酶促反應動力學實驗

1、精選優(yōu)質文檔-傾情為你奉上實驗 酶促反應動力學蔗糖酶米氏常數(shù)的測【目的要求】1了解酶促動力學研究的范圍。2以蔗糖酶為例，掌握測定米氏常數(shù)(Km)【實驗原理】 在酶促反應中，當反應體系的溫度、pH和酶濃度恒定時，反應初速度(v)則隨底物濃度S的增加而加速，最后達到極限，稱為最大反應速度(v)。Michaelis和Menten根據(jù)反應速度與底物濃度的這種關系，推導出如下方程： 此式稱為米氏方程，式中Km稱為米氏常數(shù)，按此方程，可用作圖法求出Km。方法有：1以vS作圖 由米氏方程可知，v=V2時，KmS即米氏常數(shù)值等于反應速度達到最大反應速度一半時所需底物濃度。因此，可測定一系列不同底物濃度的反應速

2、度v,以v對S作圖。當vV2時，其相應底物濃度即為Km。2以1v對1S作圖 取米氏方程的倒數(shù)式： 以1v對1S作圖可得一直線，其斜率為KmV，截距為1/V。若將直線延長與橫軸相交，則該交點在數(shù)值上等于lKm。本實驗以蔗糖為底物利用一定量蔗糖酶水解不同濃度蔗糖所形成的產(chǎn)物(葡萄糖和果糖)的量來計算蔗糖酶的Km值。葡萄糖和果糖能與3，5二硝基水楊酸試劑反應，生成桔紅色化合物，可于520nm處比色測定之?！驹囼灢牧稀?試劑(1)標準葡萄糖溶液：準確稱取100mg葡萄糖溶于少量飽和的苯甲酸溶液(0.3%)，再轉移到100ml容量瓶中，用飽和苯甲酸溶液稀釋到刻度，混勻，即得濃度為1mgm1的標準葡萄糖溶

3、液。冰箱貯藏可長期保存；(2)pH4.5的0.1mol/L醋酸緩沖液：取lmol/L醋酸鈉溶液43m1及l(fā)molL醋酸溶液57m1，稀釋至1000m1即得；(3)pH4.5的10蔗糖溶液：準確取l0g蔗糖溶于少量pH4.5的0.1molL醋酸緩沖液，轉移到100ml容量瓶中，用同樣緩沖液稀釋到刻度備用；(4)3，5二硝基水楊酸試劑：溶液I：4.5NaOH溶液300m1，13，5一二硝基水楊酸溶液880m1及酒石酸鉀鈉(KNaC4O64H20)255g三者一起混合均勻。溶液：取結晶酚10g及l(fā)oNaOH溶液22m1，加蒸餾水稀釋成100ml，混勻。溶液：取6.9gNaHSO3溶于64ml溶液n中

4、。將溶液皿和溶液I混合，激烈振搖混勻，即得3，5二硝基水楊酸溶液，放置一周后備用。(5)酵母蔗糖酶溶液：稱取鮮酵母l0g于研缽中，加少量細砂及10一15ml蒸餾水研磨。磨細后置冰箱中，過濾，濾液加23倍體積冷丙酮，攪拌均勻后離心，沉淀用丙酮洗兩次，真空干燥得固體粉末狀酶，再溶于100ml蒸餾水，即得酶溶液。若有不溶物可用離心法除去。該酶液活力以612單位為佳。蔗糖酶活力單位的定義為：在一定條件下反應5min，每產(chǎn)生lmg葡萄糖所需要的酶量。備用。2器材(1)100m1三角燒瓶2只；(2)研缽1只；(3)50m1及100m1容量瓶各1只；(4)離心機1臺(4000rpm)；(5)糖管8支；(6)

5、恒溫水浴1臺；(7)吸量管：1.0ml2支；(8)秒表1只；(9)72l型分光光度計1臺?！緦嶒灧椒ā?標準曲線的繪制取干凈糖管6支，如下表所示添加試劑。 管號試劑 0 1 2 3 4 5標準葡萄糖溶液, ml蒸餾水 ， ml3，5二硝基水楊酸液， ml 02.0 3.0 0.21.83.0 0.4 1.6 3.0 0.6 1.4 3.0 0.8 1.2 3.0 1.0 1.0 3.0加畢混勻于沸水中準確煮5min，取出用自來水冷卻3min，稀釋至25ml，混勻后以零號管調零點，于520nm處測定吸光度。以葡萄糖含量為橫坐標，以吸光度為縱坐標作圖。2根據(jù)活力選擇酶濃度 將10蔗糖溶液稀釋成pH

