轉(zhuǎn)基因魚(yú)的研究進(jìn)展

1、第 14卷第 2期 大 連 水 產(chǎn) 學(xué) 院 學(xué) 報(bào) Vol. 14No. 2 1999年 6月 JOURNAL OF DALIAN FISHERIES UNIVERSIT Y Jun . 1999 綜述文章編號(hào) :1000-9957(1999 02-0054-08轉(zhuǎn)基因魚(yú)的研究進(jìn)展譚海東 1, 張 波 1, 朱春陽(yáng) 1, 郝景泉 2(1. 遼寧省農(nóng)業(yè)科學(xué)院大連生物技術(shù)研究所 , 大連 116023; 2. 遼寧省鐵嶺市農(nóng)業(yè)局 , 鐵嶺 112000摘要 :轉(zhuǎn)基因魚(yú)的外源基因構(gòu)建需要有啟 動(dòng)子、目的 基因和 終止子 等 , 常用外 源基因 的 導(dǎo)入 方法有顯微注射、電穿孔等 , 并 介紹了 外源

2、基 因表達(dá) 模式及 常用的 標(biāo)記 基因。轉(zhuǎn) 基因魚(yú)的研究比較落后 , 當(dāng)務(wù)之急是從分子水平上分析魚(yú)類(lèi)的生理現(xiàn)象及表達(dá)基因的結(jié)構(gòu)。關(guān)鍵詞 :轉(zhuǎn)基因魚(yú) ; 啟動(dòng)子 ; 顯微注射 ; 電穿孔中圖分類(lèi)號(hào) :Q953 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 :A近幾十年來(lái) , 隨著分子遺傳學(xué)的迅速發(fā)展 , 許多生物轉(zhuǎn)基因成為現(xiàn)實(shí)。從 1980年 以后 , 轉(zhuǎn)基因研究已用于各種動(dòng)物。尤其在 1982年 , Palm iter 1報(bào)道了給小鼠受精卵的 雄性原核導(dǎo)入大鼠的生長(zhǎng)激素基因 , 獲得了快速生長(zhǎng)的 超級(jí)小鼠 , 比平常的小鼠大 一倍 , 引起了人們的極大興趣。在魚(yú)種改良上 , 轉(zhuǎn)基因技術(shù)已用于各方面的研究。在基礎(chǔ)領(lǐng)域內(nèi) , 被應(yīng)

3、用于遺傳基 因的整合、反式作用因子的機(jī)能分析及導(dǎo)入外源基因產(chǎn)生的蛋白質(zhì)引起的生理機(jī)能分析 等 2。如反式作用因子的組織特異性和時(shí)期特異性 , 用培養(yǎng)細(xì)胞的方法進(jìn)行分析比較 困難 , 但用轉(zhuǎn)基因方法分析就容易。像澳大利亞斑馬魚(yú)可靠調(diào)節(jié)環(huán)境因素 , 在全年內(nèi)都 可以得到受精卵。用魚(yú)卵來(lái)進(jìn)行外源基因的導(dǎo)入實(shí)驗(yàn) , 比較適合分析初期發(fā)生的外源基 因表達(dá)。另外 , 轉(zhuǎn)基因技術(shù)也被應(yīng)用于魚(yú)類(lèi)育種上 3。以往為了向魚(yú)類(lèi)導(dǎo)入和固定有用的 外源基因 , 一直采用雜交技術(shù) , 但這種技術(shù)用來(lái)固定目的基因需要的時(shí)間長(zhǎng) , 而且時(shí)常 發(fā)生有害基因的積累 , 給表現(xiàn)型帶來(lái)不良影響 ; 還有雜交親本具有不親和性 , 其遺

4、傳特 征難以預(yù)測(cè)。與此相比 , 在目的基因的蛋白質(zhì)被確定的情況下 , 如果把目的基因單個(gè)分 離 , 改變后轉(zhuǎn)入個(gè)體中去 , 就可能使其遺傳特征在短期內(nèi)轉(zhuǎn)給個(gè)體或表達(dá)增強(qiáng)。為了進(jìn) 一步使外源基因傳給下一代 , 通過(guò)把這些個(gè)體有計(jì)劃的進(jìn)行交配的方法 , 可在短期內(nèi)確 定具有目的基因的體系。如上所述 , 導(dǎo)入外源基因不管是在基礎(chǔ)研究上還是在水產(chǎn)育種上 , 都有許多優(yōu)點(diǎn)。 為此 , 作者就轉(zhuǎn)基因魚(yú)類(lèi)外源基因的構(gòu)建、導(dǎo)入及表達(dá)進(jìn)行介紹。收稿日期 :1998 01 27作者簡(jiǎn)介 :譚海東 (1971 , 男 , 助理研究員。1 外源基因的構(gòu)建外源基因的構(gòu)建至少需要三個(gè)部分 :啟動(dòng)子、目的基因和終止子。啟動(dòng)

