FHIT基因過表達(dá)對人胃癌細(xì)胞系MKN45增殖和粘附的影響

1、FHIT基因過表達(dá)對人胃癌細(xì)胞系MKN-45增殖和粘附的影響 作者：黃照權(quán)，劉飛，黃培林，李楠，徐佳佳，吳鵬【摘要】 目的 探討FHIT基因過表達(dá)對人胃癌細(xì)胞系MKN-45增殖和粘附能力的影響。方法 將載有人外源性FHIT基因的真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1-FHIT轉(zhuǎn)染FHIT基因mRNA陰性表達(dá)人胃癌細(xì)胞系MKN-45，分別用MTT法、平板克隆形成實(shí)驗(yàn)、黏附實(shí)驗(yàn)檢測轉(zhuǎn)染前后細(xì)胞增殖活性、克隆形成能力及粘附能力的變化。結(jié)果 FHIT基因的過表達(dá)可降低MKN-45細(xì)胞的增殖和克隆形成能力（P<0.05），但是對MKN-45細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞的粘附能力無明顯影響。結(jié)論 FHIT基因過表達(dá)

2、可抑制人胃癌細(xì)胞系MKN-45的增殖和克隆形成，對于MKN-45細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞的粘附能力無明顯影響。 【關(guān)鍵詞】 FHIT 胃腫瘤 細(xì)胞增殖 克隆 分子 基因 轉(zhuǎn)染 細(xì)胞粘附Abstract: Objective To evaluate the effects of FHIT gene over-expression on human gastric cancer cell line MKN-45 proliferation and adhesion. Methods Human xenogenous eukaryotic expression plasmid pcDNA3.1-FHIT we

3、re transfected to mRNA-negative human gastric cell line MKN-45. A MTT assay, plate clony-forming test and adhesion test were performed to assess the MKN-45 cells' proliferative activity, clony-forming capability and adhesive ability before and after transfection. Results FHIT over-expression can

4、 reduce MKN-45 cells' proliferation and clony-forming capability (P<0.05), but it was ineffectiveness on MKN-45 cells and endothelial cells adhesion. Conclusion FHIT over-expression can inhibit the proliferation and clony-forming ability of human gastric cell line MKN-45, it dose not work

5、 on MKN-45 cells and endothelial cells adhesive ability. Key words: FHIT; gastric neoplasms; cell proliferation; cloning, molecular; genes; transfection; cell adhesion胃癌的發(fā)生已被公認(rèn)是一個(gè)多基因、多步驟過程，涉及ras、p27等癌基因，p53、APC等抑癌基因，但完整的胃癌發(fā)生基因譜仍不清楚。脆性組氨酸三聯(lián)體(fragile histidine triad, FHIT)基因是Ohta等于1996年從上皮癌細(xì)胞系3p14.2區(qū)域

6、克隆出的一個(gè)候選抑癌基因，該基因在所有檢測過的人正常組織中都表達(dá)；但在多種腫瘤組織和細(xì)胞系中，F(xiàn)HIT基因結(jié)構(gòu)及表達(dá)異常13。我們將成功構(gòu)建的含F(xiàn)HIT基因的真核表達(dá)載體pcDNA3.1-FHIT轉(zhuǎn)染至人胃癌細(xì)胞系MKN-45中，得到穩(wěn)定的過表達(dá)，觀察轉(zhuǎn)染前后MKN-45細(xì)胞系增殖、克隆形成、細(xì)胞粘附等方面生物學(xué)行為的變化，以探討FHIT基因?qū)ξ赴┑挠绊憽? 材料與方法1.1 材料1.1.1 細(xì)胞系和材料 人低分化胃腺癌細(xì)胞系MKN-45、人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞系ECV304，由東南大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院中心實(shí)驗(yàn)室饋贈。真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1購自Invitrogen公司。1.1.2 主要試劑 RPMI

