高效液相色譜_質譜聯用快速篩選并鑒定黃芩甲醇提取物中抗氧化活

1、DOI ：103724/SPJ1096201210699高效液相色譜-質譜聯用快速篩選并鑒定黃芩甲醇提取物中抗氧化活性成分楊思敏1陳瑞戰(zhàn)*1董航1李元1李世哲1李新龍1宋鳳瑞2劉志強21（長春師范學院化學學院，長春130032）2（中國科學院長春應用化學研究所，長春130022）摘要建立了高效液相色譜-質譜聯用技術快速篩選和鑒定黃芩甲醇提取物中抗氧化活性成分的方法。在黃芩甲醇提物中加入適量的二苯基三硝基苯肼（DPPH ·）作為實驗組，避光室溫反應30min 后直接經液相色譜分析，并與不加入DPPH ·的空白組進行比較。有抗氧化活性的成分因會與DPPH ·反應而使峰

2、面積減少，而不具有抗氧化活性的成分峰面積則不變?；谏V數據可以獲得有抗氧化活性組分的相對活性強度，基于質譜數據可獲得活性組分的結構信息用于結構鑒定。本方法成功地從黃芩甲醇提取物中篩選并鑒定出了黃芩苷、千層紙素A-7-O -D-葡萄糖醛酸苷、漢黃芩苷和千層紙素A4種較強的抗氧化活性成分。本方法利用HPLC-MS 技術對復雜體系（如中藥提取物）中小分子的分離和鑒定優(yōu)勢，可以直接篩選出黃芩甲醇提取物中的抗氧化活性成分，而不需要繁瑣的前期分離和純化，并且不需要儀器改裝工作，有利于實現復雜體系中抗氧化活性成分的高通量篩選。關鍵詞高效液相色譜-質譜聯用；篩選；二苯基三硝基苯肼；抗氧化活性；黃芩2011-

3、06-27收稿；2012-01-13接受本文系吉林省自然科學基金項目（No2010105），吉林省教育廳“十一五”科學技術研究項目（吉教科合字2010第373號）資助1引言自由基的存在非常廣泛，其氧化反應可以引起食物腐敗、細胞衰老和各種疾病，給人類的健康帶來危害。因此，抗氧化劑的檢測和篩選對于保障人類健康、提高食品安全具有深遠意義。抗氧化劑除人工合成外，還可以從中草藥中提取分離獲得，這不僅利用了中草藥這個天然的組合化學庫，而且降低了人工合成抗氧化劑帶來的毒副作用1。由于中草藥成分復雜，采用常規(guī)方法提取其中的抗氧化活性成分費時費力，并且在分離過程中可能導致微量活性組分丟失。因此，迫切需要發(fā)展一種

4、快速、高效的抗氧化活性成分的篩選方法。目前，已建立了基于高效液相色譜-質譜聯用的植物提取物中抗氧化活性成分的在線篩選方法2 8，成功篩選出了多種抗氧化活性成分，并對其結構進行了鑒定。這些方法需要改裝儀器和增加柱后反應通道，并需要額外的檢測器用于二苯基三硝基苯肼（DPPH ·）的檢測（517nm ），限制了該方法的廣泛應用。本研究采用高效液相色譜-質譜聯用（HPLC-MS ）技術，不需要任何改進工作，建立了一種更為簡單快捷的抗氧化活性成分的檢測、篩選和結構鑒定方法。DPPH ·是一種人工合成的穩(wěn)定的自由基，可以被抗氧化活性物質猝滅，是一種良好的體外抗氧化篩查劑，已經得到了廣泛

5、的應用9。黃芩是常用的中藥材之一，是唇形科植物黃芩的干燥根，具有清熱燥濕、瀉火解毒、止血安胎的功效。黃芩具有很好的抗氧化能力，并且主要的抗氧化活性成分是易溶于醇類的黃酮類化合物，并已經對這類化合物的總抗氧化能力及有效成分的提取、分離、結構鑒定進行了研究10 12。本研究利用黃芩建立了基于HPLC-MS 聯用的抗氧化活性成分的快速篩選方法。將黃芩甲醇提取物與DPPH ·混合反應后，直接用色譜分析。用等量的甲醇代替DPPH ·作為空白對照組，通過比較各組分的色譜峰面積的變化確定和評價各組分的抗氧化活性，從中篩選出4種有較強抗氧化活性的成分，并采用HPLC-MS 對4種成分進行了

