2015初始污染菌實驗方法驗證

1、初始污染菌實驗方法驗證方案產(chǎn)品名稱：一次性包皮環(huán)切縫合器編制： 日期： 審核： 日期： 批準(zhǔn)： 日期： 江西狼和醫(yī)療器械股份限有限公司目錄初始污染菌實驗方法驗證方案1概述2驗證目的3職責(zé)與驗證申請4驗證依據(jù)5驗證計劃6驗證內(nèi)容初始污染菌實驗方法驗證方案1.概述：初始污染菌的數(shù)量可以反映出車間環(huán)境衛(wèi)生的清潔度，與產(chǎn)品滅菌工藝、成品熱原及內(nèi)毒素有直接關(guān)系，故而要對其檢測方法進(jìn)行驗證，確認(rèn)其有效性及檢測準(zhǔn)確性，從而優(yōu)化產(chǎn)品滅菌工藝及控制產(chǎn)品熱原及內(nèi)毒素，確保產(chǎn)品的安全性。2.目的： 通過實驗驗證檢測方法的適用性及計數(shù)用培養(yǎng)基的適用性。3.職責(zé)與驗證申請：3.1質(zhì)量管理部提供檢測項目方案、接收標(biāo)準(zhǔn)、評

2、價等級及相關(guān)實驗。3.2生產(chǎn)技術(shù)部負(fù)責(zé)按驗證方案生產(chǎn)相關(guān)樣品初始污染菌實驗方法驗證申請表驗證組姓名職務(wù)單位黃燕組長質(zhì)量管理部經(jīng)理江西狼和醫(yī)療器械股份有限公司龍章宏組員化驗員蘇俊組員化驗員胡梓鵬組員化驗員批 準(zhǔn)經(jīng)研究：同意以上成員組成驗證小組，按照此方案對本公司的產(chǎn)品的初始污染菌實驗方法進(jìn)行驗證。批準(zhǔn)人： 年 月 日4.依據(jù)：中國藥典2015版5.驗證計劃：5.1實驗操作人員確認(rèn)；5.2實驗室實驗設(shè)備及器材的確認(rèn)；5.3產(chǎn)品取樣及方法確認(rèn)。6.驗證內(nèi)容：6.1菌種和菌液制備6.1.1 菌種 試驗用菌株的傳代次數(shù)不得超過5 代（從菌種保藏中心獲得的干燥菌種為第0 代），并采用適宜的菌種保藏技術(shù)進(jìn)行

3、保存，以保證試驗菌株的生物學(xué)特性。6.1.2菌液制備接種金色葡萄球菌、銅綠假胞菌、枯草芽孢桿菌的培養(yǎng)物至胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中或胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基上，3035培養(yǎng)1824小時；接種白色念珠菌的培養(yǎng)物至沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基中或沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基上，2025培養(yǎng)2-3天，上述培養(yǎng)后的新鮮培養(yǎng)物用PH7.0無菌化鈉-蛋白胨緩沖液或0.9%無菌化鈉溶液制成每lml菌數(shù)小于100cfu(菌落形成）的菌懸液。接種黑曲霉的培養(yǎng)物至沙氏葡萄糖瓊脂面培養(yǎng)基上，2025培養(yǎng)57天，加人35 ml 0.05%(ml/ml) 聚山梨酯80的pH7.0無菌化鈉-蛋白胨緩沖液或0.9%無菌氯化鈉溶液，將孢子洗脫。然后

4、，采用適宜的方法吸出孢子懸液至無菌試管內(nèi)，用0.05% (ml/ml)聚山梨醋80的pH7.0無菌化鈉-蛋白胨緩沖液或0.9%無菌氯化鈉溶液制成每lml孢子數(shù)量小于100cfu的孢子懸液。菌懸液若在室溫下放置，應(yīng)在2小時內(nèi)使用；若保存在28 在24h 內(nèi)使用。黑曲霉孢子懸液存在28，在驗證過的貯存期內(nèi)用。6.2計數(shù)培養(yǎng)基適用性檢查6.2.1需氧菌的計數(shù)分別取1ml的金色葡萄球菌、銅綠假胞菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌、黑曲霉各菌懸液，接種至胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基管或胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基平板。金色葡萄球菌、銅綠假胞菌、枯草芽孢桿菌在30-35，培養(yǎng)不超過3天；白色念珠菌、黑曲霉在20-25，培養(yǎng)不超

