Cre_Loxp系統(tǒng)的應用及進展

1、作者簡介 :任榮榮 (1981.11-, 女 , 碩士。研究方向 :電壓門控性鈉離子通道 1亞基在神經病理性疼痛中的 作用。*通訊作者 :Tel :021 65790000, E mail :wangyingwei ·綜述 ·Cre/Loxp系統(tǒng)的應用及進展任榮榮 綜述 王英偉 審校(上海交通大學醫(yī)學院附屬新華醫(yī)院麻醉科, 上海 200092關鍵詞 Cre 重組酶; Loxp 位點; 轉基因技術; Cre/Loxp系統(tǒng)中圖分類號 Q812文獻標識碼:A 文章編號:1008 1836(2008 02 0078 03隨著分子生物學的迅猛發(fā)展, 轉基因技術發(fā)揮 著越來越重要的作用

2、, 已經滲透到人類生活的各個 領域。所謂轉基因技術就是將人工分離和修飾過的 基因導入到生物體基因組中, 由于導入基因的表達 從而引起生物體性狀可遺傳的修飾。轉基因技術推 動了從分子水平了解生命現(xiàn)象、 探討生命本質、 研究 疾病發(fā)生機理等方面的發(fā)展。國內外在動物轉基因 技術方面均已開展了卓有成效的工作。其中小鼠轉 基因研究方面成就最大、 發(fā)展最為迅速、 應用最為廣 泛的就是應用 Cre/Loxp系統(tǒng)對小鼠進行基因的敲 除、 激活、 倒轉和易位等。1Cre/Loxp系統(tǒng)的概述Cre/Loxp重組系統(tǒng)策略是進行基因組定點突變 的新途徑 1,2。該系統(tǒng)在 80年代被引入后, 已被成功 的應用于酵母菌、

3、 植物、 哺乳動物細胞培養(yǎng)及小鼠身 上。 Cre/Loxp重組系統(tǒng)包括 Cre 重組酶和 Loxp 位點 兩個部分, Cre 重組酶由大腸桿菌噬菌體 P1的 Cre 基 因編碼, 由 343個氨基酸組成, 它不僅具有催化活 性, 而且跟限制酶相似, 識別特異的 DNA 序列, 如: Loxp 位點, 引起重組。Loxp 位點是 Cre 重組酶作用的特異性重組位 點 , 由 34bp 組 成 , 即 :ATAACTTCGTATAGCATA CATTATACGAAGTTAT , 兩個 13bp 的反向重復順序 和 8bp 的間隔區(qū)域構成。 Cre 重組酶有 70%的重組 效率, 不借助任何輔助因子

4、, 作用于多種結構的 DNA 底物, 如線形、 環(huán)狀, 甚至超螺旋 (被 Cre 重組酶 解螺旋成為線形結構 1,3。 Cre 重組酶通過與 DNA 上 Loxp 位點的結合, 發(fā)揮其重組作用 1。 2Cre/Loxp系統(tǒng)的應用Cre/Loxp重組系統(tǒng)可在哺乳類細胞和轉基因鼠 中因 Loxp 位點設計的不同而產生特異性重組 4 6。 其應用主要包括基因失活或敲除、 基因激活、 基因顛 換、 基因易位, 還可以利用此系統(tǒng)進行載體的構建。 2.1內、 外源基因失活或敲除相對傳統(tǒng)的基因突變技術, Cre/Loxp系統(tǒng)借助 Cre 重組酶表達的特異性, 條件性敲除基因, 大大降 低了小鼠的死亡率。具體

5、分三部分:(1 在胚胎干細胞 (embryonic stem cell , ES cell 中通過置換型載體進行同源重組, 向基因組靶位點 引入選擇標記基因, 并在其兩側引入兩個同向排列 的 Loxp 位點。兩條同源染色體都帶有 Loxp 位點且 引入的 Loxp 位點不能干擾靶基因的轉錄。將該 ES 細胞打入假孕母鼠中, 發(fā)育成 “ floxed 小鼠” 。但要 保證 “ floxed 小鼠” 表型要跟野生型小鼠一致。 (2 利用原核注射的方法獲得轉基因 “ Cre 小 鼠” 。此轉基因小鼠在特定的啟動子下表達 Cre 重 組酶, 其 Cre 酶的重組效率可以用其他的工具鼠 (如 Rosa2

6、6 檢測。(3 “ Cre 小鼠” 跟 “ floxed 小鼠” 交配, Cre 重組酶會 切掉 Loxp 位點之間的靶基因和 1個 Loxp 位點, 從而達 到靶基因的失活或敲除 4 7。 2006年, Berton 等 8利用 上述方法把大鼠腦源性神經營養(yǎng)因子 (brain derived neurotrophic fac tor,BDNF 的局部表達降低, 產生類似 長期服用抗抑郁藥的抗抑郁效果, 從而證明了 BDNF 參與到神經環(huán)路和行為可塑性的過程中。2.2基因激活利用 Cre/Loxp系統(tǒng)不僅可對基因進行敲除, 還 可對基因進行特定激活, 了解基因的正向效應。在 兩個同向 Loxp