5、子是 DNA 分子上結(jié)合 RNA 聚合酶并形成轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物的區(qū)域 , 它和增強(qiáng)子 (增強(qiáng)轉(zhuǎn)錄活性的 結(jié)構(gòu) 一起構(gòu)成基因轉(zhuǎn)錄的順勢(shì)結(jié)構(gòu)。終止子是使轉(zhuǎn)錄終止的序列 , 它構(gòu)成基因轉(zhuǎn)錄的 主要反式因子 , 保證翻譯到適當(dāng)位置停止 , 以免出現(xiàn)過(guò)長(zhǎng)的蛋白質(zhì)。順勢(shì)作用因子和反 式作用因子協(xié)同調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄的精確性、靈活性 , 特別是在細(xì)胞生長(zhǎng)、發(fā)育、分化過(guò)程 中起重要的調(diào)控作用。目前還沒(méi)有對(duì)魚(yú)類(lèi)基因順?lè)匆蜃舆M(jìn)行詳細(xì)分析的例子 , 僅限于對(duì) 鯉魚(yú)的 -肌動(dòng)蛋白 4、鮭魚(yú)的金屬硫蛋白 5、美洲大綿 魚(yú) 尉 及寒帶比目魚(yú)的抗凍蛋白 6等少數(shù)基因的研究。因此 , 至今轉(zhuǎn)基因魚(yú)所采用的啟動(dòng)子和增強(qiáng)子中很多是來(lái)自高

6、等動(dòng) 物或以高等動(dòng)物為宿主的病毒的啟動(dòng)子和增強(qiáng)子。生長(zhǎng)激素基因和抗凍蛋白基因是當(dāng)前 目的基因研究的熱點(diǎn)。終止子的研究至今未見(jiàn)報(bào)道。1 1 啟動(dòng)子和增強(qiáng)子1 1 1 來(lái)自病毒基因的啟動(dòng)子和增強(qiáng)子在基因?qū)媵~(yú)類(lèi)中 , 采用最廣泛的還是來(lái)自高等動(dòng)物病毒的啟動(dòng)子和增強(qiáng)子 , 以魚(yú) 類(lèi)細(xì)胞為宿主的病毒啟動(dòng)子和增強(qiáng)子的分析工作幾乎沒(méi)有進(jìn)行 , 因此挪用高等動(dòng)物細(xì)胞 內(nèi)病毒的啟動(dòng)子和增強(qiáng)子。如 SV 40(猴病毒 40 是感染猿猴的一種病毒 , 這種病毒的 啟動(dòng)子和增強(qiáng)子在哺乳動(dòng)物中的應(yīng)用非常廣泛 7, 已在鯉魚(yú)的上皮細(xì)胞 8、鮭魚(yú)的肝 細(xì)胞 9中發(fā)現(xiàn)活性?，F(xiàn)正向各種魚(yú)類(lèi)導(dǎo)入 , 但僅能確認(rèn)有低水平的表達(dá)。

7、 RSV 是感染 雞的一種勞氏肉瘤病毒 , 在高等動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)其啟動(dòng)子和增強(qiáng)子活性很高 , 特別是 LT R (長(zhǎng)末端重復(fù)序列 表達(dá)非常強(qiáng)的活性 10, 是在魚(yú)類(lèi) (如金魚(yú)、斑馬魚(yú)、鮭魚(yú)等 中使 用最廣泛的啟動(dòng)子和增強(qiáng)子。腺病毒是感染新生兒的一種皰疹病毒 , 在斑馬魚(yú)細(xì)胞內(nèi)這 種病毒的啟動(dòng)子和增強(qiáng)子有活性 , 在初期胚培養(yǎng)中推算出其活性是 RSVLTR (勞氏肉 瘤病毒長(zhǎng)末端重復(fù)序列 近 2倍。 SV 40的啟動(dòng)子和增強(qiáng)子與一種病毒的 LTR 組合的啟 動(dòng)子和增強(qiáng)子在鮭魚(yú)的初期胚中也顯示出 RSVLTR 的 2倍活性 11。1 1 2 來(lái)自魚(yú)類(lèi)基因的啟動(dòng)子和增強(qiáng)子就期望目的基因有較高水平的表達(dá)或

