分子標(biāo)記種類及概述

1、分子標(biāo)記概述遺傳標(biāo)記主要有四種類型: 形態(tài)標(biāo)記（morphological marker）、細(xì)胞標(biāo)記（cytological markers）、生化標(biāo)記（Biochemical marker）和分子標(biāo)記（molecular marker）。分子標(biāo)記是其中非常重要的一種，他是以個(gè)體間遺傳物質(zhì)內(nèi)核苷酸序列變異為基礎(chǔ)的遺傳標(biāo)記，是DNA水平遺傳多態(tài)性的直接的反映。早在1923年，Sax等就提出利用微效基因與主基因的緊密連鎖，對(duì)微效基因進(jìn)行選擇的設(shè)想。但由于形態(tài)標(biāo)記數(shù)目有限，而且許多標(biāo)記對(duì)育種家來說是不利性狀，因而難以廣泛應(yīng)用。細(xì)胞標(biāo)記主要依靠染色體核型和帶型，數(shù)目有限。同工酶標(biāo)記在過去的二、三十年中

2、得到了廣泛的發(fā)展與應(yīng)用。作為基因表達(dá)的產(chǎn)物，其結(jié)構(gòu)上的多樣性在一定的程度上能反映生物DNA組成上的差異和生物遺傳多樣性。但由于其為基因表達(dá)加工后的產(chǎn)物，僅是DNA全部多態(tài)性的一部分，而且其特異性易受環(huán)境條件和發(fā)育時(shí)期的影響；此外同工酶標(biāo)記的數(shù)量有限，不能滿足育種需要。近年來，分子生物學(xué)的發(fā)展為植物遺傳標(biāo)記提供了一種基于DNA變異的新技術(shù)手段，即分子標(biāo)記技術(shù)。與其它標(biāo)記方法相比，分子標(biāo)記具有無比的優(yōu)越性。它直接以DNA形式出現(xiàn)，在植物體的各個(gè)組織、各發(fā)育時(shí)期均可檢測(cè)到，不受季節(jié)、環(huán)境的限制，不存在表達(dá)與否的問題；數(shù)量極多，基因組變異極其豐富，分子標(biāo)記的數(shù)量幾乎是無限的；多態(tài)性高，利用大量引物、探

3、針可完成覆蓋基因組的分析；表現(xiàn)為中性，即不影響目標(biāo)性狀的表達(dá)，與不良性狀無必然的連鎖；許多標(biāo)記為共顯性，對(duì)隱性的性狀的選擇十分便利，能夠鑒別出純合的基因型與雜合的基因型，提供完整的遺傳信息。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，現(xiàn)在DNA分子標(biāo)記技術(shù)已有數(shù)十種，廣泛應(yīng)用于遺傳育種、基因組作圖、基因定位、物種親緣關(guān)系鑒別、基因庫構(gòu)建、基因克隆等方面。分子標(biāo)記的概念有廣義和狹義之分。廣義的分子標(biāo)記是指可遺傳的并可檢測(cè)的DNA序列或蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)標(biāo)記包括種子貯藏蛋白和同工酶（指由一個(gè)以上基因位點(diǎn)編碼的酶的不同分子形式）及等位酶（指由同一基因位點(diǎn)的不同等位基因編碼的酶的不同分子形式）。狹義分子標(biāo)記是指能反映生物個(gè)

4、體或種群間基因組中某種差異的特異性DNA片段。理想的分子標(biāo)記必須達(dá)以下幾個(gè)要求：(1) 具有高的多態(tài)性；(2) 共顯性遺傳，即利用分子標(biāo)記可鑒別二倍體中雜合和純合基因型；(3) 能明確辨別等位基因；(4) 遍布整個(gè)基因組；(5) 除特殊位點(diǎn)的標(biāo)記外，要求分子標(biāo)記均勻分布于整個(gè)基因組；(6) 選擇中性(即無基因多效性)；(7) 檢測(cè)手段簡單、快速(如實(shí)驗(yàn)程序易自動(dòng)化)；(8) 開發(fā)成本和使用成本盡量低廉；(9) 在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)和實(shí)驗(yàn)室間重復(fù)性好(便于數(shù)據(jù)交換)。但是，目前發(fā)現(xiàn)的任何一種分子標(biāo)記均不能滿足以所有要求。分子標(biāo)記種類利用分子標(biāo)記技術(shù)分析生物個(gè)體之間DNA序列差別并用于作圖的研究始于1980