6、4.5的6.5的溶液，取此溶液5m1于試管中，共加兩管。將兩管同時置于25水浴中保溫5min，然后向管中加入蔗糖酶溶液1.0ml，立即混勻，同時用秒表計時，準確反應5min后，立即加入5ml0.1mol/LNaOH溶液終止酶反應。另一管先加入5.0ml0.11mol/LNaOH溶液，再加入蔗糖酶溶液1.0ml(此為對照管)。取干凈糖管3支，第l、2管分別加入上述反應液各1.0ml及水各1.0m1，第3管加蒸餾水2.0ml，然后各管均加3.0ml二硝基水楊酸溶液。置沸水浴中煮5min，取出后經(jīng)自來水冷卻3min，加水至25m1，混勻，以第3管調零點，于520nm處測吸光度值。以測定管的吸光度值減

7、去對照管吸光度值，求得的差值從標準曲線上查得相應的葡萄糖含量，并乘以ll，即為每1ml酶溶液的活力。測定管中因酶催化水解而產(chǎn)生的葡萄糖含量以在0.41.6mg之間為佳，過高或過低均應適當改變蔗糖酶溶液的濃度或反應液用量后再測。3底物濃度對酶促反應速度的影響米氏常數(shù)購測定 取試管7支，按下表所示加入試劑。當加完蔗糖溶液及pH4.5醋酸緩沖液后，均放置室溫或恒溫水浴(20或25)保溫5min，再分別依次向各管加入蔗糖酶溶液1.0ml，立即搖勻記錄時間。準確反應5min，再準時加入0.1mol/L的NaOH溶液，立即搖勻，以終止反應。 測定管反應完成后，取8支潔凈糖管，前7支分別加入相應的上述反應液

8、各1.0ml及蒸餾水各1.0ml，第8支糖管加入2.0ml蒸餾水作空白，然后各管均加入3.0ml二硝基水楊酸溶液，沸水浴5min。取出用自來水冷卻3min，稀釋到25m1，混勻，于520nm處比色測定并記錄吸光度值。對照管的測定與測定管的操作相同?！窘Y果處理】根據(jù)各測定管的吸光度值(需減去相應對照管的吸光度值)，從標準曲線上查出相應的還原糖毫克數(shù)(以在04一16mg范圍內為佳，否則應調整反應液用量后重新測定)，再乘以11，即得各管的產(chǎn)物量，然后分別計算各反應管相應的S、lS、v及1/v，并作出vS及1/v1S曲線。再根據(jù)所作的兩種動力學曲線，分別求出酵母蔗糖酶的Km值，并加以比較。上述數(shù)據(jù)可記

9、錄在下表中。 酵母蔗糖酶的提取實驗原理：蔗糖酶主要存在于酵母中，但工業(yè)上通常從酵母中制取。酵母蔗糖酶系胞內酶，提取時細胞破碎或菌體自溶。常用的提純方法有鹽析、有機溶劑沉淀、離子交換和凝膠柱層析。以此可得到較高純度的酶。細胞破壁的幾種方法1、高速組織搗碎：將材料配成稀糊狀液，放置于筒內約1/3體積，蓋緊筒蓋，將調速器先撥至最慢處，開動開關后，逐步加速至所需速度。2、玻璃勻漿器勻漿：先將剪碎的組織置于管中，再套入研桿來回研磨，上下移動，即可將細胞研碎，此法細胞破碎程度比高速組織搗碎機為高，適用于量少和動物臟器組織。3、反復凍融法：將細胞在-20度以下冰凍，室溫融解，反復幾次，由于細胞內冰粒形成和剩

10、余細胞液的鹽濃度增高引起溶脹，使細胞結構破碎。4、超聲波處理法：用一定功率的超聲波處理細胞懸液，使細胞急劇震蕩破裂，此法多適用于微生物材料。5、化學處理法：有些動物細胞，例如腫瘤細胞可采用十二烷基磺酸鈉（SDS）、去氧膽酸鈉等細胞膜破壞，細菌細胞壁較厚，可采用溶菌酶處理效果更好。有機溶劑沉淀法即向水溶液中加入一定量的親水性的有機溶劑可降低溶質的溶解度使其沉淀被析出。三、試劑： 啤酒酵母 、 二氧化硅 、甲苯（使用前預冷到0以下）、去離子水（使用前冷至4左右）、1mol / L 醋酸 、95%乙醇四、儀器：研缽1個、離心管3個 、 3. 滴管3個、量筒50ml 1個、水浴鍋1個、恒溫水浴、燒杯100ml 2個、廣泛pH試紙、高速冷凍離心機四、操作步驟：1. 提取 （1）準備一個冰浴，將研缽穩(wěn)妥放入冰浴中。預先在冰箱中冷卻20g干酵母和10g二氧化硅。（2）將20g干酵母粉和10g二氧化硅，放入研缽中。量取預冷的甲苯30ml緩慢加入酵母中，邊加邊研磨成糊狀，約需60分鐘。研磨時用顯微鏡檢查研磨的效果，至酵母細胞大部分研碎。（3）緩慢加入預冷的40ml去離子水，每次加2ml左右，邊加邊研磨，至少用30分鐘。以便將蔗糖酶充分轉入水相。（4）將混合物轉入兩個離心管中，平衡后，用高速冷離心機離心，4，10000rpm，10min。如果中間白色的脂肪層厚，說明研