5、過5天。每一試驗菌株平行制備2 管或2 個平皿。同時，用相應(yīng)的對照培養(yǎng)基替代被檢培養(yǎng)基進(jìn)行上述試驗。6.2.2霉菌和酵母菌的計數(shù)分別取1ml的白色念珠菌、黑曲霉各菌懸液，接種至沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基。在20-25，培養(yǎng)不超過5天。每一試驗菌株平行制備2 管或2 個平皿。同時，用相應(yīng)的對照培養(yǎng)基替代被檢培養(yǎng)基進(jìn)行上述試驗。6.2.2結(jié)果判定被檢固體培養(yǎng)基上的菌落平均數(shù)與對照培養(yǎng)基上的菌落平均數(shù)的比值應(yīng)在0.5-2 范圍內(nèi)，且菌落形態(tài)大小應(yīng)與對照培養(yǎng)基上的菌落一致；被檢液體培養(yǎng)基管與對照培養(yǎng)基管比較，試驗菌應(yīng)生長良好。6.2.3試驗結(jié)果見表16.3計數(shù)方法驗證6.3.1供試液的制備：洗脫液用0.9%

6、的滅菌生理鹽水，檢品液制備在10000級環(huán)境中進(jìn)行。6.3.2 接種和稀釋按下列要求進(jìn)行供試液的接種和稀釋,制備微生物回收試驗用供試液。所加菌液的體積應(yīng)不超過供試液體積的1%。為確認(rèn)供試品中的微生物能被充分檢出，首先應(yīng)選擇最低稀釋級的供試液進(jìn)行計數(shù)方法適用性試驗。（1）試驗組 取上述制備好的供試液，加入試驗菌液，混勻，使每1ml供試液或每張濾膜所濾過的供試液中含菌量不大于100cfu。（2）供試品對照組 取制備好的供試液, 以稀釋液代替菌液同試驗組操作。（3）菌液對照組 取不含中和劑及滅活劑的相應(yīng)稀釋液替代供試液,按試驗組操作加入試驗菌液并進(jìn)行微生物回收試驗。若因供試品抗菌活性或溶解性較差的原

7、因?qū)е聼o法選擇最低稀釋級的供試液進(jìn)行方法適用性試驗時，應(yīng)采用適宜的方法對供試液進(jìn)行進(jìn)一步的處理。如果供試品對微生物生長的抑制作用無法以其他方法消除，供試液可經(jīng)過中和、稀釋或薄膜過濾處理后再加入試驗菌懸液進(jìn)行方法適應(yīng)性試驗。 6.3.3 抗菌活性的去除或滅活供試液接種后，按下列“微生物回收”規(guī)定的方法進(jìn)行微生物計數(shù)。若試驗組菌落數(shù)減去供試品對照組菌落數(shù)的值小于菌液對照組菌數(shù)值的50%，可采用下述方法消除供試品的抑菌活性。 增加稀釋液或培養(yǎng)基體積。 加入適宜的中和劑或滅活劑。6.3.4 微生物的回收按照6.2的計數(shù)培養(yǎng)基所用的試驗菌逐一進(jìn)行微生物回收試驗，回收試驗采用平皿法和薄膜過濾法。6.3.4

