內(nèi)生放線(xiàn)菌和寄主植物的抑菌活性及其關(guān)系

1、內(nèi)生放線(xiàn)菌和寄主植物的抑菌活性及其關(guān)系 作者：鐘莉田新莉周敏王韜成秋香陳振華范云覃重軍 【摘要】從68種中草藥植物中分離了 560株內(nèi)生放線(xiàn)菌菌株，其中84株(約 占15%)對(duì)金葡菌有抑菌活性，36株(約6%)對(duì)白念珠菌有抑菌活性，提示中草 藥植物的內(nèi)生放線(xiàn)菌可能是抗菌新藥的一個(gè)來(lái)源。檢測(cè)了 9種中草藥植物的水 或乙醇抽提液對(duì)金葡菌的抑菌活性，發(fā)現(xiàn)內(nèi)生放線(xiàn)菌菌株的抑菌活性與其寄主 植物沒(méi)有明顯的對(duì)應(yīng)關(guān)系。 【關(guān)鍵詞】中草藥植物；內(nèi)生放線(xiàn)菌；抑菌活性 ABSTRACT This paper reports that total 84 or 36 out of the tested 560 end

2、ophytic actinomycetes strains from 68 Chinese medicinal herbs, showed inhibition activity against Staphylococcus aureus or Candida albicans, respectively, suggesting a potential source for novel antibiotics. Further investigation by using water or ethanol extracts of the nine herbs against Staphyloc

3、occus aureus, indicated no apparent relationships on inhibition of the pathogen between herbs and their endophytic actinomycetes. KEY WORDS Chinese medicinal herbs; Endophytic actinomycetes; Inhibition activity 目前發(fā)現(xiàn)的放線(xiàn)菌(主要來(lái)自土壤)產(chǎn)生的抗生素和生理活性物質(zhì)超過(guò) 10000種，占己發(fā)現(xiàn)微生物藥物的約2/3 1。近年來(lái)從獨(dú)特生境中分離放線(xiàn) 菌并尋找新的抗生素已逐漸受到重視，如從

4、植物組織內(nèi)部中分離其內(nèi)生放線(xiàn)菌 和尋找新抗生素2。我國(guó)擁有豐富的中草藥植物資源，其中一些中草藥長(zhǎng)期 被用來(lái)清熱解毒、化膿消腫，提示可能存在抗菌活性物質(zhì)。本文報(bào)道從68種中 草藥植物中分離大量的內(nèi)生放線(xiàn)菌，其中約15%菌株具有抗金葡菌的活性，約6% 菌株對(duì)白念珠菌有抑菌活性。此外，初步探討了內(nèi)生放線(xiàn)菌與其寄主植物在抗 菌活性方面可能的對(duì)應(yīng)關(guān)系。 1材料與方法 1.1中草藥植物和病原菌來(lái)源 本試驗(yàn)所用大部分中草藥植物采自上海植物園，丹參和燈盞花采自云南昆 明(邱明華研究員提供)，青蒿采自四川酉陽(yáng)(利民青蒿基地提供)，金葡菌由揚(yáng) 州大學(xué)微生物實(shí)驗(yàn)室金文杰老師提供。 試驗(yàn)中分離內(nèi)生放線(xiàn)菌所用的為S培養(yǎng)

5、基2、S培養(yǎng)基+重鉻酸鉀+萘啶 酮酸、S培養(yǎng)基+重鉻酸鉀+萘啶酮酸+鏈霉素、S培養(yǎng)基+重鉻酸鉀+萘啶酮酸+萬(wàn) 古霉素等4種培養(yǎng)基(重鉻酸鉀的終濃度為85J mol/L,萘啶酮酸65p mol/L, 鏈霉素2p g/ml,萬(wàn)古霉素4p g/ml),純化和進(jìn)一步培養(yǎng)內(nèi)生放線(xiàn)菌采用高氏 一號(hào)培養(yǎng)基3。培養(yǎng)金葡菌用LB培養(yǎng)基D 1.3植物內(nèi)生放線(xiàn)菌的分離 將采摘的新鮮植物用清水洗凈，根、莖、葉各部分分開(kāi)，于陰涼處風(fēng)干。 用70%的乙醇、0.87%的次氯酸鈉和10%的碳酸氫鈉分別處理5、20和lOmin以 達(dá)到表面消毒，接著 用無(wú)菌水洗滌三次，再用無(wú)菌濾紙吸干水分。將植物剪成 約1cm的小段，置于上述4

