基因工程制藥概述和要點

1、基因工程制藥概述和要點 第一節(jié)第一節(jié) 基因的概念與特性基因的概念與特性 一、基因的概念: : DNA分子中含有特定遺傳信息的一段分子中含有特定遺傳信息的一段核苷酸序列，是遺傳物質的最小功能單核苷酸序列，是遺傳物質的最小功能單位。位。 早期認為遺傳物質是蛋白質，早期認為遺傳物質是蛋白質，1944年年Avery從肺炎鏈球菌轉化實驗證明是從肺炎鏈球菌轉化實驗證明是DNA。二、基因的一般特性：二、基因的一般特性：基因可自我復制基因可自我復制基因決定蛋白質結構基因決定蛋白質結構基因可突變?；蚩赏蛔??；虬垂δ芊譃椋夯虬垂δ芊譃椋航Y構基因結構基因調控基因調控基因三、三、DNA的結構與性能的結構與性能

2、DNA的結構：四種核苷酸（的結構：四種核苷酸（A、T、 C、 G）連接。）連接。 DNA二級結構雙螺旋結構。二級結構雙螺旋結構。 DNA的性質與功能的性質與功能吸收光譜吸收光譜260電場中泳動電場中泳動變性、復性、雜交變性、復性、雜交 轉錄：在轉錄：在RNA聚合酶的催化下以聚合酶的催化下以DNA為模板合成為模板合成mRNA的過程。的過程。 轉錄后加工：轉錄后加工： 剪切：除去內含子剪切：除去內含子 加帽：加帽：5加加m7Gppp 加尾：加尾：3加加poly（A） 二、翻譯：以翻譯：以mRNA為模板，為模板，tRNA作為運載工具，將活化的氨基酸在作為運載工具，將活化的氨基酸在核糖體上合成蛋白質的

3、過程核糖體上合成蛋白質的過程。 分為三個階段：分為三個階段： 起始起始 延長延長 終止終止翻譯后的肽鏈加工翻譯后的肽鏈加工肽鏈切斷肽鏈切斷羥基化羥基化糖基化糖基化磷酸化磷酸化乙酰化乙?；?20 20世紀世紀7070年代基因工程誕生最先應用年代基因工程誕生最先應用在醫(yī)藥科學領域。在醫(yī)藥科學領域。 19821982年第一個基因工程產(chǎn)品年第一個基因工程產(chǎn)品-人胰島人胰島素在美國問世。素在美國問世。 優(yōu)點優(yōu)點: :大量生產(chǎn)、應用臨床、深入研大量生產(chǎn)、應用臨床、深入研究、擴大應用、改造不足、擴大了藥物究、擴大應用、改造不足、擴大了藥物篩選來源篩選來源 。l基因工程藥物和制劑很珍貴，用傳統(tǒng)方法很難基因工程

4、藥物和制劑很珍貴，用傳統(tǒng)方法很難生產(chǎn)，由于材料來源困難或制造技術問題而無生產(chǎn)，由于材料來源困難或制造技術問題而無法大量生產(chǎn)，但用基因工程可以得以解決。主法大量生產(chǎn)，但用基因工程可以得以解決。主要是醫(yī)用活性蛋白和多肽類：要是醫(yī)用活性蛋白和多肽類：（1 1）免疫性蛋白，如各種抗原和單克隆抗體）免疫性蛋白，如各種抗原和單克隆抗體（2 2）細胞因子，如各種干擾素、白細胞介素、）細胞因子，如各種干擾素、白細胞介素、表皮生長因子、凝血因子等表皮生長因子、凝血因子等（3 3）激素，如胰島素、生長激素、心鈉素等）激素，如胰島素、生長激素、心鈉素等（4 4）酶類，如尿激酶、鏈激酶、葡激酶、超氧）酶類，如尿激酶、