7、1640培養(yǎng)基購自美國Gibco公司，胎牛血清購自杭州四季青公司，脂質(zhì)體Lipofectamin2000購自美國Invitrogen公司。二甲基亞砜購自上海凌峰化學(xué)試劑有限公司，MTT購自Promega公司，其它生化試劑均為分析純。1.2 方法1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 人低分化胃腺癌細(xì)胞系MKN-45、人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞系ECV304，在37 、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)液為含10%小牛血清、100u/ml青霉素和100u/ml鏈霉素的RPMI1640。1.2.2 真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1-FHIT的轉(zhuǎn)染 參照說明書，用lipofectamine 2000將真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1-FHI

8、T轉(zhuǎn)染至FHIT基因mRNA陰性表達(dá)的人胃癌細(xì)胞系MKN-45。轉(zhuǎn)染后采用G418篩選陽性克隆，并且繼續(xù)培養(yǎng)。用RT-PCR法檢測FHIT基因mRNA的表達(dá)。轉(zhuǎn)染組細(xì)胞有目的基因條帶出現(xiàn)，而轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒組和陰性對照組均無目的條帶出現(xiàn)，證明轉(zhuǎn)染成功。1.2.3 MTT法檢測細(xì)胞增殖活性 分別收集空白對照組、pcDNA3.1轉(zhuǎn)染組和pcDNA3.1-FHIT轉(zhuǎn)染組處于對數(shù)期的細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞懸液濃度，分于96孔板，1×104/孔。置37，5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)使細(xì)胞貼壁。根據(jù)不同組別，12、36、60、84h后檢測細(xì)胞活性。檢測時(shí)小心吸去上清，PBS輕輕洗滌，再次棄上清。每孔加入180l新鮮R

9、PMI1640培養(yǎng)液，再加入MTT溶液20l（5mg/ml），繼續(xù)培養(yǎng)4h。終止培養(yǎng)，小心吸去孔內(nèi)培養(yǎng)液。每孔加入150l二甲基亞砜，置搖床上低速振蕩10min，使結(jié)晶物充分溶解。在酶聯(lián)免疫檢測儀490nm或570nm處測量各孔的吸光值。同時(shí)設(shè)置調(diào)零孔（培養(yǎng)基、MTT、二甲基亞砜），每組設(shè)定3復(fù)孔。以O(shè)D值為縱坐標(biāo)，以時(shí)間（h）為橫坐標(biāo)，繪制生長曲線。1.2.4 平板克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞克隆形成能力 分別收集空白對照組、pcDNA3.1轉(zhuǎn)染組和pcDNA3.1-FHIT轉(zhuǎn)染組細(xì)胞接種在6孔板上，每孔為200個(gè)細(xì)胞，常規(guī)培養(yǎng)20天后姬姆薩染色。沖洗染色液，觀察各平皿細(xì)胞克隆的形成數(shù)量。1.2.5

10、 黏附實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞粘附能力變化 培養(yǎng)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞系ECV304經(jīng)PBS洗滌兩次，接種于96孔板。待內(nèi)皮304細(xì)胞長滿96孔板，棄去培養(yǎng)液，PBS洗滌一次。將分別收集的空白對照組、pcDNA3.1轉(zhuǎn)染組和pcDNA3.1-FHIT轉(zhuǎn)染組細(xì)胞5×104個(gè)/孔接種其上。將96孔板放入37，5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)45min。PBS洗滌兩次，棄去未被吸附的內(nèi)皮304細(xì)胞。加入0.25% Rose Bergal，100l/孔，室溫放置5min，PBS洗滌兩次。加入95%乙醇，200l/孔, 室溫30min，570nm測光密度值。細(xì)胞吸光率=總吸光率-內(nèi)皮細(xì)胞吸光率。實(shí)驗(yàn)重復(fù)三遍。1.3 統(tǒng)計(jì)

11、學(xué)分析 計(jì)量資料以±s表示，采用SPSS 11.5統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析均數(shù)間差別多重比較的LSD(Least significant difference)檢驗(yàn)。統(tǒng)計(jì)結(jié)果的圖形化由Excel 2000繪圖程序完成。2 結(jié)果2.1 重組質(zhì)粒pcDNA3.1-FHIT轉(zhuǎn)染MKN-45細(xì)胞后FHIT基因mRNA的表達(dá)情況 pcDNA3.1-FHIT-MKN45細(xì)胞有462bp大小的目的基因條帶出現(xiàn)，而pcDNA3.1- MKN-45細(xì)胞和MKN-45細(xì)胞均無目的條帶出現(xiàn)（見圖1）。2.2 FHIT基因過表達(dá)對MKN-45細(xì)胞增殖能力的影響 隨著細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)間的逐漸延長，pcDNA3.1