8、表達(dá)組織特異性、時(shí)期特異性來(lái)說(shuō) , 一般用來(lái) 源于宿主細(xì)胞的啟動(dòng)子和增強(qiáng)子是最合適 , 即對(duì)于轉(zhuǎn)基因魚(yú)來(lái)源于魚(yú)類(lèi)的啟動(dòng)子和增強(qiáng) 子是最合適的?？箖龅鞍资悄蠘O海冰點(diǎn)下棲息魚(yú)類(lèi)具有的蛋白質(zhì) , 可防止冰點(diǎn)下體液凍 結(jié) 12?？箖龅鞍资窃诟闻K中產(chǎn)生的 , 在其它魚(yú)類(lèi) (即原先不含抗凍蛋白的魚(yú)類(lèi) 上也 被斷定有活性。來(lái)源于美洲大綿 魚(yú) 尉 、寒帶比目魚(yú)的抗凍蛋白的啟動(dòng)子和增強(qiáng)子的活性 也是通過(guò)導(dǎo)入其它魚(yú)中被發(fā)現(xiàn)的。將寒帶比目魚(yú)的抗凍蛋白基因的啟動(dòng)子和增強(qiáng)子導(dǎo)入 大西洋鮭中 , 抗凍蛋白在大西洋鮭的肝臟中有很強(qiáng)的表達(dá) , 但這種抗凍蛋白的啟動(dòng)子和 增強(qiáng)子在斑馬魚(yú)初期胚的研究中其活性不如 RSV 的 LT

9、R 及后文要提到的肽鏈延伸因 子 3, 這和抗凍蛋白在肝臟組織特異性表達(dá)有關(guān)。金屬硫蛋白是在肝臟中產(chǎn)生的能結(jié)合金屬的蛋白質(zhì) , 對(duì)重金屬有解毒作用。由于這 , 55第 2期 譚海東等 :轉(zhuǎn)基因魚(yú)的研究進(jìn)展表達(dá)。在鮭魚(yú)中分離出 2種金屬硫蛋白基因 , 對(duì)其啟動(dòng)子和增強(qiáng)子的分析正在進(jìn)行 5, 另外投入鋅可以誘導(dǎo)外源基因在魚(yú)胚中的表達(dá) 13。以上的抗凍蛋白和金屬硫蛋白基因是在特定組織的特定條件下表達(dá)非常強(qiáng)的基因。 另外有些基因能在所有的組織中表達(dá) , 這些基因被稱(chēng)為管家基因。如果把管家基因的啟 動(dòng)子和增強(qiáng)子與特定的基因結(jié)合導(dǎo)入魚(yú)中 , 就能在所有的組織中表達(dá)。為達(dá)此目的 , 在 魚(yú)類(lèi)上采用了來(lái)源于肽

10、鏈延伸因子基因的啟動(dòng)子和增強(qiáng)子。 -肌動(dòng)蛋白是構(gòu)成細(xì)胞骨 架的蛋白質(zhì) , 來(lái)自鯉魚(yú)的 -肌動(dòng)蛋白基因的啟動(dòng)子和增強(qiáng)子已被詳細(xì)分析 4。EF1 是一種合成蛋白質(zhì)必需的肽鏈延伸因子 , 在真核細(xì)胞有較高的活性 14。大西 洋鮭的 EF1 在斑馬魚(yú)中顯示較高的活性 , 其活性在下一代仍能被確定 15。1 1 3 來(lái)自高等動(dòng)物的啟動(dòng)子和增強(qiáng)子前述的金屬硫蛋白基因的啟動(dòng)子和增強(qiáng)子首先是在小鼠中發(fā)現(xiàn)的 , 后來(lái)用于金魚(yú)、 泥鰍、鮭魚(yú)、鲇魚(yú)及大西洋鮭中 2, 但明確發(fā)現(xiàn)外源基因的例子很少。在鮭魚(yú)、大西 洋鮭中報(bào)道了其活性 16, 但被染色體整合的狀態(tài)尚未發(fā)現(xiàn)。來(lái)源于小鼠的熱擊蛋白的 啟動(dòng)子和增強(qiáng)子在斑馬魚(yú)的