6、種分離培養(yǎng)基表面，于30*0培養(yǎng)。樣品表面消毒方 法參照文獻(xiàn)4, 5,分離內(nèi)生放線(xiàn)菌的方法參照文獻(xiàn)4，根據(jù)形態(tài)和培養(yǎng) 特征初步鑒定放線(xiàn)菌菌株參照文獻(xiàn)3，部分放線(xiàn)菌菌株的鑒定采用16S rDNA序列測(cè)定和比對(duì)。 1.4內(nèi)生放線(xiàn)菌的抑菌試驗(yàn) 金葡菌或白念珠菌接種于25ml LB液體，37°C培養(yǎng)過(guò)夜，取10ml菌液與 250ml LB混合，澆制成平板。植物內(nèi)生放線(xiàn)菌菌株接種于高氏一號(hào)培養(yǎng)基，于 3(TC生長(zhǎng)7d,用打孔器在平板上打孔，接種針挑出放線(xiàn)菌瓊脂菌塊，放置在混 合有指示菌的平板上，30°C培養(yǎng)2?3d后觀察和測(cè)量可能的抑菌圈。 1.5植物的水或乙醇的提取及提取液的抑菌試

7、驗(yàn) 將采摘的新鮮植物用清水洗凈和風(fēng)干，一份稱(chēng)取0.8g,用研磨碾碎后加入 3.2ml 70%乙醇，隔一段時(shí)間振蕩一次進(jìn)行萃取；另一份稱(chēng)取0. lg,進(jìn)行表面 消毒(方法同上)，然后剪碎并轉(zhuǎn)移至Eppendorf管，用研磨碾碎后加入0.4ml 無(wú)菌水浸泡。將滅菌的圓形濾紙片(4mm)置于混合有指示菌的平板上，加入 5p 1水或醇提取液于濾紙片上，30°C培養(yǎng)2?3d后進(jìn)行抑菌圈測(cè)定D 2結(jié)果 2. 1中草藥植物的內(nèi)生放線(xiàn)菌對(duì)金葡菌和白念珠菌的抑菌活性 從上海市植物園、云南昆明和四川酉陽(yáng)等地釆集到68種中草藥植物，表面 消毒后在4種固體培養(yǎng)基上共分離，并初步鑒定了 560株內(nèi)生放線(xiàn)菌。這

8、些放 線(xiàn)菌菌株在高氏一號(hào)培養(yǎng)基上經(jīng)劃線(xiàn)純化培養(yǎng)后打下圓形菌塊，置于混合有金 葡菌或白念珠菌的平板上以檢測(cè)可能的抑菌活性。表1結(jié)果顯示，來(lái)自35種中 草藥植物的84株內(nèi)生放線(xiàn)菌對(duì)金葡菌具有抑菌活性(抑菌圈直徑在4.5?19mra, 詳細(xì)數(shù)據(jù)未列出），占測(cè)試菌株總數(shù)的約15%。來(lái)自33種中草藥植物(包括白毛 夏枯草、腹水草、萱草、大蔥、小蔥、大蒜、艾蒿、燈盞花、三七、青蒿、移 星草、薄荷、三白草、富貴草、九頭獅子草、絞股藍(lán)、東風(fēng)菜、玄參、白英、 茜草、馬兜鈴、博落回、厚果雞血藤、杜仲、山楂、側(cè)柏、苦參、桑樹(shù)、雪松、 川楝、三尖杉、日本常山云和南旌節(jié)花)的167株內(nèi)生放線(xiàn)菌未檢測(cè)到明顯的抑 制金葡菌

9、的活性。 除去分離到較少(如<5株)內(nèi)生放線(xiàn)菌菌株的植物外，分離菌株較多的植物 如紫金牛、野蕎麥、毛茛和紫菀等的內(nèi)生放線(xiàn)菌菌株具有抑菌活性的比例較高， 分別為56%、50%、50%和41%，提示具有抑制金葡菌活性的植物內(nèi)生放線(xiàn)菌的分 布可能有偏好性。 表1結(jié)果顯示，來(lái)自22種中草藥植物中的36株放線(xiàn)菌對(duì)于白念珠菌具有 抑菌活性(約占測(cè)試菌株總數(shù)的6%)，其中來(lái)自貫眾、磨芋、敗醬和陸 英等的內(nèi) 生放線(xiàn)菌菌株具有抑菌活性的比例較高，分別為21%、表1 43種中草藥植物 中對(duì)金葡菌和白念珠菌有抑菌活性的內(nèi)生放線(xiàn)菌株數(shù)20%、17%和29%。 2.2中草藥植物的抽提液對(duì)金葡菌的抑菌活性 為了進(jìn)一

