhì)粒DNA10L12L1g無菌水6L 4L總體積20L（無菌水補(bǔ)