5、鏈激酶、葡激酶、超氧化物化物 歧化酶等歧化酶等利用基因工程技術生產(chǎn)藥品的優(yōu)點（利用基因工程技術生產(chǎn)藥品的優(yōu)點（1）：大量生產(chǎn)過去難以獲得的生理活性蛋白和多肽大量生產(chǎn)過去難以獲得的生理活性蛋白和多肽( (如胰島素、干擾素、細胞因子等如胰島素、干擾素、細胞因子等) )，為臨床使，為臨床使用提供有效的保障；用提供有效的保障；可以提供足夠數(shù)量的生理活性物質，以便對其可以提供足夠數(shù)量的生理活性物質，以便對其生理、生化和結構進行深入的研究，從而擴大生理、生化和結構進行深入的研究，從而擴大這些物質的應用范圍；這些物質的應用范圍；可以發(fā)現(xiàn)、挖掘更多的內源性生理活性物質；可以發(fā)現(xiàn)、挖掘更多的內源性生理活性物質；

6、內源生理活性物質在作為藥物使用時存在的不內源生理活性物質在作為藥物使用時存在的不足之處，可以通過基因工程和蛋白質工程進行足之處，可以通過基因工程和蛋白質工程進行改造和去除。如白細胞介素改造和去除。如白細胞介素-2-2的第的第125125位半胱位半胱氨酸是游離的，有可能引起氨酸是游離的，有可能引起S SS S鍵的錯配鍵的錯配而導致活性下降，如將此半胱氨酸改為絲氨酸而導致活性下降，如將此半胱氨酸改為絲氨酸或丙氨酸，白細胞介素或丙氨酸，白細胞介素-2-2的活性以及熱穩(wěn)定性的活性以及熱穩(wěn)定性均有提高。均有提高。利用基因工程技術可獲得新型化合物，擴大藥利用基因工程技術可獲得新型化合物，擴大藥物篩選來源。

7、物篩選來源。l國際上已進入臨床試驗的國際上已進入臨床試驗的抗腫瘤抗腫瘤重組導重組導向毒素向毒素l基因工程基因工程抗腫瘤藥物抗腫瘤藥物l目前進入臨床試驗的基因組重組目前進入臨床試驗的基因組重組抗血管抗血管生成藥物生成藥物l轉基因養(yǎng)殖動物轉基因養(yǎng)殖動物的乳汁產(chǎn)生的人生物醫(yī)的乳汁產(chǎn)生的人生物醫(yī)藥藥l轉基因植物轉基因植物生產(chǎn)的藥物蛋白生產(chǎn)的藥物蛋白l部分基因工程藥物簡介：部分基因工程藥物簡介：1、人胰島素、人胰島素(InsuIin)胰島素是多肽激素的一種，具有多種生理功能，胰島素是多肽激素的一種，具有多種生理功能，在維持血糖恒定，增加糖原、脂肪、某些氨基在維持血糖恒定，增加糖原、脂肪、某些氨基酸和蛋白

8、質的合成、調節(jié)與控制細胞內多種代酸和蛋白質的合成、調節(jié)與控制細胞內多種代謝途徑等方面都有重要作用。胰島素用于臨床謝途徑等方面都有重要作用。胰島素用于臨床糖尿病的醫(yī)治已有近糖尿病的醫(yī)治已有近70年的歷史，長期以來，年的歷史，長期以來，其來源僅僅是從動物的胰臟中提取，而動物胰其來源僅僅是從動物的胰臟中提取，而動物胰島素與人胰島素在氨基酸組成上存有一定的差島素與人胰島素在氨基酸組成上存有一定的差異，長期注射人體時會產(chǎn)生自身免疫反應，影異，長期注射人體時會產(chǎn)生自身免疫反應，影響治療效果。自響治療效果。自80年代初開始，人們已開始用年代初開始，人們已開始用基因工程技術大量生產(chǎn)人胰島素?；蚬こ碳夹g大量生

9、產(chǎn)人胰島素。l人胰島素的基因工程生產(chǎn)一般采用兩種人胰島素的基因工程生產(chǎn)一般采用兩種方式：一是分別在大腸桿菌中合成方式：一是分別在大腸桿菌中合成A鏈和鏈和B鏈，再在體外用化學方法連接兩條肽鏈鏈，再在體外用化學方法連接兩條肽鏈組成胰島素。美國組成胰島素。美國EIi Lilly公司采用該法公司采用該法生產(chǎn)的重組人胰島素生產(chǎn)的重組人胰島素Humulin最早獲準最早獲準商品化；商品化；l另一種方法是用分泌型載體表達胰島素另一種方法是用分泌型載體表達胰島素原，如丹麥原，如丹麥Novo Nordisk公司用重組酵公司用重組酵母分泌產(chǎn)生胰島素原，再用酶法轉化為母分泌產(chǎn)生胰島素原，再用酶法轉化為人胰島素。人胰島