10、步研究?jī)?nèi)生放線(xiàn)菌菌株與其寄主中草藥植物在有或無(wú)抑菌活性方 面是否有對(duì)應(yīng)關(guān)系，我們測(cè)定了一些植物提取液的抑菌活性。選取內(nèi)生放線(xiàn)菌 菌株具有較高抑菌比例的紫金牛、野蕎麥、毛莨、紫菀和貫眾等5種植物，以 及具有較低抑菌比例的陸英、打破碗花花、括樓和澤蘭等4種植物，用水或70% 乙醇抽提，檢測(cè)對(duì)金葡菌的抑菌活性。表2結(jié)果表明，雖然紫金牛、毛茛、紫 菀和貫眾等4種植物的水或醇提取物具有抑菌活性，但野蕎麥的水或醇提取液 中沒(méi)有檢測(cè)到抑菌活性：另一方面，雖然括樓的提取液中沒(méi)有抑菌活性，但是 陸英、打破碗花花和澤蘭的提取液中卻具有抑菌活性。這些結(jié)果顯示，內(nèi)生放 線(xiàn)菌菌株對(duì)金葡菌的抑菌活性與其寄主植物沒(méi)有明顯的

11、對(duì)應(yīng)關(guān)系。 3討論 由于植物內(nèi)生菌來(lái)自獨(dú)特的生存環(huán)境而成為人們尋找微生物新藥的一個(gè)重 要藥源。在植物內(nèi)生放線(xiàn)菌產(chǎn)生抗生素方面，有報(bào)道從杜鵑花6、蛇藤7 和衛(wèi)矛科植物8分離到的內(nèi)生放線(xiàn)菌產(chǎn)生了新的抗細(xì)菌或真菌的化合物。國(guó) 內(nèi)文獻(xiàn)報(bào)道了水稻內(nèi)生放線(xiàn)菌產(chǎn)生抗真菌的活性9，三葉草中的內(nèi)生放線(xiàn)菌 有抗細(xì)菌活性10,西雙版納藥用植物中分離的165株內(nèi)生放線(xiàn)菌中有70株 表現(xiàn)抗多種細(xì)菌和真菌活性11。在我們的試驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)68種中草藥植物的 560株內(nèi)生放線(xiàn)菌中表2 9種新鮮中草藥植物的抽提液對(duì)金葡菌的抑菌活性有 84株(約15%)對(duì)金葡菌具有抑制活性，有36株放線(xiàn)菌(約6%)對(duì)白念珠菌具有 抑菌活性，進(jìn)一步

12、表明中草藥植物內(nèi)生放線(xiàn)菌可能是篩選抗菌新藥的一個(gè)重要 資源。 1993年Stierle等12從短葉紅豆杉中發(fā)現(xiàn)一種可以產(chǎn)紫杉醇的內(nèi)生真 菌，此后還有許多類(lèi)似的報(bào)道，導(dǎo)致了一種觀點(diǎn)：由于植物內(nèi)生菌與寄主植物 的協(xié)同進(jìn)化，內(nèi)生菌可以產(chǎn)生與寄主植物相同的物質(zhì)。我們的試驗(yàn)結(jié)果表明， 至少對(duì)抑制金葡菌的活性而言，內(nèi)生放線(xiàn)菌菌株的抑菌活性與其寄主植物的沒(méi) 有明顯的對(duì)應(yīng)關(guān)系。一種可能的原因是放線(xiàn)菌屬于原核生物，寄主植物為真核 生物，兩者之間遺傳物質(zhì)的交換特別是基因表達(dá)存在很大障礙；而同屬于真核 生物的內(nèi)生真菌與寄主植物的遺傳物質(zhì)交流和表達(dá)的障礙較小。 致謝：上海植物園草藥園，中科院云南植物研究所邱明華研究員

13、，四川酉 陽(yáng)利民青蒿基地，揚(yáng)州大學(xué)微生物實(shí)驗(yàn)室金文杰老師。 【參考文獻(xiàn)】 1 Berdy J. Bioactive microbial metabolites, a personal view J . J Antibiot,2005,58(l):l?26. 2 曹理想，周世寧.植物內(nèi)生放線(xiàn)菌研究J.微生物學(xué)通報(bào)，2004, 31 :93 ?96. 3 阮繼生，劉志恒，梁麗糯，等.放線(xiàn)菌研究及應(yīng)用M.北京：科學(xué)出 版社，1990： 2?18. 4 曹理想，田新莉，周世寧.香蕉內(nèi)生真菌、放線(xiàn)菌類(lèi)群分析J.中山 大學(xué)學(xué)報(bào)，2003, 42(2): 70?73. 5 宋子紅，丁立孝，馬伯軍，等.花生內(nèi)

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