5、年。經(jīng)過十幾年的發(fā)展，現(xiàn)在的DNA標(biāo)記技術(shù)已有幾十種，主要有一下幾大類。一、基于分子雜交的分子標(biāo)記這類標(biāo)記利用限制性內(nèi)切酶酶切及凝膠電泳分離不同生物體的DNA分子，然后用特異探針進(jìn)行雜交，通過放射性自顯影或非同位素顯色技術(shù)揭示DNA的多態(tài)性。（一）限制性片段長度多態(tài)性（Restriction Fragment Length Polymorphism，RFLP）限制性片段長度多態(tài)性是出現(xiàn)最早和應(yīng)用最廣泛的DNA標(biāo)記技術(shù)之一。1974年Grodzicker等創(chuàng)立了該技術(shù)，它是一種以DNADNA雜交為基礎(chǔ)的第一代遺傳標(biāo)記。RFLP標(biāo)記非常穩(wěn)定，它是一種共顯性標(biāo)記，在分離群體中可區(qū)分純合體與雜合體，提

6、供標(biāo)記位點(diǎn)完整的遺傳信息。多種農(nóng)作物的RFLP分子遺傳圖譜已經(jīng)建成。但其分析所需DNA量較大，步驟較多，周期長，制備探針及檢測(cè)中要用到放射性同位素，盡管可用非放射性同位素標(biāo)記方法代替，但成本高、成功率低，且實(shí)驗(yàn)檢測(cè)步驟較多，依然影響其使用、推廣。自RFLP問世以來，已經(jīng)在基因定位及分型、遺傳連鎖圖譜的構(gòu)建、疾病的基因診斷等研究中仍得到了廣泛的應(yīng)用。RFLP基本原理：利用特定的限制性內(nèi)切酶識(shí)別并切割不同生物個(gè)體的基因組DNA，得到大小不等的DNA片段，所產(chǎn)生的DNA數(shù)目和各個(gè)片段的長度反映了DNA分子上不同酶切位點(diǎn)的分布情況。通過凝膠電泳分析這些片段，就形成不同帶，然后與克隆DNA探針進(jìn)行Sou

7、thern雜交和放射顯影，即獲得反映個(gè)體特異性的RFLP圖譜。它所代表的是基因組DNA在限制性內(nèi)切酶消化后產(chǎn)生片段在長度上差異。由于不同個(gè)體的等位基因之間堿基的替換、重排、缺失等變化導(dǎo)致限制內(nèi)切酶識(shí)別和酶切發(fā)生改變從而造成基因型間限制性片段長度的差異。圖7-2 RFLP圖譜（二）小衛(wèi)星DNA（Minisatellite DNA）小衛(wèi)星DNA（Minisatellite DNA）又稱數(shù)目可變串聯(lián)重復(fù)序列（Variable Number of Tandem Repeat，VNTR）是一種重復(fù)DNA小序列，為10到幾百核苷酸，拷貝數(shù)1010000不等。多態(tài)性由于重復(fù)單位之間的不平衡交換，從而產(chǎn)生不同

8、等位基因，可通過雜交檢測(cè)出。其缺點(diǎn)是多態(tài)性分布集中，數(shù)量有限，而且在基因組上分布不均勻，合成探針困難，實(shí)驗(yàn)操作繁瑣、檢測(cè)時(shí)間長、成本高，因此應(yīng)用并不廣泛。VNTR基本原理與RFLP大致相同，只是對(duì)限制性內(nèi)切酶和DNA探針有特殊要求：(1)限制性內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn)必須不在重復(fù)序列中，以保證小衛(wèi)星或微衛(wèi)星序列的完整性。(2)內(nèi)切酶在基因組的其他部位有較多酶切位點(diǎn)，則可使衛(wèi)星序列所在片段含有較少無關(guān)序列，通過電泳可充分顯示不同長度重復(fù)序列片段的多態(tài)性。(3)分子雜交所用DNA探針核昔酸序列必須是小衛(wèi)星序列或微衛(wèi)星序列，通過分子雜交和放射自顯影后，就可一次性檢測(cè)到眾多小衛(wèi)星或微衛(wèi)星位點(diǎn)，得到個(gè)體特異性的