10、素。對胰島素的改造對胰島素的改造lNovo Nordisk研究所的研究所的Brange等應用蛋等應用蛋白質工程技術在胰島素分子中取代一個白質工程技術在胰島素分子中取代一個氨基酸殘基，防止單體二聚化，由此合氨基酸殘基，防止單體二聚化，由此合成的新型胰島素在藥物濃度下基本上保成的新型胰島素在藥物濃度下基本上保持單體，注射后吸收速度比正常胰島素持單體，注射后吸收速度比正常胰島素快快2-3倍；另有報道將胰島素倍；另有報道將胰島素B鏈第鏈第10位位的的His變?yōu)樽優(yōu)锳sp獲得高活力胰島素獲得高活力胰島素B10Asp，其受體結合能力和離體生物活力分別為其受體結合能力和離體生物活力分別為豬胰島素的豬胰島素的

11、262和和235。 2人生長激素人生長激素(Human growth hormone，hGH)l人生長激素是人的垂體腺前葉嗜酸細胞人生長激素是人的垂體腺前葉嗜酸細胞分泌的一種非糖基化多肽激素。它有多分泌的一種非糖基化多肽激素。它有多種生物功能，主要是刺激身體生長。最種生物功能，主要是刺激身體生長。最近發(fā)現(xiàn)近發(fā)現(xiàn)hGH對一些細胞的增殖和分化以對一些細胞的增殖和分化以及及DNA合成有直接效應。合成有直接效應。hGH的主要用的主要用途是治療誅儒癥，臨床試驗認為途是治療誅儒癥，臨床試驗認為hGH對對慢性腎功能衰竭和慢性腎功能衰竭和Turner綜合癥也有很綜合癥也有很好療效。好療效。l美國的美國的Gen

12、entech公司采用枯草芽泡桿菌系統(tǒng)公司采用枯草芽泡桿菌系統(tǒng)表達表達hGH，產(chǎn)量達，于，產(chǎn)量達，于1985年年10月批準上市，月批準上市，商品名稱為商品名稱為Prptropin(hGH)。1994年年3月又有月又有新產(chǎn)品新產(chǎn)品Nutyopin被批準上市。英國被批準上市。英國Cell teck公公司用哺乳動物細胞生產(chǎn)的司用哺乳動物細胞生產(chǎn)的hGH，比從垂體中提，比從垂體中提純的天然純的天然hGH多一個蛋氨酸，其治療效果更為多一個蛋氨酸，其治療效果更為顯著。我國用和哺乳動物細胞表達顯著。我國用和哺乳動物細胞表達hGH，1995年開始進行臨床試驗做完臨床試驗后有兩家年開始進行臨床試驗做完臨床試驗后有

13、兩家公司進行工業(yè)化生產(chǎn)。公司進行工業(yè)化生產(chǎn)。 3、干擾素、干擾素(Interferon，IFN)干擾素是一類在同種細胞上具有廣譜抗病干擾素是一類在同種細胞上具有廣譜抗病毒活性的蛋白質，其活性的發(fā)揮又受細毒活性的蛋白質，其活性的發(fā)揮又受細胞基因組的調節(jié)和控制，涉及胞基因組的調節(jié)和控制，涉及RNA和蛋和蛋白質的合成。干擾素是一種類似多肽激白質的合成。干擾素是一種類似多肽激素的細胞功能調節(jié)物質，是一種細胞素。素的細胞功能調節(jié)物質，是一種細胞素。其定義包括如以下含義：其定義包括如以下含義：(1)干擾素必須是一種蛋白質；干擾素必須是一種蛋白質；(2)在一般生理狀態(tài)下，細胞的干擾素基因在一般生理狀態(tài)下，細