11、初期胚上顯示出非常高的活性。有人使用小鼠金屬硫蛋白基因的啟動(dòng)子和增強(qiáng)子在虹鱒的肝臟細(xì)胞中表達(dá)目的基因 的強(qiáng)度只有使用其自身的金屬硫蛋白基因的啟動(dòng)子和增強(qiáng)子的 1/2018。另外利用進(jìn)行 轉(zhuǎn)基因時(shí) , 外源基因不應(yīng)含有病毒的有潛在危害的 DNA 序列 , 因此 , 許多學(xué)者一致強(qiáng) 調(diào)構(gòu)建 全魚(yú)基因 的重要性和迫切性 19, 20。1 2 目的基因1 2 1 生長(zhǎng)激素基因?qū)︳~(yú)類(lèi)目的基因的研究是從生長(zhǎng)激素基因開(kāi)始的 , 朱作言 21首先運(yùn)用轉(zhuǎn)基因技術(shù) 將人的生長(zhǎng)激素基因的重組 DNA 導(dǎo)入魚(yú)的受精卵中。隨后在泥鰍 22, 23、闊尾 23、鯽 魚(yú) 22, 24、縮骨鯽 25、青魚(yú) 26、虹鱒 19,

12、 27、溝鯰 27、羅非魚(yú) 28、鮭魚(yú) 16, 29、魴 等 生長(zhǎng)激素的導(dǎo)入相繼成功。Zhang 30通過(guò) RSV 的 LTR 向鯉魚(yú)導(dǎo)入虹鱒的生長(zhǎng)激素互補(bǔ) DNA, 生長(zhǎng)速度比普 通魚(yú)類(lèi)快 20%, 而且這種特性可以遺傳給下一代。美洲大綿 魚(yú) 尉 抗凍蛋白基因的啟動(dòng)子 和增強(qiáng)子連接鮭魚(yú)的生長(zhǎng)激素互補(bǔ) DNA 基因一起導(dǎo)入大西洋鮭 , 結(jié)果其生長(zhǎng)速度比對(duì) 照組快 46倍 , 最高的可達(dá) 30倍 3, 而且這種大西洋鮭的下一代同樣顯出較高的生長(zhǎng) 率。由于抗凍蛋白基因的啟動(dòng)子和增強(qiáng)子在肝臟中活性最高 , 所以有人開(kāi)始考察在肝臟 中產(chǎn)生的生長(zhǎng)激素是否與肝臟中存在生長(zhǎng)激素的受體有關(guān)。近來(lái)在黑鯛的研究中

13、發(fā)現(xiàn) , 生長(zhǎng)激素不僅可以促進(jìn)生長(zhǎng) , 還可以提高魚(yú)苗的成活率 31。1 2 2 抗凍蛋白基因當(dāng)海水溫度低到冰點(diǎn)以下 , 很多魚(yú)不能生存 , 而前面介紹的具有抗凍蛋白的魚(yú)類(lèi)卻 能生存。如果把這種基因?qū)肫胀ǖ聂~(yú)類(lèi) , 使它們?cè)隗w內(nèi)產(chǎn)生抗凍蛋白 , 這樣即使在冰 點(diǎn)以下也可以養(yǎng)殖普通的魚(yú)類(lèi)。56大 連 水 產(chǎn) 學(xué) 院 學(xué) 報(bào) 第 14卷 , (2 外源基因的導(dǎo)入2 1 顯微注射法 32外源基因的導(dǎo)入最常用的方法是給魚(yú)卵進(jìn)行顯微注射 , 即把外源基因吸入玻璃細(xì)管 內(nèi)在顯微鏡下注入魚(yú)卵。斑馬魚(yú)、鮭魚(yú)、大西洋鮭、鯉魚(yú)、美國(guó)鲇魚(yú)、泥鰍、金魚(yú)、鯽 魚(yú)等均被采用 。通常外源基因是在受精卵第一次卵裂前注入胚孔