9、DNA指紋圖譜。二、基于PCR技術(shù)的分子標(biāo)記（一）、隨機(jī)引物的PCR標(biāo)記(1) 隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA（Random Amplified Polymorphic DNA，RAPD）隨機(jī)擴(kuò)增片段長度多態(tài)性DNA，是由Williams和Welsh（1990）同時(shí)發(fā)展起來的一項(xiàng)新的遺傳標(biāo)記技術(shù)。RAPD以PCR為基礎(chǔ)而又不同于經(jīng)典的PCR，一般采用10個(gè)核苷酸的DNA序列為引物，擴(kuò)增時(shí)退火溫度降至35左右。與其它標(biāo)記相比，RAPD具有以下優(yōu)點(diǎn)：a）技術(shù)簡單，檢測(cè)速度快；b）成本較低；c）不依賴于種屬的特異性和基因組的結(jié)構(gòu)，合成的一套引物可用于不同生物基因組的分析；d）操作簡單，可實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化，短期內(nèi)可利

10、用大量引物完成覆蓋基因組的分析；e）不需制備探針、雜交等程序，成本較低；f）DNA用量少（10ngDNA即可完成一次分析），允許快速、簡單地分離基因組DNA。同時(shí)RAPD也存在一些缺點(diǎn)：a）RAPD標(biāo)記是一個(gè)顯性標(biāo)記，不能鑒別雜合子和純合子；b）存在共遷移問題，凝膠電泳只能分開不同長度DNA片段，而不能分開那些分子量相同但堿基序列組成不同的DNA片段；c）RAPD技術(shù)中影響因素很多，所以實(shí)驗(yàn)的穩(wěn)定性和重復(fù)性差。基本原理：它是利用隨機(jī)引物（一般為810bp）通過PCR反應(yīng)非定點(diǎn)擴(kuò)增DNA片段，然后用凝膠電泳分析擴(kuò)增產(chǎn)物DNA片段的多態(tài)性。擴(kuò)增片段多態(tài)性便反映了基因組相應(yīng)區(qū)域的DNA多態(tài)性。RAP

11、D所使用的引物各不相同，但對(duì)任一特定引物，它在基因組DNA序列上有其特定的結(jié)合位點(diǎn)，一旦基因組在這些區(qū)域發(fā)生DAN片段插人、缺失或堿基突變，就可能導(dǎo)致這些特定結(jié)合位點(diǎn)的分布發(fā)生變化，從而導(dǎo)致擴(kuò)增產(chǎn)物數(shù)量和大小發(fā)生改變，表現(xiàn)出多態(tài)性。就單一引物而言，其只能檢測(cè)基因組特定區(qū)域DNA多態(tài)性，但利用一系列引物則可使檢測(cè)區(qū)域擴(kuò)大到整個(gè)基因組，因此，RAPD可用于對(duì)整個(gè)基因組DNA進(jìn)行多態(tài)性檢測(cè)，也可用于構(gòu)建基因組指紋圖譜。RAPD已在遺傳圖譜構(gòu)建、種質(zhì)資源分析、基因標(biāo)記等方面得到了廣泛的應(yīng)用。圖7-4 RAPD圖譜（2）任意引物PCR (Arbitrarily Primed Polymerase Cha

12、in Reaction， APPCR)在APPCR分析中，所使用的引物較長(1050 bp) ， PCR反應(yīng)分為兩個(gè)階段，首先寡核昔酸引物在低嚴(yán)謹(jǐn)條件下與模板DNA退火，此時(shí)發(fā)生了一些合成，以便穩(wěn)定模板與引物之間相互作用。然后進(jìn)行高嚴(yán)謹(jǐn)退火條件的循環(huán)，兩個(gè)位點(diǎn)間那些序列在低嚴(yán)謹(jǐn)度退火條件下發(fā)生的引物延伸可繼續(xù)在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下擴(kuò)增。采用變性聚丙烯酞胺凝膠電泳分析PCR產(chǎn)物，最終反應(yīng)結(jié)果與RAPD類似。只要設(shè)計(jì)的引物在低嚴(yán)謹(jǐn)退火條件下能減少引物產(chǎn)生人為產(chǎn)物，應(yīng)用成對(duì)組合的引物可以產(chǎn)生新的APPC R譜帶，但引物配對(duì)組合使用時(shí)，得到的圖譜與單引物單獨(dú)使用時(shí)產(chǎn)生的圖譜之和很不相同，這樣，50個(gè)引物能產(chǎn)生

