固定化酶制備及應(yīng)用的研究進(jìn)展

1、固定化酶制備及應(yīng)用的研究進(jìn)展摘要：本文主要從分析酶單獨(dú)應(yīng)用中的不足、酶的固定化載體、固定化方法等方面介紹了固定化酶制備中的研究進(jìn)展情況，并且從醫(yī)藥、食品、環(huán)保、化學(xué)工業(yè)、能源等方面其在其中的新應(yīng)用出發(fā)，對(duì)固定化酶在新領(lǐng)域中的應(yīng)用作了綜述，給固定化酶研究的發(fā)展前景進(jìn)行了展望，并且指出了今后酶固定化研究的主要方向是多酶的固定化及制備高活性、高負(fù)載、高穩(wěn)定性的固定化酶。關(guān)鍵字：酶；酶的固定化；載體；酶固定化應(yīng)用領(lǐng)域酶是重要的生物催化劑，具有專一性強(qiáng)、催化效率高、無(wú)污染、反應(yīng)條件溫和等特點(diǎn)，在制藥、食品、環(huán)保、釀造、能源等領(lǐng)域都得到了廣泛的應(yīng)用。但在實(shí)際應(yīng)用中，酶也存在許多不足，如大多數(shù)的酶在高溫、強(qiáng)

2、酸、強(qiáng)堿和重金屬離子等外界因素影響下，都容易變性失活，不夠穩(wěn)定；與底物和產(chǎn)物混在一起，反應(yīng)結(jié)束后，即使酶仍有很高的活力，也難于回收利用，這種一次性使用酶的方式，不僅使生產(chǎn)成本提高，而且難于連續(xù)化生產(chǎn)；并且分離純化困難，也會(huì)導(dǎo)致生產(chǎn)成本的提高等。固定化酶（immobilizedenzyme）這個(gè)術(shù)語(yǔ)是在1971 年酶工程會(huì)議上被推薦使用的。隨著固定化技術(shù)的發(fā)展，出現(xiàn)固定化菌體。1973年，日本首次在工業(yè)上應(yīng)用固定化大腸桿菌菌體中的天門冬氨酸酶，由反丁烯二酸連續(xù)生產(chǎn)L-天門冬氨酸。固定化酶技術(shù)為這些問(wèn)題的解決提供了有效的手段，從而成為酶工程領(lǐng)域中最為活躍的研究方向之一。本文將從酶生物催化劑固定化載

3、體、固定化方法和技術(shù)及固定化酶的應(yīng)用等幾個(gè)方面出發(fā)，歸納和綜述這些方面近年來(lái)的研究進(jìn)展。1酶固定化的傳統(tǒng)方法關(guān)鍵在于選擇適當(dāng)?shù)墓潭ɑ椒ê捅匾妮d體以及穩(wěn)定性研究、改進(jìn)。 1.1 吸附法吸附法是利用物理吸附法，將酶固定在纖維素、瓊脂糖等多糖類或多孔玻璃、離子交換樹(shù)脂等載體上的固定方式。顯著特點(diǎn)是：工藝簡(jiǎn)便及條件溫和，包括無(wú)機(jī)、有機(jī)高分子材料，吸附過(guò)程可同時(shí)達(dá)到純化和固定化；酶失活后可重新活化，載體也可再生。但要求載體的比表面積要求較大，有活潑的表面。1.2 包埋法包埋固定化法是把酶固定聚合物材料的格子結(jié)構(gòu)或微囊結(jié)構(gòu)等多空載體中，而底物仍能滲入格子或微囊內(nèi)與酶相接觸。這個(gè)方法比較簡(jiǎn)便，酶分子僅僅

4、是被包埋起來(lái)，生物活性被破壞的程度低，但此法對(duì)大分子底物不適用。1) 網(wǎng)格型將酶或包埋在凝膠細(xì)微網(wǎng)格中，制成一定形狀的固定化酶，稱為網(wǎng)格型包埋法。也稱為凝膠包埋法。2) 微囊型把酶包埋在由高分子聚合物制成的小球內(nèi)，制成固定化酶。由于形成的酶小球直徑一般只有幾微米至幾百微米，所以也稱為微囊化法。1.3 結(jié)合法酶蛋白分子上與不溶性固相支持物表面上通過(guò)離子鍵結(jié)合而使酶固定的方法，叫離子鍵結(jié)合法。其間形成化學(xué)共價(jià)鍵結(jié)合的固定化方法叫共價(jià)鍵結(jié)合法。共價(jià)鍵結(jié)合法結(jié)合力牢固，使用過(guò)程中不易發(fā)生酶的脫落，穩(wěn)定性能好。該法的缺點(diǎn)是載體的活化或固定化操作比較復(fù)雜，反應(yīng)條件也比較強(qiáng)烈，所以往往需要嚴(yán)格控制條件才能獲