14、胞的干擾素基因呈靜止狀態(tài)，只有在特定誘生劑作用下呈靜止狀態(tài)，只有在特定誘生劑作用下進行轉錄并轉譯出具有種屬特異性的干進行轉錄并轉譯出具有種屬特異性的干擾素；擾素；(3)干擾素本身不能直接滅活病毒，而是細干擾素本身不能直接滅活病毒，而是細胞在干擾素作用后產(chǎn)生出多種抗病毒蛋胞在干擾素作用后產(chǎn)生出多種抗病毒蛋白。從而阻斷病毒的繁殖；白。從而阻斷病毒的繁殖；(4)干擾素必須具有廣譜抗病毒活性。干擾素必須具有廣譜抗病毒活性。l 根據(jù)抗原特異性和分子結構的不同，干擾素可根據(jù)抗原特異性和分子結構的不同，干擾素可分為分為、三型。干擾素的基本特性包括種三型。干擾素的基本特性包括種屬特異性、作用屬特異性、作用“廣

15、譜性和選擇性廣譜性和選擇性”、相對無、相對無害性和特殊穩(wěn)定性等。干擾素的生物功能活性害性和特殊穩(wěn)定性等。干擾素的生物功能活性可歸納為：可歸納為：(1)抗細胞內侵害微生物活性，抗細胞內侵害微生物活性，(2)抗細胞分裂活性，抗細胞分裂活性，(3)調節(jié)免疫功能活性。干擾調節(jié)免疫功能活性。干擾素在臨床上主要用于治療惡性腫瘤和病毒性疾素在臨床上主要用于治療惡性腫瘤和病毒性疾病。病。l我國衛(wèi)生部已批準生產(chǎn)的干擾素品種有：我國衛(wèi)生部已批準生產(chǎn)的干擾素品種有：IFN1b、IFN2a、IFN2b和和IFNr四種。四種。 4白細胞介素白細胞介素(Interleukin, IL)白細胞介素是由白細胞或其他體細胞產(chǎn)生

16、白細胞介素是由白細胞或其他體細胞產(chǎn)生的又在白細胞間起調節(jié)作用和介導作用的又在白細胞間起調節(jié)作用和介導作用的因子，是一類重要的免疫調節(jié)劑。目的因子，是一類重要的免疫調節(jié)劑。目前已發(fā)現(xiàn)的白細胞介素已達前已發(fā)現(xiàn)的白細胞介素已達15種之多，種之多，它們的生物學功能十分廣泛主要功能它們的生物學功能十分廣泛主要功能有：有：(1)激活并刺激激活并刺激T、B淋巴細胞的增殖和分化；淋巴細胞的增殖和分化；(2)刺激巨噬細胞和粒細胞的活性；刺激巨噬細胞和粒細胞的活性；(3)作為各種細胞的絲裂原；作為各種細胞的絲裂原；(4)其他功能其他功能(抗腫瘤作用、誘導發(fā)熱、作為佐劑抗腫瘤作用、誘導發(fā)熱、作為佐劑等等)。白細胞介

17、素在臨床上主要用于治療惡性腫瘤和病白細胞介素在臨床上主要用于治療惡性腫瘤和病毒性疾病毒性疾病(如乙型肝炎、艾滋病等如乙型肝炎、艾滋病等)。l隨著分子生物學的進展，各種白細胞介素的基隨著分子生物學的進展，各種白細胞介素的基因也相繼克隆成功，并制成基因工程白細胞介因也相繼克隆成功，并制成基因工程白細胞介素純品，其中有幾種已投放市場。同內素純品，其中有幾種已投放市場。同內IL-2已已批準生產(chǎn)，批準生產(chǎn)，IL-3、IL-4和和IL-6等其他白細胞介等其他白細胞介素也正在研制中。應用蛋白質工程技術在素也正在研制中。應用蛋白質工程技術在IL-2中中125位位Cys分別由分別由Ser或或Ala取代，制成生物