8、.1 平皿法-傾注法取6個直徑90mm 的無菌平皿。2個分別注入照上述“試驗組”制備的供試液1ml；2個分別注入照上述“供試品對照組”制備的供試液1ml；2個分別注入照上述“菌液對照組”制備的供試液1ml。每個平皿注入1520ml 溫度不超過45熔化的胰酪大豆胨瓊脂或沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基，混勻，凝固，倒置培養(yǎng)。計算各試驗組的平均菌落數(shù)。6.3.4.2平皿法試驗結(jié)果見表26.3.4.3 薄膜過濾法薄膜過濾法所采用的濾膜孔徑應(yīng)不大于 0.45m,直徑一般為50mm,若采用其他直徑的濾膜,沖洗量應(yīng)進(jìn)行相應(yīng)的調(diào)整。選擇濾膜材質(zhì)時應(yīng)保證供試品及其溶劑不影響微生物的充分被截留。濾器及濾膜使用前應(yīng)采用適宜的

9、方法滅菌。使用時,應(yīng)保證濾膜在過濾前后的完整性。供試液經(jīng)薄膜過濾后,若需要用沖洗液沖洗濾膜,每張濾膜每次沖洗量一般為100ml?？倹_洗量不得超過1000ml,以避免濾膜上的微生物受損傷。取照上述 “試驗組”、“供試品對照組”和“菌液對照組”制備的供試液適量（一般取相當(dāng)于1g、1ml 或10cm2 的供試品, 若供試品中所含的菌數(shù)較多時，供試液可酌情減量），加至適量的稀釋液中,混勻,過濾。用適量的沖洗液沖洗濾膜。每株試驗菌每種培養(yǎng)基至少制備一張濾膜。若測定需氧菌總數(shù)，轉(zhuǎn)移濾膜菌面朝上貼于胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基平板上；若測定霉菌和酵母總數(shù)，轉(zhuǎn)移濾膜菌面朝上貼于沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基平板上。6.3.4.

10、4薄膜過濾法計數(shù)方法驗證實驗結(jié)果見表3初始污染菌實驗方法驗證報告報告編號： 報告時間： 目錄初始污染菌實驗方法驗證報告1、目的2、概述3、測試方法與試驗結(jié)果4、結(jié)論5、重新驗證條件1.目的：參照中國藥典2015版，通過實驗驗證檢測方法的適用性及計數(shù)用培養(yǎng)基的適用性，從而驗證現(xiàn)在使用初始污染菌實驗方法是否準(zhǔn)確合格。2.概述：產(chǎn)品型號為26型：批號為：201501013.測試方法及檢驗結(jié)果：3.1實驗設(shè)備及器材：該實驗使用儀器及器具主要有：滅菌移液管及移液槍吸嘴、無菌小泵管、培養(yǎng)皿、小型蠕動泵、薄膜過濾器、滅菌鍋、百級工作臺、生物安全柜、電子天平、電熱恒溫培養(yǎng)箱、霉菌培養(yǎng)箱。設(shè)備名稱是否校量是否在

11、有效期內(nèi)結(jié)論滅菌鍋已校量在有效期內(nèi)符合要求百級工作臺已校量在有效期內(nèi)符合要求生物安全柜已校量在有效期內(nèi)符合要求電子天平已校量在有效期內(nèi)符合要求電熱恒溫培養(yǎng)箱已校量在有效期內(nèi)符合要求霉菌培養(yǎng)箱已校量在有效期內(nèi)符合要求確認(rèn)人/日期： 審核/日期：3.2使用材料及菌種：胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基、胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基、沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基、沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基、胰酪大豆胨瓊脂培對照養(yǎng)基、沙氏葡萄糖瓊脂對照培養(yǎng)基、銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌、黑曲霉（菌種購買單位均為微生物種質(zhì)資源庫）。3.3菌液制備：接種金色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌的培養(yǎng)物至胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中或胰