5、得活力較高的固定化酶。1.4 交聯(lián)法交聯(lián)法是用多功能試劑進(jìn)行酶蛋白之間的交聯(lián)，使酶分子和多功能試劑之間形成共價(jià)鍵，得到三向的交聯(lián)網(wǎng)架結(jié)構(gòu)，除了酶分子之間發(fā)生交聯(lián)外，還存在著一定的分子內(nèi)交聯(lián)。多功能試劑制備固定化酶方法可分為：( 1) 單獨(dú)與酶作用；( 2) 酶吸附在載體表面上再經(jīng)受交聯(lián)；( 3) 多功能團(tuán)試劑與載體反應(yīng)得到有功能團(tuán)的載體，再連接酶。交聯(lián)劑的種類很多，最常用的是戊二醛，其他的還有異氰酸衍生物、雙偶氮二聯(lián)苯胺、N，N-乙烯馬來(lái)酰亞胺等。交聯(lián)法的優(yōu)點(diǎn)是酶與載體結(jié)合牢固，穩(wěn)定性較高；缺點(diǎn)是有的方法固定化操作較復(fù)雜，進(jìn)行化學(xué)修飾時(shí)易造成酶失活。各類固定化方法的特點(diǎn)比較:比較項(xiàng)目吸附法結(jié)合

6、法交聯(lián)法包埋法物理化學(xué)方法分類物理吸附化學(xué)共價(jià)鍵結(jié)合物理離子鍵結(jié)合化學(xué)鍵連接物理包埋制備難易易難易較難較難固定化程度弱強(qiáng)中等強(qiáng)強(qiáng)活力回收率較高低高中等高載體再生可能不可能可能不可能不可能費(fèi)用低高低中等低底物專一性不變可變不變可變不變適用性酶源多較廣廣泛較廣小分子底物、藥用酶2固定化載體的要求固定化酶載體應(yīng)具備以下要求大體上有1：1) 在酶催化反應(yīng)過(guò)程的惰性：載體應(yīng)不與底物、產(chǎn)物及介質(zhì)發(fā)生反應(yīng)。2) 有良好的滲透性：制備成柱子后，能使底物和產(chǎn)物能快速通過(guò)減少吸附。3) 有生物親和性和相容性，有利于酶活力發(fā)揮和穩(wěn)定。4) 有較高酶負(fù)載量，載體表面能提供多個(gè)活性位點(diǎn)利于酶分子偶聯(lián)。3新型固定化技術(shù)傳

7、統(tǒng)酶的固定化方法雖在一定程度上可以增強(qiáng)生物催化劑的穩(wěn)定性，但增強(qiáng)幅度有待進(jìn)一步提高，并且在此過(guò)程中，生物催化劑酶催化活力通常損失嚴(yán)重。運(yùn)用當(dāng)代高新技術(shù)和設(shè)計(jì)合成新型載體以及兩者的有機(jī)結(jié)合是引人注目的研究動(dòng)向。因此目前不斷地有新的載體和技術(shù)引入每的固定化領(lǐng)域，如：無(wú)載體固定化、微波/超聲輔助的固定化、陽(yáng)光照射、離子液體，電輔助固定化等等，且固定化生物催化劑的應(yīng)用也越來(lái)越廣泛地應(yīng)用于醫(yī)療、生物醫(yī)藥、環(huán)境保護(hù)、食品工業(yè)、化學(xué)工業(yè)、能源領(lǐng)域等。121.2.3.3.1. 酶固定化過(guò)程中的新載體1.2.3.3.1.3.1.1 介孔材料孔道的結(jié)構(gòu)和尺寸對(duì)酶活力及穩(wěn)定性有著明顯的影響，合適的孔道中酶固定化后其