6、鑒定，不僅證明了黃芩具有很好的抗氧化活性，而且表明本方法可以在中藥提取物這種復雜體系中實現簡單快捷的抗氧化活性的高通量篩選。第40卷2012年6月分析化學（FENXI HUAXUE ）研究報告Chinese Journal of Analytical Chemistry第6期888 8922實驗部分21儀器、試劑與材料2695HPLC-DAD 液相色譜儀（美國Waters 公司）；LTQ-XL 電噴霧質譜儀（美國Thermo 公司），配備電噴霧源，超純水處理系統(tǒng)（Milli-Q ，美國Millipore 公司）。甲醇（色譜純，美國Fisher 公司）；二苯基三硝基苯肼（DPPH ·，

7、分析純，Sigma 公司）；黃芩藥材購于長春市某藥店，經長春中醫(yī)藥大學王淑敏教授鑒定為唇形科植物黃芩（Scutellaria baicalensis ）的干燥根。22樣品制備在1g 黃芩中加入50mL 甲醇，超聲提取30min ，抽濾后將濾液用045! m 濾膜過濾待用。二苯基三硝基苯肼（DPPH ·）用甲醇稀釋到5mol /L，作為貯備液備用。在40! L 黃芩甲醇提物中加入10! L DPPH ·貯備液，混勻，在室溫下避光反應30min 后，直接進行HPLC-MS 分析?？瞻讓φ战M中DPPH ·由等體積的甲醇代替。23色譜-質譜條件高效液相色譜的流動相A 為0

8、5%醋酸溶液，流動相B 為甲醇。線性梯度洗脫：0 30min ，30% 80%B ，30 40min ，80%B 。TC-C 18色譜柱（150mm 46mm 5! m ，Agilent 公司），流速1mL /min；柱溫40#C ；進樣量10! L 。ESI 源為負離子模式，噴霧電壓為" 35kV ；金屬毛細管溫度260#C ；鞘氣（N 2）為09L /min；輔助氣（N 2）為15L /min，透鏡電壓為" 137V 。3結果與討論31實驗條件的優(yōu)化通過多次調節(jié)溶劑系統(tǒng)的洗脫梯度等參數，得到較好的流動相條件：當采用甲醇和05%醋酸溶液兩相溶劑，在30min 內，甲醇體積

9、分數由30%線性變?yōu)?0%，再等度洗脫10min 。流速圖1黃芩甲醇提取物與DPPH ·反應前后的高效液相色譜圖Fig1Chromatograms of methanol extract of Scutellariaeradix before and after reaction with diphenyl-1-picryl-hydrazly （DPPH ·）a黃芩甲醇取提物與DPPH ·反應前的高效液相色譜圖；b黃芩甲醇提取物與DPPH ·反應后的高效液相色譜圖。aChromatograms of the methanol extract of Scu

10、tellariae Radix before reaction with DPPH ·；bChromatograms of the methanol extract of Scutellariae Radix after reaction with DPPH ·為1mL /min時，黃芩甲醇提取物中的主要成分得到了較好的分離。調節(jié)DPPH ·自由基與黃芩甲醇提物的反應比例，確保DPPH ·在反應中是過量的，同時盡量將譜圖中過量的DPPH ·的吸收峰控制在與其它主要成分的吸收峰相當的高度范圍之內，以減少由于DP-PH ·自由基的峰太高而

11、導致黃芩甲醇提物中的主要成分的峰過低所帶來的誤差。在前期實驗條件優(yōu)化的階段，合適的質譜條件對于更好地質譜分析也是十分重要的。本實驗采用了23節(jié)所述的質譜條件。32篩選結果分析將實驗組和空白組用液相色譜分析，結果如圖1所示。實驗組的未反應的DPPH ·在38min 時被分離，說明DPPH ·過量。若實驗組中化合物與空白組進行比較峰面積有所減少，則說明該化合物能與DPPH ·反應，即具有抗氧化活性?；衔? 6的峰面積均減少，說明這幾種化合物都可以與DP-PH ·發(fā)生反應，都具有一定的抗氧化活性。有抗氧化活性的組分與DPPH ·反應后，峰面積減少的