12、酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基上，3035培養(yǎng)1824小時；接種白色念珠菌的培養(yǎng)物至沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基中或沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基上，2025培養(yǎng)2-3天，上述培養(yǎng)后的新鮮培養(yǎng)物用PH7.0無菌化鈉-蛋白胨緩沖液或0.9%無菌化鈉溶液制成每lml菌數(shù)小于100cfu(菌落形成）的菌懸液。接種黑曲霉的培養(yǎng)物至沙氏葡萄糖瓊脂面培養(yǎng)基上，2025培養(yǎng)57天，加人35 ml 0.05%(ml/ml) 聚山梨酯80的pH7.0無菌化鈉-蛋白胨緩沖液或0.9%無菌氯化鈉溶液，將孢子洗脫。然后，采用適宜的方法吸出孢子懸液至無菌試管內(nèi)，用0.05% (ml/ml)聚山梨醋80的pH7.0無菌化鈉-蛋白胨緩沖液或0.9%無菌

13、氯化鈉溶液制成每lml孢子數(shù)量小于100cfu的孢子懸液。菌懸液若在室溫下放置，應(yīng)在2小時內(nèi)使用；若保存在28 在24h 內(nèi)使用。黑曲霉孢子懸液存在28，在驗證過的貯存期內(nèi)用。3.4培養(yǎng)基適用性檢查3.4.1需氧菌的計數(shù)分別取1ml的金色葡萄球菌、銅綠假胞菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌、黑曲霉各菌懸液，接種至胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基管或胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基平板。金色葡萄球菌、銅綠假胞菌、枯草芽孢桿菌在30-35，培養(yǎng)不超過3天；白色念珠菌、黑曲霉在20-25，培養(yǎng)不超過5天。每一試驗菌株平行制備2 管或2 個平皿。同時，用相應(yīng)的對照培養(yǎng)基替代被檢培養(yǎng)基進(jìn)行上述試驗。3.4.2霉菌和酵母菌的計數(shù)分別取

14、1ml的白色念珠菌、黑曲霉各菌懸液，接種至沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基。在20-25，培養(yǎng)不超過5天。每一試驗菌株平行制備2 管或2 個平皿。同時，用相應(yīng)的對照培養(yǎng)基替代被檢培養(yǎng)基進(jìn)行上述試驗。3.4.3結(jié)果判定被檢固體培養(yǎng)基上的菌落平均數(shù)與對照培養(yǎng)基上的菌落平均數(shù)的比值應(yīng)在0.5-2 范圍內(nèi)，且菌落形態(tài)大小應(yīng)與對照培養(yǎng)基上的菌落一致；被檢液體培養(yǎng)基管與對照培養(yǎng)基管比較，試驗菌應(yīng)生長良好。3.4.4試驗結(jié)果見表1表1加入菌種培養(yǎng)條件培養(yǎng)基菌落數(shù)cfu結(jié)論胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基胰酪大豆胨瓊脂對照培養(yǎng)基胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基/胰酪大豆胨瓊脂對照培養(yǎng)基銅綠假單胞菌33,48小時菌落形態(tài)大小于對照培養(yǎng)基上的菌落一

15、致平均值金黃色葡萄球菌平均值枯草芽孢桿菌平均值白色念珠菌23,72小時平均值黑曲霉平均值加入菌種培養(yǎng)條件培養(yǎng)基菌落數(shù)cfu沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基/沙氏葡萄糖瓊脂對照培養(yǎng)基結(jié)論沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基沙氏葡萄糖瓊脂對照培養(yǎng)基白色念珠菌23,72小時菌落形態(tài)大小于對照培養(yǎng)基上的菌落一致平均值黑曲霉平均值結(jié)論：從以上檢測結(jié)果可知，上述批號的培養(yǎng)基適用性檢查符合要求，可用于日常產(chǎn)品檢測中的計數(shù)。 驗證人/日期： 審核/日期：3.5計數(shù)方法驗證3.5.1供試液的制備：洗脫液用0.9%的滅菌生理鹽水，檢品液制備在10000級環(huán)境中進(jìn)行。3.5.2 接種和稀釋按下列要求進(jìn)行供試液的接種和稀釋,制備微生物回收試驗用

