噬菌體展示技術(shù)在肝癌腫瘤血管異質(zhì)性研究中的應(yīng)用和優(yōu)化

1、噬菌體展示技術(shù)在肝癌腫瘤血管異質(zhì)性研究中的應(yīng)用和優(yōu)化         08-07-21 10:03:00     編輯：studa20         作者：徐泱 孫惠川 湯釗猷 樊嘉 周儉 欽倫秀 劉銀坤【摘要】  目的 克服體內(nèi)噬菌體展示技術(shù)在肝癌腫瘤血管異質(zhì)性研究中應(yīng)用的技術(shù)障礙。方法 采用噬菌體體內(nèi)分布及代謝實(shí)驗(yàn)研究噬菌體在裸鼠體內(nèi)的分布及代謝規(guī)律，比較噬菌體飽和灌注、聚肌苷(P

2、oly )及不同的活體灌洗技術(shù)對(duì)組織中噬菌體分布的影響。結(jié)果 肝臟等網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)器官可非特異性結(jié)合噬菌體。這種結(jié)合可被空白噬菌體飽和灌注所抑制(P<0.01)，而Poly 無(wú)顯著影響(P>0.05)。左、右心室加門(mén)靜脈灌洗較單純左心室灌洗可顯著減少組織血管中血液及未結(jié)合噬菌體的殘留(P<0.01)。結(jié)論 經(jīng)過(guò)改進(jìn)優(yōu)化的體內(nèi)噬菌體展示技術(shù)可為肝癌腫瘤血管異質(zhì)性研究提供穩(wěn)定、高效的技術(shù)平臺(tái)。 【關(guān)鍵詞】  噬菌體展示； 肝腫瘤； 腫瘤血管； 異質(zhì)性    【Abstract】  Objective  To circumv

3、ent the obstacle of in vivo phage display for study of vascular heterogeneity in hepatocellular carcinoma. Methods  The distribution and metabolic law of phage in the athymic mouse was detected by using in vivo phage display and metabolic experiment to compare the effects of f1tet phage presatu

4、ration, Poly preinjection and modified perfusion on distribution of phage in the tissues. Results  The nonspecific phage trapped by liver (belonged to the reticuloendothelial system, RES) was decreased significantly by presaturation of filamentous insertless phage (P<0.01), but not affected

5、by the preinjection of Poly (P>0.05).Left and right ventricle plus portal vein lavage could more significantly decrease blood volume in the vessels and residuals of untrapped phage (P<0.01). Conclusion  The modified in vivo phage display offers an ideal method for study of vascular hetero

6、geneity in hepatocellular carcinoma.    【Key words】  Phage display;  Liver tumors;  Tumor vasculature;  Heterogeneity    腫瘤血管“異質(zhì)性”是血管生成研究中的熱點(diǎn)。噬菌體文庫(kù)體內(nèi)展示技術(shù)在1996年一出現(xiàn)，就立刻成為血管異質(zhì)性研究的理想工具1-2?，F(xiàn)在，應(yīng)用噬菌體展示體內(nèi)篩選技術(shù)已得到針對(duì)不同組織或腫瘤血管的特異性靶向分子3-4。但肝、脾等屬于網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)的器官能夠非特異性地吞

7、噬或吸附噬菌體，而一直未有相關(guān)報(bào)道5。本研究的主要目的是探討克服肝臟對(duì)噬菌體文庫(kù)非特異性吞噬或吸附的方法，建立穩(wěn)定、高效的肝癌噬菌體文庫(kù)體內(nèi)展示技術(shù)平臺(tái)，為肝癌腫瘤血管異質(zhì)性研究提供強(qiáng)有力的工具。    1  材料與方法    1.1  材料7噬菌體隨機(jī)7肽庫(kù)及M13mp19空白對(duì)照噬菌體購(gòu)自美國(guó)NEB公司(Cat.No. E8100S；N4019S)，f1tet空白噬菌體由中科院上海生物化學(xué)研究所惠贈(zèng)。    1.2  方法    1.3