12、-FHIT轉(zhuǎn)染組細(xì)胞的生長曲線增長幅度較pcDNA3.1空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組及空白對照組細(xì)胞降低（見圖2）。細(xì)胞生長至84h，pcDNA3.1-FHIT轉(zhuǎn)染組細(xì)胞生長曲線明顯低于pcDNA3.1空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組和空白對照組（P<0.05）。而空白對照組和pcDNA3.1空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組間差異無顯著性（P>0.05）。 見表1。2.3 FHIT基因過表達(dá)對MKN-45細(xì)胞平板克隆形成能力的影響 圖3可見pcDNA3.1-FHIT轉(zhuǎn)染組細(xì)胞克隆形成能力低于pcDNA3.1空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組和空白對照組（P均<0.05）。而空白對照組和pcDNA3.1空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組間差異無顯著性（

13、P>0.05）。2.4 FHIT基因過表達(dá)對MKN-45細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞間粘附能力的影響 各組之間吸光度值差異無顯著性(P>0.05)，提示FHIT基因過表達(dá)對MKN- 45細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞間粘附能力無明顯影響，見表2。圖1 轉(zhuǎn)染MKN細(xì)胞后RT-PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳圖（略）1.pcDNA3.1-FHIT轉(zhuǎn)染組；2.pcDNA3.1空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組；3.陰性對照組；4.100bpDNA Ladder表1 FHIT基因過表達(dá)對MKN-45細(xì)胞增殖的影響（略）a：P<0.05。pcDNA3.1-FHIT轉(zhuǎn)染組與pcDNA3.1空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組和空白對照組相比差異

14、有顯著性圖2 FHIT基因過表達(dá)對MKN-45細(xì)胞增殖能力的影響（略）表2 FHIT基因過表達(dá)對MKN-45細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞粘附能力的影響（略）a.空白對照組； b.pcDNA3.1空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組； c.pcDNA3.1-FHIT轉(zhuǎn)染組圖3 FHIT基因過表達(dá)對MKN-45細(xì)胞增殖能力的影響（略）3 討論 Guo等4認(rèn)為FHIT基因與腫瘤細(xì)胞增殖及周期無關(guān)。但Pichiorri F等5認(rèn)為FHIT可通過依賴caspase途徑的凋亡而抑制細(xì)胞生長，Yoshihito N等6的研究認(rèn)為，F(xiàn)HIT基因可通過抑制IB-的磷酸化進(jìn)而阻斷NF-B信號通路而起到抑癌作用。FHIT的激活可通過調(diào)控細(xì)胞P53凋亡因

15、子的作用而影響腫瘤細(xì)胞增殖。我們將pcDNA3.1-FHIT轉(zhuǎn)染至FHIT基因mRNA陰性表達(dá)的人胃癌細(xì)胞系MKN-45，使其FHIT基因過表達(dá)后，MKN-45細(xì)胞生長曲線增長幅度較空白對照組及pcDNA3.1空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組低。實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示FHIT基因過表達(dá)可使MKN-45細(xì)胞的增殖活性受到抑制，這表明FHIT基因的表達(dá)水平可影響到胃癌細(xì)胞的增殖活性，該基因可能參與癌細(xì)胞增殖的負(fù)性調(diào)控。FHIT基因在體內(nèi)和體外均有抑制MEC-1細(xì)胞增殖和成瘤性的功能，可降低細(xì)胞的分化程度7。關(guān)于FHIT基因抑制腫瘤細(xì)胞增殖的機(jī)制，目前認(rèn)為FHIT基因主要通過其產(chǎn)物FHIT蛋白參與Ap3A的代謝及AMP2酶介導(dǎo)的