16、供試液。所加菌液的體積應(yīng)不超過供試液體積的1%。為確認(rèn)供試品中的微生物能被充分檢出，首先應(yīng)選擇最低稀釋級的供試液進(jìn)行計數(shù)方法適用性試驗。（1）試驗組 取上述制備好的供試液，加入試驗菌液，混勻，使每1ml供試液或每張濾膜所濾過的供試液中含菌量不大于100cfu。（2）供試品對照組 取制備好的供試液, 以稀釋液代替菌液同試驗組操作。（3）菌液對照組 取不含中和劑及滅活劑的相應(yīng)稀釋液替代供試液,按試驗組操作加入試驗菌液并進(jìn)行微生物回收試驗。若因供試品抗菌活性或溶解性較差的原因?qū)е聼o法選擇最低稀釋級的供試液進(jìn)行方法適用性試驗時，應(yīng)采用適宜的方法對供試液進(jìn)行進(jìn)一步的處理。如果供試品對微生物生長的抑制作用

17、無法以其他方法消除，供試液可經(jīng)過中和、稀釋或薄膜過濾處理后再加入試驗菌懸液進(jìn)行方法適應(yīng)性試驗。3.5.3 抗菌活性的去除或滅活供試液接種后，按下列“微生物回收”規(guī)定的方法進(jìn)行微生物計數(shù)。若試驗組菌落數(shù)減去供試品對照組菌落數(shù)的值小于菌液對照組菌數(shù)值的50%，可采用下述方法消除供試品的抑菌活性。 增加稀釋液或培養(yǎng)基體積。 加入適宜的中和劑或滅活劑。3.5.4 微生物的回收按照6.2的計數(shù)培養(yǎng)基所用的試驗菌逐一進(jìn)行微生物回收試驗，回收試驗采用平皿法和薄膜過濾法。3.5.4.1 平皿法-傾注法取6個直徑90mm 的無菌平皿。2個分別注入照上述“試驗組”制備的供試液1ml；2個分別注入照上述“供試品對照

18、組”制備的供試液1ml；2個分別注入照上述“菌液對照組”制備的供試液1ml。每個平皿注入1520ml 溫度不超過45熔化的胰酪大豆胨瓊脂或沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基，混勻，凝固，倒置培養(yǎng)。3.5.4.2平皿法試驗結(jié)果見表2表2一次性包皮環(huán)切縫合器樣品1一次性包皮環(huán)切縫合器樣品1一次性包皮環(huán)切縫合器樣品1沖洗一次263025沖洗二次 042沖洗三次 000沖洗四次 000回收率 100%88.3%92.6%平均回收率93.7%修正系數(shù)1.07結(jié)論：以上產(chǎn)品各做三套平均回收率達(dá)80%以上，一次回收率達(dá)到要求。正常試驗中可采用沖洗一次后*回收系數(shù)進(jìn)行估算。試驗人/日期： 審核/日期3.5.4.3 薄膜過濾法薄膜過濾法所采用的濾膜孔徑應(yīng)不大于 0.45m,直徑一般為50mm,若采用其他直徑的濾膜,沖洗量應(yīng)進(jìn)行相應(yīng)的調(diào)整。選擇濾膜材質(zhì)時應(yīng)保證供試品及其溶劑不影響微生物的充分被截留。濾器及濾膜使用前應(yīng)采用適宜的方法滅菌。使用時,應(yīng)保證濾膜在過濾前后的完整性。供試液經(jīng)薄膜過濾后,若需要用沖洗液沖洗濾膜,每張濾膜每次沖洗量一般為100ml。總沖洗量不得超過1000ml,以避免濾膜上的微生物受損傷。取照上述 “試驗組”、“供試品對照組”和“菌液對照組”制備的供試液適量（一般取相當(dāng)于1g、1ml 或10cm2 的供試品, 若供試品中所含的菌數(shù)較多時，供試液可酌情減量），加至適量的