12、程度取決于其與DPPH ·的結合強度，抗氧·，。（）988第6期楊思敏等：高效液相色譜-質譜聯用快速篩選并鑒定黃芩甲醇提取物中抗氧化活性成分RBA =100% （PA 0 PA1）/PA（1）式中，PA 0 和PA1分別為反應前后的峰面積。6種化合物與DPPH ·的相對結合強度見表1?；衔?，2，3和6與DPPH ·有一定的結合，因此，可以說明這4種化合物有一定的抗氧化活性。需要注意的是，峰4的相對結合強度小于1%，既說明峰4不能和DPPH ·反應，也說明在本方法中不存在假陽性結果。結合強度越大，抗氧化活性越強，這4種化合物的基于DPPH 自

13、由基篩選系統(tǒng)的抗氧化活性依次為化合物6化合物2化合物1化合物3。但是，基于不同的抗氧化活性篩選系統(tǒng)測得的抗氧化活性有所區(qū)別。為進一步確定這4種具有較強抗氧化活性成分，利用一級質譜和串聯質譜獲得其結構信息。表1黃芩甲醇提取物中6個化合物與DPPH ·自由基的相對結合強度Table 1Relative binding affinities of six compounds from methanol extract of Scutellariae Radix to DPPH ·峰Peak 峰1Peak 1峰2Peak 2峰3Peak 3峰4Peak 4峰5Peak 5峰6Pea

14、k 6相對結合強度Relative binding affinities（n =3）159%1 2%740%0 8%127%1 5%06%2 2%32%1 9%100%*由于實驗組中未檢測到峰6，可以近似認為該化合物完全反應。*Peak 6was thought to be reacted completely because it was not detected in the experiment group33抗氧化活性物質的鑒定用質譜直接檢測峰1，2，3和6的結構信息，所測得的4種化合物的一級質譜全掃描圖如圖2所示。對4種有抗氧化活性的化合物進行二級和三級質譜分析，所得的碎片離子的信息

15、列入表2。表24種具有抗氧化活性的化合物的結構鑒定Table 2Structure identification of four antioxidants峰Peak保留時間Retention time （min ）M H "ESI-MS nMS 2MS 3化合物Compounds1158445269241，225，197，169黃芩苷Baicalin2181459283，175268千層紙素A-7-O -D-葡萄糖醛酸苷Oroxylin A-7-O -glucuronide3191459283，175268漢黃芩苷Wogonoside6245283268239，240，184，163

16、千層紙素A Oroxylin A化合物1的全掃描一級質譜圖如圖2a 所示。負離子掃描的m /z445為M H " 峰；對m /z445離子進行二級質譜分析，分子離子失去1分子葡萄糖醛酸（" 176），得到m /z269碎片離子；對m /z269的碎片離子進行三級質譜分析，得到了m /z241，225，197，169碎片離子。通過查閱文獻12 17，該化合物的色譜出峰順序及質譜行為與黃芩苷一致，判斷該化合物可能是黃芩苷?；衔?的全掃描一級質譜圖如圖2b 所示。負離子掃描的m /z459，為M H -峰；對m /z459離子進行二級質譜分析，得到m /z283（失去1分子葡萄

17、糖醛酸" 176）和m /z175的碎片離子；對m /z283的碎片離子進行三級質譜分析，得到m /z268碎片離子。該化合物與黃芩的主要成分漢黃芩苷和千層紙素A-7-O -D-葡萄糖醛酸苷的質譜行為一致，可以推斷化合物2可能是兩種化合物中的一種。此外，這兩種同分異構化合物在C18柱中的出峰順序不同，根據文獻12 17中的保留時間和出峰順序，可以推測化合物2可能是千層紙素A-7-O -D-葡萄糖醛酸苷。化合物3的全掃描一級質譜圖如圖2c 所示。負離子掃描的m /z459為M H " 峰；對m /z459離子進行二級質譜分析，同樣得到m /z283，175的碎片離子；對m /