13、1250種不同指紋圖譜。APPCR方法不需預(yù)知序列資料，而且檢測(cè)的基因組樣本是任意的，還能夠用于檢測(cè)近等基因系(或同類系)中的多態(tài)性。APPCR的缺點(diǎn)是每個(gè)新的多態(tài)性都必須經(jīng)純化才能進(jìn)一步使用。另外，此方法在雜合體中僅可辨別長度多態(tài)性。（3）DNA擴(kuò)增指紋印跡(DNA Amplification Fingerprinting，DAF)DAF是一種改進(jìn)的RAPD分析技術(shù)，與RAPD技術(shù)不同的是，DAF分析中所使用的引物濃度更高，長度更短(一般為5一8 bp)，因此它所提供的譜帶信息比RAPD大得多，如當(dāng)使用5個(gè)核昔酸的引物時(shí)，引物和模板的組合大約可擴(kuò)增出10一100個(gè)DNA片段。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物是

14、在凝膠上進(jìn)行分離，通過銀染即可產(chǎn)生非常復(fù)雜帶型。（二）、特異引物的PCR標(biāo)記特異引物的PCR標(biāo)記所用引物是針對(duì)已知序列的 DNA 區(qū)段而設(shè)計(jì)的，具有特定核苷酸序列（通常為 1824 bp），可在常規(guī)PCR復(fù)性溫度下進(jìn)行擴(kuò)增，對(duì)基因組 DNA 的特定區(qū)域進(jìn)行多態(tài)性分析。（1）序列標(biāo)志位點(diǎn)(Sequence Tagged Sites，STS)STS是對(duì)以特定對(duì)引物序進(jìn)行PCR特異擴(kuò)增的一類分子標(biāo)記的統(tǒng)稱。通過設(shè)計(jì)特定的引物，使其與基因組DNA序列中特定結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合，從而可用來擴(kuò)增基因組中特定區(qū)域，分析其多態(tài)性。利用特異PCR技術(shù)的最大優(yōu)點(diǎn)是它產(chǎn)生信息非?？煽?，而不像RFLP和RAPD那樣存在某種模

15、糊性。（2）簡單重復(fù)序列(Simple Sequence Repeat，SSR)簡單重復(fù)序(SSR)也稱微衛(wèi)星DNA，也可稱為SSRP(Simple Sequence Repeat Polymorphisms)，STMS (Sequence-tagged microsatellites)。其串聯(lián)重復(fù)的核心序列為1一6 bp，其中最常見是雙核昔酸重復(fù)，即(CA) n和(TG) n每個(gè)微衛(wèi)星DNA的核心序列結(jié)構(gòu)相同，重復(fù)單位數(shù)目10一60個(gè)，其高度多態(tài)性主要來源于串聯(lián)數(shù)目的不同。SSR標(biāo)記的基本原理：根據(jù)微衛(wèi)星序列兩端互補(bǔ)序列設(shè)計(jì)引物，通過PCR反應(yīng)擴(kuò)增微衛(wèi)星片段，由于核心序列串聯(lián)重復(fù)數(shù)目不同，因

16、而能夠用PCR的方法擴(kuò)增出不同長度的PCR產(chǎn)物，將擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳，根據(jù)分離片段的大小決定基因型并計(jì)算等位基因頻率。SSR具有以下一些優(yōu)點(diǎn)：(l)一般檢測(cè)到的是一個(gè)單一的多等位基因位點(diǎn)；(2)微衛(wèi)星呈共顯性遺傳，故可鑒別雜合子和純合子；(3)所需DNA量少。顯然，在采用SSR技術(shù)分析微衛(wèi)星DNA多態(tài)性時(shí)必須知道重復(fù)序列兩端的DNA序列的信息。如不能直接從DNA數(shù)據(jù)庫查尋則首先必須對(duì)其進(jìn)行測(cè)序。（3）序列特異性擴(kuò)增區(qū)(Sequencecharacterized Amplified Region，SCAR)SCAR標(biāo)記是在RAPD技術(shù)基礎(chǔ)上發(fā)展起來的。SCAR標(biāo)記是將目標(biāo) RAPD 片段進(jìn)行克