14、中?？婶~(yú)類(lèi)的卵膜非 常堅(jiān)硬 , 微管難以通過(guò)。為克服這一點(diǎn) , Chourrout 27用金屬針打開(kāi)孔后 , 再用玻璃微 管進(jìn)行顯微注射。由于鯉科魚(yú)的卵膜易被蛋白質(zhì)分解酶分解 , 有的研究人員除去卵膜后 再進(jìn)行顯微注射 33, 34。另外 , 鮭科魚(yú)類(lèi)的卵膜吸水后開(kāi)始硬化 , 在大麻哈魚(yú)上可采用 剛受精卵膜尚未硬化就進(jìn)行顯微注射的方法 19, 35。還有 , 一些魚(yú)類(lèi)的受精孔容易確定 , 通過(guò)開(kāi)孔進(jìn)行顯微注射 28。近來(lái) , Yoshizaki 36發(fā)現(xiàn)鮭魚(yú)的卵在還原型谷胱甘肽溶液中受精能防止卵膜硬化 , 并找到了非常容易進(jìn)行顯微注射的方法。 Ozato 37把即將成熟的卵母細(xì)胞取出 (未受精

15、卵卵膜不硬化 , 向此卵母細(xì)胞進(jìn)行注射。綜上所述三種顯微注 射法為 :一是從受精孔將 DNA 溶液注入卵中 , 簡(jiǎn)稱(chēng) MP 法 ; 二是在受精卵剛受精后卵 殼尚未變硬時(shí)直接注射 , 簡(jiǎn)稱(chēng) EI 法 ; 三是用金屬針在卵殼上打一個(gè)孔 , 再進(jìn)行顯微注 射 , 簡(jiǎn)稱(chēng) LI 法。2 2 電穿孔法所謂電穿孔法 , 是在細(xì)胞 DNA 的混合液中加入電脈沖 , 使細(xì)胞膜臨時(shí)被破壞 , 這 樣細(xì)胞外存在的 DNA 分子既可流入細(xì)胞內(nèi)。這種方 法本來(lái)只用于細(xì)胞培養(yǎng)方面的技 術(shù) , 可是用于混有精子、卵子的 DNA 溶液中 , 也可以得到導(dǎo)入外源基因的魚(yú)。此法用 于斑馬魚(yú) 38, 39、美國(guó)大麻哈 魚(yú) 38、鯉

16、魚(yú) 38、泥鰍 40的受精卵及斑馬魚(yú) 41、大麻哈魚(yú) 42, 43的精子 , 成功地把外源基因?qū)媵~(yú)內(nèi) , 該方法具有能輕易處理大量精子和卵子 的優(yōu)點(diǎn) , 但存在著外源基因?qū)肼实陀陲@微注射的問(wèn)題?？捎械膱?bào)道 PCR 法 (聚合酶 鏈?zhǔn)椒磻?yīng) 檢測(cè)電脈沖法導(dǎo)入外源基因的大麻哈魚(yú)是否存在外源基因時(shí) , 結(jié)果全部個(gè)體 均被檢出外源基因 38, 這個(gè)高導(dǎo)入率可能與 PCR 的經(jīng)驗(yàn)靈敏度非常高有關(guān)。也就是 說(shuō) , 由于電脈沖法很難像顯微注射法那樣向細(xì)胞內(nèi)導(dǎo)入同樣多的外源基因 , 所以認(rèn)為每 個(gè)細(xì)胞所含外源基因的拷貝數(shù)要比注射法所得到的拷貝數(shù)低一些。同樣理由可以推測(cè) , 電穿孔法得到的個(gè)體是含外源基因極低

17、的嵌合體。2 3 基因槍注射法基因槍注射法是通過(guò)把吸附 DNA 的金屬微粒高速打入細(xì)胞內(nèi) , 使基因?qū)爰?xì)胞內(nèi) 的方法。有人在泥鰍、斑馬魚(yú)、鮭魚(yú)的三日胚上應(yīng)用此法 44, 結(jié)果 70%的個(gè)體生存 , 一部分個(gè)體導(dǎo)入了外源基因。此法不僅容易進(jìn)行 , 而且有短期可處理多個(gè)個(gè)體的優(yōu)點(diǎn) , 只是現(xiàn)在的報(bào)道太少 , 有待今后研究。2 4 逆轉(zhuǎn)錄病毒感染法 57第 2期 譚海東等 :轉(zhuǎn)基因魚(yú)的研究進(jìn)展細(xì)胞的染色體上 , 從這種納入病毒基因組的細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞染色體內(nèi)就存在了病毒基 因。如果把目的基因組合到病毒染色體上 , 用改造的病毒侵染宿主細(xì)胞就有可能向細(xì)胞 內(nèi)導(dǎo)入外源基因 45, 但轉(zhuǎn)基因病毒有嚴(yán)格的宿