7、 位點之間加入終止信號, Loxp 位點后 加入靶基因, 與 Cre 小鼠交配后, Cre 重組酶切除終78第 2期 任榮榮, 等. Cre/Loxp系統(tǒng)的應用及進展止信號及 1個 Loxp 位點, 其 Loxp 位點后面的靶基因 便被 “激活” 表達。 Hnasko 等 9選用多巴胺缺陷的 小鼠, 在表達內源性酪氨酸羥化酶基因的前面加了1個 Loxp pgk neo Loxp , (pgk 為酪氨酸羥化酶的終 止信號, neo 為篩選標記 , 正常情況下, 小鼠表達 pgk , 后面的酪氨酸羥化酶不表達; 在小鼠尾狀核注 入 Cre 重組酶的情況下, Cre 重組酶切掉終止信號 pgk 和

8、1個 Loxp 位點, 酪氨酸羥化酶便表達, 尾狀核 部位生成多巴胺, 從而研究神經遞質多巴胺在這個 部位的功能。2.3基因插入采用同源重組技術, 在基因組上人工構建兩個 Loxp 位點, 借助構建的兩個 Loxp 位點, 把兩端帶有 Loxp 位點的外源基因重組到基因組上, 此種重組是 雙向的, 既可以把外源基因重組到小鼠基因組內, 也 可把小鼠基因組內源基因重組出來, 這是定點整合 的重要手段之一。2.4基因倒轉在同一染色體上構建兩個相反的 Loxp 位點, 在 Cre 重組酶的作用下, Loxp 位點之間的靶基因反方 向倒轉。2.5基因易位在不同染色體上分別構建 1個 Loxp 位點,

9、在 Cre 重組酶的作用下, Loxp 位點后面的基因發(fā)生重組, 不同染色體上大片段基因互相交換, 染色體易位。 Testa 等 10利用此原理進行了如下操作:首先, 利用 同源重組的方法在 13號染色體 DEK 基因的內含子 加入 Loxp 位點及篩選標記 hygro (潮霉素 ; 其次, 利 用同樣的方法在二號染色體 CAN 基因的內含子加 入篩選標記 neo (新霉素 及 Loxp 位點; 最后, 在 Cre 重組酶的作用下, DEK 基因片段與 CAN 基因片段交 換, 產生 DEK CAN 融合基因, 實現(xiàn)基因易位。 3Cre/loxp系統(tǒng)的新進展80年代 Cre/Loxp系統(tǒng)的時間

10、與空間的控制依賴 于 Cre 的啟動子, 現(xiàn)在發(fā)展為依賴于受體與配體的 結合來實現(xiàn)其時間、 空間的控制。目前, 可從兩個水平進行調控, 即:轉錄水平和 翻譯后水平。轉錄水平的調控以四環(huán)素 (抑制 控制 系統(tǒng)為例 11:在沒有四環(huán)素的情況下, 轉錄激活蛋 白與轉錄激活蛋白基因相結合, 激活后面 Cre 重組 酶的表達; 在四環(huán)素存在的情況下, 四環(huán)素與轉錄激 活蛋白相結合, 使其不能結合轉錄激活蛋白基因, 從而達到了抑制的目的。翻譯后水平以雌激素系統(tǒng)為 例:2007年, Bradley 等 12在 scl 基因的啟動子或加 強子 0.9E3后面加上 1個 Cre er (er 表達雌激素他莫 西

11、酚的受體 的基因, Cre 基因就可以按照 scl 基因的 表達方式表達, 從而得到 “ Cre er 工具小鼠” 。在正 常情況下 “ Cre er 工具小鼠” 不表達 Cre 重組酶, 使用 雌激素他莫昔酚 (tamoxifen 誘導才能表達 Cre 重組 酶。這只 scl Cre er 小鼠可以與其他的 “ Loxp 小鼠” 進行交配, 交配的后代可以在特定時間注入雌激素tamoxifen , 與雌激素受體結合后, 表達 Cre 酶, 就可以 對后代小鼠的 Loxp 位點進行重組。為了避免體內 雌激素的干擾, 可對雌激素受體基因的配體結合區(qū) 做一定程度的改變, 使其只能和某些雌激素衍生物

12、 相結合, 確保條件重組的特異性?，F(xiàn)在不僅用 Cre/Loxp系統(tǒng)進行基因的失活或敲 除、 基因激活、 基因顛換、 基因易位, 還可以用其構建 高效表達的載體。 2007年, 王文棋等 13利用此系統(tǒng) 構 建 了 1個 高 效 表 達 綠 色 熒 光 蛋 白(Green fluorescent protein , GFP 的載體。在 Cre 酶的作用 下, 把 gfp 基因先從基因供體 pTLG 上切下來, 然后通 過重組把 gfp 整合到基因受體 pET Loxp 受體上, 完 成 gfp 基因高效表達載體 pET gfp 的構建, 從而使繁 瑣的傳統(tǒng)載體構建變?yōu)楹唵蔚拿复俜磻? 極大地簡

13、化了載體構建步驟, 免去為構建載體選擇酶切位點 的繁瑣, 為 Cre 酶在基因克隆和亞克隆中的應用提 供了很好的研究基礎。利用 Cre/Loxp系統(tǒng)進行遺傳操作具有顯著的優(yōu) 勢, 許多學者對此已進行了大量的研究工作, 此系統(tǒng) 被廣泛應用于小鼠的轉基因研究中。 Cre/Loxp系統(tǒng) 短小精悍、 Cre 酶作用專一, 且不影響基因的正常表 達與調控, 該系統(tǒng)的應用為轉基因技術開辟出一條 嶄新的道路。參考文獻1Trinh KR , Morrison SL. Site specific and directional gene replacement mediated by Cre recombina

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