17、隆并對(duì)其末端測(cè)序，根據(jù) RAPD 片段兩端序列設(shè)計(jì)特異引物，對(duì)基因 DNA 片段再進(jìn)行PCR特異擴(kuò)增，把與原RAPD片段相對(duì)應(yīng)的單一位點(diǎn)鑒別出來。SCAR標(biāo)記是共顯性遺傳，待檢 DNA 間的差異可直接通過有無擴(kuò)增產(chǎn)物來顯示。SCAR標(biāo)記方便、快捷、可靠，可以快速檢測(cè)大量個(gè)體，結(jié)果穩(wěn)定性好，重現(xiàn)性高。（4）單引物擴(kuò)增反應(yīng)(Single Primer Amplificatipn Reawtion，SPAR)SPAR技術(shù)是與RAPD技術(shù)相似的一種標(biāo)記技術(shù)，SPAR也只用一個(gè)引物，但所用的引物是在SSR的基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)的。這些引物能與SSR之間的間隔序列進(jìn)行特異性結(jié)合，然后通過P(：R技術(shù)擴(kuò)增SSR之間的

18、DNA序列，凝膠電泳分離擴(kuò)增產(chǎn)物，分析其多態(tài)性。另外，還有一種與SPAR技術(shù)非常相似的標(biāo)記技術(shù)，即ISTR ( Inverse Sequencetagged Repeat)技術(shù)，ISTR所用的引物是在反向重復(fù)序列基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)的，PCR擴(kuò)增的是反向重復(fù)序列之間的DIVA序列。（5）DNA單鏈構(gòu)象多態(tài)性(Single Strand Conformation Polymorphism，SSCP)SSCP是指等長的單鏈DNA因核昔酸序列的差異而產(chǎn)生構(gòu)象變異，在非變性聚丙烯酞胺中的表現(xiàn)為電泳遷移率的差別。單鏈DNA構(gòu)象分析對(duì)DNA序列的改變非常敏感，常常一個(gè)堿基差別都能顯示出來。在SSCP分析中，利用PC

19、R技術(shù)定點(diǎn)擴(kuò)增基因組DNA中某一目的片段，將擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行變性處理，雙鏈DNA分開成單鏈，再用非變性聚丙烯酞胺凝膠電泳分離，根據(jù)條帶位置變化來判斷目的片段中是否存在突變。SSCP結(jié)果判定是通過多個(gè)樣品之間對(duì)比，觀察條帶之間位置改變，從而顯示出不同生物個(gè)體的DNA特異性，達(dá)到指紋分析目的。為了進(jìn)一步提高SSCP的檢出率，可將SSCP分析與其它突變檢測(cè)方法相結(jié)合。其中與雜交雙鏈分析(Heterocluplex analysis，Het)法結(jié)合可以大大提高檢出率。Het法是用探針與要檢測(cè)的單鏈DNA或RNA進(jìn)行雜交，含有一對(duì)堿基對(duì)錯(cuò)配的雜交鏈可以和完全互補(bǔ)的雜交鏈在非變性PAG凝膠上通過電泳被分離開。

20、對(duì)同一靶序列分別進(jìn)行SSCP和Het分析可以使點(diǎn)突變的檢出率接近100%，而且實(shí)驗(yàn)簡便。（6）雙脫氧化指紋法(Dideoxy Fingerprints，ddF )ddF是將雙脫氧末端終止測(cè)序法與SSCP結(jié)合起來的分析技術(shù)，對(duì)由雙脫氧末端終止的長短不一的單鏈DNA進(jìn)行SSCP分析。如果目的片段存在一個(gè)突變，則所有大于某一大小對(duì)應(yīng)于突主變位置的雙脫氧終止片段無野生型系統(tǒng)，對(duì)于每一個(gè)突有多次機(jī)會(huì)檢測(cè)其遷移率改變，提高了檢測(cè)突變的效率。ddF方法克服了SSCP分析時(shí)因DNA長度影響SSCP顯示的困難，通過一種雙脫氧核昔酸生產(chǎn)特異性的單鏈DNA，使其中長度合適的DNA片段顯示SSCP改變。（7）DAMD