18、主特異性 , 而且魚(yú)類(lèi)轉(zhuǎn)基因病毒的分析 非常落后 , 對(duì)于魚(yú)類(lèi)很難適應(yīng)此法。有人用能廣泛感染宿主的 VSV (水皰性口炎病毒 的 G-蛋白組合的病毒感染斑馬魚(yú)的胚 , 表明外源基因不僅可以導(dǎo)入魚(yú)內(nèi) , 而且還有外 源基因?qū)霑r(shí)很少改變的優(yōu)點(diǎn) 46。2 5 組織注射法有報(bào)道外源基因向體組織直接注射時(shí) , 周?chē)?xì)胞把外源基因納入 , 并且發(fā)現(xiàn)了那種 外源基因。有人把 CAT (鏈霉素轉(zhuǎn)移酶基因 注射到一些魚(yú)的體側(cè)肌肉上 , 從肌肉勻 漿中檢出 CAT 活性 47。另一方面 , 把含有合成黑色素的互補(bǔ) DNA 質(zhì)粒注射到一些魚(yú) 的體側(cè)肌肉上 , 使周?chē)w表合成黑色素 , 體表黑化 47。這種方法能非

19、常容易地把外源 基因?qū)爰?xì)胞內(nèi) , 所以對(duì)檢出外源基因啟動(dòng)子非常有效。2 6 精子攜帶法最近 , 有人報(bào)道把脫水的精子懸浮于低濃度的 DNA 溶液中 , 在細(xì)胞外液流入最旺 時(shí)加入電脈沖 , 細(xì)胞外 DNA 向精子內(nèi)流動(dòng)效率提高 48。另外 , 精子與 DNA 共培養(yǎng) , 使一部分精子獲得外源基因 , 并且 DNA 與精子的結(jié)合效率較高 2, 但有必要探討導(dǎo)入 率及重復(fù)性。3 外源基因的表達(dá)關(guān)于快速生長(zhǎng)轉(zhuǎn)基因魚(yú)的表達(dá)、產(chǎn)生方法和機(jī)制 , 朱作言 49已做了詳細(xì)的研究。 筆者只介紹一下外源基因的表達(dá)模式及標(biāo)記基因。3 1 每個(gè)階段外源基因的表達(dá)模式向魚(yú)卵導(dǎo)入外源基因 , 被宿主染色體整合 , 同

20、時(shí)其表達(dá)模式在初期發(fā)育中也有很大 幅度的變化。向鮭魚(yú)內(nèi)導(dǎo)入 RSVCAT (勞氏肉瘤病毒氯霉素轉(zhuǎn)移酶基因 , 囊胚期以前 的時(shí)期未能全部確認(rèn) , 可在囊胚期開(kāi)始至發(fā)眼期為止 , 發(fā)現(xiàn)有高水平的表達(dá) , 孵化期表 達(dá)量開(kāi)始下降 50?？箖龅鞍谆虻膯?dòng)子和增強(qiáng)子活性在發(fā)眼期前后開(kāi)始上升 , 而在 孵化期下降 7。 -肌動(dòng)蛋白的啟動(dòng)子和增強(qiáng)子在受精后 35d 顯示出高活性 , 其后急 劇減少 8。如上所述 , 由于所采用的啟動(dòng)子和增強(qiáng)子或宿主的不同 , 其表達(dá)模式有所 差異 , 但均在孵化期前后表達(dá)量減少。因此 , 可以推測(cè)在初期胚過(guò)程中暫時(shí)表達(dá)的基因 是未被染色體整合的外源基因 , 當(dāng)外源基因被

21、分解排除后 , 表達(dá)量就急劇減少。但在鮭 魚(yú)的每一個(gè)細(xì)胞 DNA 量非常少的 12d 胚中 , 在發(fā)眼期也有外源基因的高度表達(dá) , 與此 時(shí)期 RSVLTR 活性化起作用有關(guān)。向鮭魚(yú)內(nèi)導(dǎo)入 RSVCAT , 受精后 70d 開(kāi)始看到被染 色體結(jié)合的基因得到表達(dá) , 從其個(gè)體得到下一代個(gè)體的一部分也表達(dá)了 RSVCAT 。在 鯉魚(yú)中導(dǎo)入 RSV 的 LTR 生長(zhǎng)激素互補(bǔ) DNA 及在大麻哈魚(yú)中導(dǎo)入抗凍蛋白基因 , 均在 , 在 58大 連 水 產(chǎn) 學(xué) 院 學(xué) 報(bào) 第 14卷第2期 譚海東等: 轉(zhuǎn)基因魚(yú)的研究進(jìn)展 59 下一代中也顯示出較高活性 15 。 被染色體整合的外源基因因結(jié)合位置的不同,