8、60; 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析    數(shù)據(jù)用SPSS 11.0處理，結(jié)果以±s表示。單因素方差分析比較各組內(nèi)參數(shù)差異，配對(duì)資料采用配對(duì)t檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。    2  結(jié)果    2.1  噬菌體體內(nèi)分布及代謝實(shí)驗(yàn)    肝臟可大量非特異性地結(jié)合血液循環(huán)中的噬菌體，其結(jié)合的噬菌體較其他器官(組織)高約101 000余倍，腫瘤亦有非特異性結(jié)合噬菌體的能力(圖1)。噬菌體主要經(jīng)肝腎代謝，噬菌體在血液中的代謝周期約為72 h(圖2)。在注

9、射噬菌體后4 min，從肝臟與腫瘤中復(fù)蘇的文庫(kù)噬菌體與M13噬菌體的數(shù)量比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，而在其他組織中差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01，圖3)。    2.2  不同活體灌洗技術(shù)的比較    改良灌洗組，肝、腫瘤、腎、肺組織中的M13空白噬菌體數(shù)較傳統(tǒng)灌洗組顯著降低(肝、腫瘤、腎臟：P<0.05；肺：P<0.01)，平均下降到10%左右(圖4)。活體灌洗并不影響噬菌體增殖活性。    2.3  Poly 抑制實(shí)驗(yàn)  

10、60; 注射M13噬菌體及文庫(kù)噬菌體的Poly 各劑量組與PBS對(duì)照組之間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。    2.4  噬菌體飽和灌注實(shí)驗(yàn)    肝臟及腫瘤中結(jié)合的噬菌體數(shù)量隨f1tet空白噬菌體注入量的增大而逐漸增加，但當(dāng)注入噬菌體1012 pfu后，肝臟及腫瘤中結(jié)合的噬菌體數(shù)量就穩(wěn)定保持在1011 pfu及106 pfu而不再增加；M13與f1tet噬菌體變化基本一致(圖5、6)。經(jīng)過(guò)量的f1tet空白噬菌體(1012 pfu)預(yù)飽和后，肝臟、腫瘤、腎臟、肺及腦組織與M13空白噬菌體的結(jié)合均顯著被抑制(肝

11、、腫瘤、腎、肺：P<0.01；腦：P<0.05)；肝臟、腫瘤、腎臟及肺組織結(jié)合文庫(kù)噬菌體較PBS對(duì)照組亦顯著減少(P<0.01)，肝臟所結(jié)合噬菌體與其他組織的差異明顯減少(圖7)。    3  討論    越來(lái)越多的證據(jù)表明，腫瘤血管生成在腫瘤生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)的各個(gè)環(huán)節(jié)均有重要作用7-8。腫瘤血管具有不同于正常血管的“異質(zhì)性”也已逐漸取得共識(shí)9。腫瘤血管研究方面的進(jìn)展，都離不開(kāi)研究技術(shù)手段的進(jìn)步。其中噬菌體文庫(kù)體內(nèi)展示技術(shù)在“血管異質(zhì)性”研究方面發(fā)揮了重要的作用。噬菌體展示技術(shù)由美國(guó)Smith10在1985年首先報(bào)道，其原理是將序列不同而長(zhǎng)度相同的合成寡核苷酸插入到噬菌體衣殼蛋白基因序列之中，外源多肽就可以表達(dá)在噬菌體衣殼蛋白的表面，由此就可能生成巨大的、可以展示數(shù)千萬(wàn)個(gè)肽的重組噬菌體文庫(kù)。1996年，Pasqualini又在噬菌體文庫(kù)體外展示技術(shù)的基礎(chǔ)上發(fā)展出噬菌體文庫(kù)體內(nèi)展示技術(shù)1，即把噬菌體文庫(kù)注入動(dòng)物體內(nèi)，