21、 (directed amplification of minisatellite region DNA)直接用小衛(wèi)星的核心序列作引物進(jìn)行擴(kuò)增。（8）Inter-Alu PCR like genomic profiling與SPAR技術(shù)相近，也只用一個(gè)引物，但所用的引物是在Alu序列（為中等重復(fù)序列）的基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)的，擴(kuò)增的是Alu序列之間的DNA序列。 （9）ISTR (inverse sequence-tagged repeat)這種技術(shù)與SPAR技術(shù)也相近，也所用的引物是在copia序列反向重復(fù)序列的基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)的，擴(kuò)增的是copia序列之間的DNA序列。（10）IFLP (intron f

22、ragment length polymorphism) 檢測(cè)的對(duì)象是內(nèi)含子的長度差異。（11）RAMPO (random amplified microsatellite polymorphism)RAMPO的英文全名與RAMP的英文全名相近，但實(shí)驗(yàn)方法卻不同。RAMPO的基本步驟是：先用一個(gè)單一的隨機(jī)引物（即RAPD引物）對(duì)基因組DNA擴(kuò)增，用電泳將擴(kuò)增片段分開，然后，把凝膠轉(zhuǎn)移到尼龍膜上，使之與一個(gè)帶有放射性標(biāo)記（或其它標(biāo)記）的與SSR互補(bǔ)的寡核苷酸探針（如CA8和ga8）雜交，放射自顯影后可得到新的多態(tài)性類型。（12）RFLP-PCR先找到RFLP標(biāo)記后，對(duì)RFLP探針進(jìn)行測(cè)序，再合成

23、適當(dāng)?shù)腜CR引物，這樣可發(fā)現(xiàn)新的STS標(biāo)記。這也可稱為RFLP-PCR。 (13) SRAP 技術(shù) 簡單序列重復(fù)(Inter-simple sequence repeat)(sequence-specific amplification polymorphism)相關(guān)序列擴(kuò)增多態(tài)性(Sequencerelated amplifiedpolymorphism，SRAP)是一種新型的基于PCR的標(biāo)記系統(tǒng)，是由美國加州大學(xué)蔬菜系Li與Quiros博士于2001年在蕓薹屬作物開發(fā)出來。該標(biāo)記通過獨(dú)特的雙引物設(shè)計(jì)對(duì)基因的ORFs(Open reading frames)的特定區(qū)域進(jìn)行擴(kuò)增，上游引物長17

24、bp，對(duì)外顯子區(qū)域進(jìn)行特異擴(kuò)增。下游引物長18bp，對(duì)內(nèi)含子區(qū)域、啟動(dòng)子區(qū)域進(jìn)行特異擴(kuò)增。因不同個(gè)體以及物種的內(nèi)含子、啟動(dòng)子與間隔區(qū)長度不同而產(chǎn)生多態(tài)性。該標(biāo)記具有簡便、高效、產(chǎn)率高、高共顯性、重復(fù)性好、易測(cè)序、便于克隆目標(biāo)片段的特點(diǎn)。目前已成功地應(yīng)用于作物遺傳多樣性分析、遺傳圖譜的構(gòu)建、重要性狀的標(biāo)記以及相關(guān)基因的克隆等方面. 三、 基于限制性酶切和PCR技術(shù)的DNA標(biāo)記（一）擴(kuò)增片段長度多態(tài)性(Amplified Fragment Length Polymorphism，AFLP )AFLP是1993年荷蘭科學(xué)家Zbaeau和Vos發(fā)展起來的一種檢測(cè)DN A多態(tài)性的新方法。AFLP 是 R

25、FLP 與PCR相結(jié)合的產(chǎn)物，其基本原理是先利用限制性內(nèi)切酶水解基因組 DNA 產(chǎn)生不同大小的 DNA 片段，再使雙鏈人工接頭的酶切片段相邊接，作為擴(kuò)增反應(yīng)的模板 DNA，然后以人工接頭的互補(bǔ)鏈為引物進(jìn)行預(yù)擴(kuò)增，最后在接頭互補(bǔ)鏈的基礎(chǔ)上添加 13個(gè)選擇性核苷酸作引物對(duì)模板 DNA 基因再進(jìn)行選擇性擴(kuò)增，通過聚丙烯酰胺凝膠電泳分離檢測(cè)獲得的DNA擴(kuò)增片段，根據(jù)擴(kuò)增片段長度的不同檢測(cè)出多態(tài)性。引物由三部分組成：與人工接頭互補(bǔ)的核心堿基序列、限制性內(nèi)切酶識(shí)別序列、引物3端的選擇堿基序列（110 bp）。接頭與接頭相鄰的酶切片段的幾個(gè)堿基序列為結(jié)合位點(diǎn)。該技術(shù)的獨(dú)特之處在于所用的專用引物可在知道 DN