16、細(xì)胞信號形成，從而阻滯細(xì)胞增殖。Ren CC等8認(rèn)為 FHIT 蛋白是一種典型的二腺苷三磷酸(Ap3A)水解酶，能區(qū)域特異性地水解ApnA(n=3-6) 成為ADP和AMP。FHIT蛋白水解酶活性喪失導(dǎo)致Ap3A水平升高，Ap3A 是ATP的類似物，能抑制蛋白激酶的活性。Ap3A水平升高則增強(qiáng)了生長信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，阻斷抑制途徑和凋亡途徑，參與腫瘤的發(fā)生。也有研究認(rèn)為Ap3A是哺乳動物細(xì)胞中的一種第二信使，并可導(dǎo)致細(xì)胞周期的阻滯。但Wali A等9認(rèn)為FHIT蛋白的抑制腫瘤作用與Ap3A水解酶活性無關(guān)，而可能主要依賴FHIT蛋白與底物或其它相關(guān)接頭分子的結(jié)合。他們把突變型FHIT基因轉(zhuǎn)染到FHIT

17、缺陷的腫瘤細(xì)胞中，發(fā)現(xiàn)編碼產(chǎn)物雖無Ap3A水解酶活性，卻同樣能抑制腫瘤細(xì)胞在裸鼠體內(nèi)的成瘤作用。 克隆形成實(shí)驗(yàn)是測定單個(gè)細(xì)胞增殖能力的有效方法之一。通過計(jì)數(shù)克隆形成數(shù)，可了解細(xì)胞的增殖力和對生存環(huán)境的適應(yīng)能力。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示：FHIT基因過表達(dá)后，MKN-45細(xì)胞的平板克隆形成能力低于pcDNA3.1空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組和空白對照組（P均<0.05），而空白對照組和pcDNA3.1空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組間差異無顯著性。這表明FHIT基因可能對胃癌細(xì)胞系的克隆形成能力有一定的影響。 腫瘤轉(zhuǎn)移是一個(gè)多階段的復(fù)雜過程，粘附是腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移的始動因素。粘附導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞在脈管內(nèi)聚集及穿出管壁向遠(yuǎn)隔組織轉(zhuǎn)移。

18、腫瘤細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞間的粘附是其穿出脈管的第一步，主要通過腫瘤細(xì)胞上的整合素與內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)合。介導(dǎo)細(xì)胞與細(xì)胞、細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)（Extra celluar Matrix，ECM）間相互粘附的為細(xì)胞粘附分子（Cell adhesion Molecules，CAMs）。CAMs存在于細(xì)胞膜表面或ECM中的跨膜糖蛋白，它們通常以配體和受體相結(jié)合的方式而發(fā)揮作用。其基本功能是介導(dǎo)細(xì)胞粘附，同時(shí)參與細(xì)胞的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)與活化、細(xì)胞的生長及分化、炎癥、腫瘤轉(zhuǎn)移等一系列重要生理和病理過程。我們通過腫瘤細(xì)胞體外粘附實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，來檢測FHIT基因的轉(zhuǎn)染對人胃癌細(xì)胞系MKN-45細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞粘附能力的影響，結(jié)果顯示FHIT

19、基因過表達(dá)對于MKN-45與內(nèi)皮細(xì)胞的粘附能力沒有明顯的影響，F(xiàn)HIT基因可能通過別的途徑影響腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移。 綜上所述，我們將pcDNA3.1-FHIT轉(zhuǎn)染至FHIT基因陰性表達(dá)的MKN-45細(xì)胞使其過表達(dá)FHIT基因。比較轉(zhuǎn)染前后MKN-45細(xì)胞生物學(xué)行為的改變，結(jié)果顯示FHIT基因的過表達(dá)使得MKN-45細(xì)胞的增殖和克隆形成能力受抑制，提示FHIT基因在胃癌的發(fā)生、發(fā)展中起著一定的作用，但具體機(jī)制尚需進(jìn)一步研究。【參考文獻(xiàn)】 1 Cantor JP, Iliopoulos SD, Rao AS, et al. Epigenetic modulation of endogenous tum

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