18、活取代，制成生物活性、熱穩(wěn)定性和復性效果都比原性、熱穩(wěn)定性和復性效果都比原IL-2強的新型強的新型IL-2(125Ser-IL-2和和125Ala-IL-2)，現(xiàn)己獲準臨，現(xiàn)己獲準臨床應用。床應用。5. 集落刺激因子集落刺激因子(Colony stimuLating factor, CSF)集落刺激因子集落刺激因子(CSF)是一類能參與造血調節(jié)過程是一類能參與造血調節(jié)過程的糖蛋白分子，故又稱造血刺激因子或造血的糖蛋白分子，故又稱造血刺激因子或造血生長因子。生長因子。 CSF的功能可概括為：刺激造血的功能可概括為：刺激造血細胞增殖、維系細胞存活、分化定型、刺激細胞增殖、維系細胞存活、分化定型、刺

19、激終末細胞的功能活性等。近年來的研究表明，終末細胞的功能活性等。近年來的研究表明，CSF還參與對成熟細胞的功能調節(jié)，并在宿還參與對成熟細胞的功能調節(jié)，并在宿主抗感染免疫中起著重要作用。主抗感染免疫中起著重要作用?，F(xiàn)在已知的集落刺激因子現(xiàn)在已知的集落刺激因子(CSF)主要有主要有4種：種：(1)粒粒細胞集落刺激因子細胞集落刺激因子(G-CSF)；(2)巨噬細胞集落巨噬細胞集落刺激因子刺激因子(M-CSF)；(3)粒細胞粒細胞巨噬細胞集落巨噬細胞集落刺激因子刺激因子GM-C3F)；(4)多能集落刺激因子多能集落刺激因子(Multi-CSF，即，即IL-3)。上述。上述4種種CSF在注入人在注入人體

20、后均有促使各類白細胞增殖和成熟、增加血體后均有促使各類白細胞增殖和成熟、增加血小板和紅細胞數(shù)量的作用，因此小板和紅細胞數(shù)量的作用，因此CSF在臨床上在臨床上多用作癌化療的輔佐藥物，如化療后產(chǎn)生的中多用作癌化療的輔佐藥物，如化療后產(chǎn)生的中性白細胞減少癥，也用于骨髓移植促進生血作性白細胞減少癥，也用于骨髓移植促進生血作用，還可用于治療白血病、粒細胞缺乏癥、再用，還可用于治療白血病、粒細胞缺乏癥、再生障礙貧血等多種疾病。生障礙貧血等多種疾病。6腫瘤壞死因子腫瘤壞死因子(Tumor necrosis factor，TNF)腫瘤壞死因子這一名稱是因最初發(fā)現(xiàn)時觀察到它腫瘤壞死因子這一名稱是因最初發(fā)現(xiàn)時觀察

21、到它的抗腫瘤活性而命名的。隨著人們對的抗腫瘤活性而命名的。隨著人們對TNF的深的深入研究，該名稱已不再能反映其全部的生物活入研究，該名稱已不再能反映其全部的生物活性。性。TNF除具有抗腫瘤活性外對多種正常細除具有抗腫瘤活性外對多種正常細胞還具有廣泛的免疫生物學活性，如炎癥活性，胞還具有廣泛的免疫生物學活性，如炎癥活性，促凝血活性，促進細胞因子分泌，免疫調節(jié)作促凝血活性，促進細胞因子分泌，免疫調節(jié)作用，抗病毒、細菌和真菌作用，熱原質作用以用，抗病毒、細菌和真菌作用，熱原質作用以及參與骨質重吸收等。及參與骨質重吸收等。1)主要由激活巨噬細胞產(chǎn)生的主要由激活巨噬細胞產(chǎn)生的TNF-；(2)主要由激活淋

22、巴細胞產(chǎn)生的主要由激活淋巴細胞產(chǎn)生的INF-，又名淋巴，又名淋巴細胞毒素細胞毒素(LT)；(3)由由NK細胞產(chǎn)生的細胞毒因子細胞產(chǎn)生的細胞毒因子TNF-。(NK細胞是天然免疫系統(tǒng)的主要效應細胞，具有廣泛的細胞是天然免疫系統(tǒng)的主要效應細胞，具有廣泛的生物學功能，位于機體抵抗腫瘤和病毒感染的第一道生物學功能，位于機體抵抗腫瘤和病毒感染的第一道防線。防線。NK細胞作為天然免疫的主要效應細胞，在感染細胞作為天然免疫的主要效應細胞，在感染性疾病的防治、腫瘤的生物治療以及骨髓移植中發(fā)揮性疾病的防治、腫瘤的生物治療以及骨髓移植中發(fā)揮了不可替代的作用。皮膚黏膜組織是機體的重要免疫了不可替代的作用。皮膚黏膜組織