22、其表達(dá)受到很大影響, 這種現(xiàn)象被稱(chēng) 為位置效應(yīng)。被整合的外源基因的表達(dá)受到附近基因的促進(jìn)或抑制, 特別是導(dǎo)入的啟動(dòng) 子和增強(qiáng)子活性弱時(shí), 其影響更顯著。今后, 應(yīng)重點(diǎn)開(kāi)發(fā)被染色體整合的也能高水平正 確表達(dá)的啟動(dòng)子和增強(qiáng)子。 3 2 標(biāo)記基因 如上所述, 采用各種魚(yú)進(jìn)行外源基因的表達(dá)研究, 從復(fù)制水平上分析, 通常采用探 針雜交技術(shù); 在蛋白質(zhì)水平上, 是用抗體和抗原特異結(jié)合的特性來(lái)進(jìn)行分析?？墒沁@些 方法測(cè)定時(shí)間長(zhǎng), 操作繁瑣, 低水平表達(dá)的基因很難檢出。于是在檢測(cè)外源基因的表達(dá) 時(shí)多采用標(biāo)記基因, 能高靈敏度檢出轉(zhuǎn)錄、翻譯產(chǎn)物的基因。由于所有的標(biāo)記基因都是 編碼酶的蛋白質(zhì), 所以把蛋白質(zhì)加入

23、組織提取液或組織中就能檢出其酶的活性, 隨著酶 反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)來(lái)提高檢驗(yàn)的靈敏度, 特別是在新啟動(dòng)子和增強(qiáng)子開(kāi)放領(lǐng)域內(nèi), 本方法 是必不可少的技術(shù)。對(duì)轉(zhuǎn)基因魚(yú)來(lái)說(shuō), CAT 基因、 - 半乳糖苷酶基因以及熒光素酶基 因多被采用。無(wú)論采用那種酶都能高靈敏度地、簡(jiǎn)便地檢出表達(dá)基因。乳糖苷酶在組織 切片上也能使表達(dá)組織著色, 而且在魚(yú)類(lèi)的胚原封不動(dòng)的情況下也能檢出其活性, 因而 這種方法最適合外源基因在每個(gè)組織中的表達(dá)分析。熒光素酶是促進(jìn)組織提取液同熒光 素發(fā)生反應(yīng)的酶。小林修一 51 把 GFP ( 綠色熒光蛋白基因 導(dǎo)入斑馬魚(yú), 由于 GFP 受 紫外線(xiàn)照射, GFP 分子本身發(fā)出熒光, 所以非

24、常容易檢出, 因此認(rèn)為此法可用于活體 組織中啟動(dòng)子和增強(qiáng)子活性的檢出。T amiya 52 通過(guò)轉(zhuǎn)基因法把螢火蟲(chóng)的熒光素酶基因 導(dǎo)入魚(yú)體內(nèi), 可以得到能發(fā)出熒光的魚(yú)。 以上就轉(zhuǎn)基因魚(yú)的研究作了介紹, 這個(gè)領(lǐng)域正在高速發(fā)展, 特別是在基礎(chǔ)生物學(xué)領(lǐng) 域。同時(shí), 基因?qū)爰夹g(shù)的應(yīng)用也越來(lái)越廣泛, 但不清楚的地方還很多, 當(dāng)務(wù)之急是從 分子水平上分析魚(yú)類(lèi)的生理現(xiàn)象及表達(dá)基因的結(jié)構(gòu), 以便使人們更能自如地進(jìn)行轉(zhuǎn)基因 操作, 讓轉(zhuǎn)基因魚(yú)從實(shí)驗(yàn)室走向生產(chǎn)化, 培育出具有生長(zhǎng)快、抗病等特點(diǎn)的優(yōu)良品種。 參 1 sion gene J . N at ure, 1992, 300( 16 : 611 615. 2

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