26、A 信息的前提下就可對(duì)酶切片段進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。為使酶切濃度大小分布均勻，一般采用兩個(gè)限制性內(nèi)切酶，一個(gè)酶為多切點(diǎn)，另一個(gè)酶切點(diǎn)數(shù)較少，因而 AFLP 分析產(chǎn)生的主要是由兩個(gè)酶共同酶切的片段。AFLP 結(jié)合了 RFLP 和 RAPD兩種技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)，具有分辨率高、穩(wěn)定性好、效率高的優(yōu)點(diǎn)。但它的技術(shù)費(fèi)用昂貴，對(duì) DNA 的純度和內(nèi)切酶的質(zhì)量要求很高。盡管 AFLP 技術(shù)誕生時(shí)間較短，但可稱之為分子標(biāo)記技術(shù)的又一次重大突破，被認(rèn)為是目前一種十分理想、有效的分子標(biāo)記。圖7-5 AFLP的銀染檢測(cè)結(jié)果（二）酶切擴(kuò)增多態(tài)性序列(Cleaved Amplified Polymorphism Sequence

27、s，CAPS )CAPS技術(shù)又稱為PCRRFLP，它實(shí)質(zhì)上是PCR技術(shù)與RFLP技術(shù)結(jié)合的一種方法。CAPS的基本原理是利用己知位點(diǎn)的DNA序列資源設(shè)計(jì)出一套特異性的PCR引物(1927bp），然后用這些引物擴(kuò)增該位點(diǎn)上的某一DNA片段，接著用一種專一性的限制性內(nèi)切酶切割所得擴(kuò)增產(chǎn)物，凝膠電泳分離酶切片段，染色并進(jìn)行RFLP分析。GAPS標(biāo)記揭示的是特異PGR片段的限制性長度變異的信息。CAPS是一類共顯性分子標(biāo)記，其優(yōu)點(diǎn)是避免了RFLP分析中膜轉(zhuǎn)印這一步驟，又能保持RFLP分析的精確度。另外，由于很多限制性內(nèi)切酶均可與擴(kuò)增DNA酶切，所以檢測(cè)到多態(tài)性機(jī)會(huì)較大。四、 基于DNA芯片技術(shù)的分子標(biāo)

28、記技術(shù)核苷酸多態(tài)性(Single Nucleotide Polymorphism，SNP)SNP標(biāo)記是美國學(xué)者Lander E于1996年提出的第三代DNA遺傳標(biāo)記。SNP是指同一位點(diǎn)的不同等位基因之間僅有個(gè)別核苷酸的差異或只有小的插入、缺失等。從分子水平上對(duì)單個(gè)核苷酸的差異進(jìn)行檢測(cè)，SNP 標(biāo)記可幫助區(qū)分兩個(gè)個(gè)體遺傳物質(zhì)的差異。人類基因組大約每 1000 bp SNP 出現(xiàn)一次，已有2000多個(gè)標(biāo)記定位于人類染色體，對(duì)人類基因組學(xué)研究具有重要意義。檢測(cè) SNP 的最佳方法是 DNA 芯片技術(shù)。SNP 被稱為第三代 DNA 分子標(biāo)記技術(shù)，隨著 DNA 芯片技術(shù)的發(fā)展，其有望成為最重要最有效的分子標(biāo)記技。分子標(biāo)記的應(yīng)用領(lǐng)域一、基因組作圖和基因定位研究長期以來，各種生物的遺傳圖譜幾乎都是根據(jù)諸如形態(tài)、生理和生化等常規(guī)標(biāo)記來構(gòu)建的，所建成的遺傳圖譜僅限少數(shù)種類的生物，而且圖譜分辨率大多很低，圖距大，飽和度低，因而應(yīng)用價(jià)值有限。分子標(biāo)記用于遺傳圖譜構(gòu)建是遺傳學(xué)領(lǐng)域的重大進(jìn)展之一。隨著新的標(biāo)記技術(shù)的發(fā)展，生物遺傳圖譜名單上