18、z283碎片離子進行三級質譜分析，得到m /z268碎片離子。該化合物與化合物2的質譜行為一致，分子量和質譜行為一致的情況下，推斷化合物3與化合物2是同分異構體?；衔?已經推斷出為千層紙素A-7-O -D-葡萄糖醛酸苷，則根據文獻中的相關信息可推斷化合物3為漢黃芩苷13 18?；衔?的全掃描一級質譜圖如圖2d 所示，負離子掃描的m /z283為M H 峰；對m /z283離子進行二級質譜分析，得到m /z268碎片離子；對m /z268碎片離子進行三級質譜分析，得到了m /z240，184，163和239的碎片離子。根據文獻12 17，在黃芩的主要成分中，具有該質譜行為的化合物可能A ，5

19、6，098分析化學第40卷 圖24種具有抗氧化活性的化合物的負離子模式下的全掃描一級質譜Fig2Full-scan mass spectrum of four antioxidants in negative ion modea黃芩苷的全掃描一級質譜圖；b千層紙素A-7-O -B-D-葡萄糖醛酸苷；c漢黃芩苷；d千層紙素A 。aFull-scan mass spectrum of baicalin ；bFull-scan mass spectrum of Oroxylin A-7-O-glucuronide ；cFull-scan mass spectrum of wogonoside ；dF

20、ull-scan mass spectrum of oroxylin A結果表明，本方法可高通量快速檢測、篩選中藥中具有抗氧化活性的多種組分，通過與DPPH ·自由基的結合強度推斷抗氧化活性的強弱，并借助高效液相色譜-質譜的定性分析鑒定手段對這些成分進行推斷和鑒定。References1Koleva I I ，Niederl nderH A ，van Beek T AAnalChem，2000，72（10）：2323 23282ChenJ H ，Zhao H Q ，Shi Q ，Zhang D L ，Cheng H Y ，Wang X R ，Lee F SJSepSci，2010，3

21、3（4-5）：672 6773SunC R ，Fu J D ，Chen J J ，Jiang L Y ，Pan Y JJSepSci，2010，33（8）：1018 10234TangD ，Li H J ，Chen J ，Guo C W ，Li PJSepSci，2008，31（20）：3519 35265LiuE H ，Qi L W ，Peng Y B ，Cheng X L ，Wu Q ，Li P ，Li C YBiomedChromatogr，2009，23（8）：828 8426WANG Xiao-Song ，CHEN Bo ，YAO Shou-ZhuoChinese Tradition

22、al and Herbal Drugs ，2009，40（Suppl）：224 227王小淞，陳波，姚守拙中草藥（增刊），2009，40：224 2277WANG Hong ，CHEN Jun-Hui ，ZHAO Heng-Qiang ，WANG Lei-Lei ，ZHANG Dao-Lai ，WANG Xiao-Ru ，YANG Dong-FangChinese JAnalChem，2009，37（6）：795 800王虹，陳軍輝，趙恒強，王磊磊，張道來，王小如，楊東方分析化學，2009，37（6）：795 8008DU Qin-Qin ，ZHANG Xu ，SONG Feng-Rui ，L

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27、Shenyang Pharm Univ，2003，20（3）：181肖麗和，王紅燕，宋少江沈陽藥科大學學報，2003，20（3）：181Rapid Screening and Structures Characterization of Antioxidants from Methanol Extract of Scutellariae Radix by High Performance Liquid Chromatography-Mass SpectrometryYANG Si-Min 1，CHEN Rui-Zhan *1，DONG Hang 1，LI Yuan 1，LI Shi-Zhe 1

28、，LI Xin-Long 1，SONG Feng-Rui 2，LIU Zhi-Qiang 21（College of Chemistry ，Changchun Normal University ，Changchun 130032，China ）2（Changchun Institute of Applied Chemistry ，Chinese Academy of Sciences ，Changchun 130022，China ）Abstract A new method based on HPLC-MS for the rapid screening and identificatio

29、n of antioxidants from methanol extract of Scutellariae Radix has been developedAn appropriate amount of diphenyl-1-picrylhydra-zyl （DPPH）was added to the methanol extract of Scutellariae Radix and incubated in dark place at room temperature for half an hour while DPPHwas replaced by methanol in the control groupThis two group sam-ples were analyzed by HPLC-MSComparing the chromatograms of experiment and control group ，the peak areas of antioxidants after the in