23、是機體的重要免疫器官之一，是阻擋病原微生物入侵的天然屏障，而器官之一，是阻擋病原微生物入侵的天然屏障，而NK細胞是這一屏障的主要效應細胞之一。細胞是這一屏障的主要效應細胞之一。 )l1984年基因重組年基因重組TNF獲得成功后，獲得成功后，1985年即獲美國年即獲美國FDA批準用于臨床，在治療批準用于臨床，在治療某些感性腫瘤上收到較好的效果。此外，某些感性腫瘤上收到較好的效果。此外，TNF在臨床診斷上也有一定意義。但天在臨床診斷上也有一定意義。但天然然TNF有一定毒副反應。國內有一定毒副反應。國內1989年首年首次報道組建高表達人次報道組建高表達人TNF工程菌株。并工程菌株。并通過鑒定，重在研

24、究通過鑒定，重在研究TNF的衍生物，以的衍生物，以提高比活性和減少毒副作用。提高比活性和減少毒副作用。目前，用蛋白質工程技術研制目前，用蛋白質工程技術研制TNF突突變體主要有：變體主要有：(1)將原型將原型TNF分子中第分子中第80、90和和92位的位的Ile、Lys和和Asn分別被分別被Ser、His和和Val置換，經(jīng)置換，經(jīng)E. coli表達產(chǎn)生表達產(chǎn)生rhTNFD3a產(chǎn)物，毒性產(chǎn)物，毒性比原型比原型TNF低低11倍左右；倍左右；(2)將將TNFN末端的第末端的第2位位Arg換成換成Lys，在及在及E. coli中表達中表達TNFK2產(chǎn)物，對某些產(chǎn)物，對某些人腫瘤細胞株表現(xiàn)出比人腫瘤細胞株

25、表現(xiàn)出比TNP高出幾十高出幾十倍到幾百倍的抑制活性，且毒性稍低；倍到幾百倍的抑制活性，且毒性稍低；(3)在在TNF分子的末端缺分子的末端缺7個氨基酸，個氨基酸，8、9、10和和C端端157位氨基酸分別被位氨基酸分別被ArgLysArg和和Phe取代，在取代，在E. coli 中表達中表達TNF mutant protein產(chǎn)物，生物活性比天然的產(chǎn)物，生物活性比天然的提高提高10倍，可降低用藥量，減低其毒副倍，可降低用藥量，減低其毒副作用，且產(chǎn)物以可溶形式存在，易于純作用，且產(chǎn)物以可溶形式存在，易于純化?；?。7心鈉素心鈉素(Atrial natriurctic factor ANF或或ANP)心

26、鈉素是心房利鈉因子。由于其化學結構屬于一心鈉素是心房利鈉因子。由于其化學結構屬于一種多肽，故又稱心房肽種多肽，故又稱心房肽(ANP)。心鈉素具有較。心鈉素具有較強的利鈉、利尿、擴張血管和降低血壓的作用。強的利鈉、利尿、擴張血管和降低血壓的作用。在調節(jié)體液容量和濃度、控制血壓、維持體液在調節(jié)體液容量和濃度、控制血壓、維持體液平衡方面起著重要作用、可作為降血壓藥和利平衡方面起著重要作用、可作為降血壓藥和利尿藥，用于治療充血性心臟衰竭、高血壓、腎尿藥，用于治療充血性心臟衰竭、高血壓、腎功能衰竭、水腫和氣喘等疾病。功能衰竭、水腫和氣喘等疾病。人的心鈉素基因人的心鈉素基因(化學合成化學合成)已先后在大腸已先后在大腸桿菌、酵母菌和哺乳動物細胞中得到表桿菌、酵母菌和哺乳動物細胞中得到表達。達。1986年年VlasukIs等已將化學合成等已將化學合成的人心鈉素的人心