8、活力提高到游離酶的2倍，且三維及大孔道有利于固定化與催化過(guò)程中酶蛋白和底物、產(chǎn)物的傳輸，從而能提高酶的固定化和催化效果2。目前，大孔道、高比表面和孔容的新型介孔材料不斷被引入酶固定化領(lǐng)域，因?yàn)榇罂椎?、高比表面、高孔容的介孔材料中酶的?fù)載量大（圖3），且酶的負(fù)載能快速完成，負(fù)載量顯著提高。圖3 孔道大的酶介孔材料的酶負(fù)載量大明顯提高3.1.2 納米管碳納米管( carbon nanotube，CNT)是由Iijima于1991年發(fā)現(xiàn)的一種新型納米材料。它是由石墨片層卷曲而成的無(wú)縫納米管3。將生物分子，如氨基酸、蛋白質(zhì)、酶、DNA 等結(jié)合在碳納米管表面或端口上，可提高它在水溶液中的溶解度，為實(shí)現(xiàn)碳

9、納米管的各種生物應(yīng)用奠定基礎(chǔ)4。納米管的內(nèi)表面能夠與酶之間存在強(qiáng)烈的相互作用，從而使得管內(nèi)酶蛋白結(jié)構(gòu)穩(wěn)定且保留相當(dāng)?shù)拇呋盍?，并且用其制成電極能夠有效實(shí)現(xiàn)底物氧化及電子的傳遞5。硅納米管用于固定化酶時(shí)，能夠保持酶的活性，并且提高酶的熱穩(wěn)定性及對(duì)PH的耐受性6。3.1.3 磁性高分子微球磁性高分子微球是由無(wú)機(jī)磁性納米粒子與有機(jī)高分子通過(guò)包埋法、單體聚合法合成的具有磁響應(yīng)性和微球特性的粒子。通過(guò)共聚合和表面改性，磁性高分子微球表面可被賦予多種活性功能基團(tuán)（如-OH、-COOH、-CHO等）。無(wú)機(jī)磁性納米粒子應(yīng)用較多的是Fe3O4，單體聚合法主要包括乳液聚合、無(wú)皂乳液聚合、微乳液聚合、種子乳液聚合。

10、磁性微球有良好的表面效應(yīng)和體積效應(yīng)：比表面積較大，微球官能團(tuán)密度較高，選擇性吸附能力較強(qiáng)，吸附平衡時(shí)間較短；選擇磁響應(yīng)性，可以避免使用中粒子之間發(fā)生磁性團(tuán)聚；物理化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，具備一定的機(jī)械強(qiáng)度和化學(xué)穩(wěn)定性，能耐受一定濃度的酸堿溶液和微生物的降解；表面本身具有或通過(guò)表面改性賦予多種活性的功能基團(tuán)，這些功能基團(tuán)可以連接生物活性物質(zhì)7。3.1.4 離子液體離子液體是一種新的綠色溶劑，在生物催化反應(yīng)中具有以下特點(diǎn):在離子液體中酶有良好的選擇性、穩(wěn)定性和反應(yīng)活性。離子液體可溶解極性大的反應(yīng)物，產(chǎn)物易分離，酶和離子液體可重復(fù)使用8。離子液體是由有機(jī)正離子如烷基吡啶離子、季胺鹽離子、烷基咪唑離子等和不同的

11、負(fù)離子組成的低熔點(diǎn)的有機(jī)熔鹽，在室溫或低溫下是液體。離子液體和水、常用有機(jī)溶劑可以互溶，但和大多數(shù)醚、烷烴不溶，因此可以用醚、烷烴來(lái)萃取產(chǎn)物。并且可以通過(guò)改變正負(fù)離子及烷基碳的長(zhǎng)短調(diào)節(jié)其極性和親水性，故又被稱為可設(shè)計(jì)溶劑。Erbeldinger9小組首次報(bào)道在離子液體BMIMPF6PH2O(95P5 vPv)中用蛋白酶thermolysin成功催化合成了阿斯巴甜(Z2aspartame)(圖式4)，開(kāi)創(chuàng)了在離子液體中生物催化研究的新領(lǐng)域。圖式4 離子液體中蛋白酶thermolysin催化的合成阿斯巴甜的反應(yīng)3.2 酶固定化的新技術(shù)、新方法44.24.33.23.2.1 微波/超聲輔助固定化微波

12、是一種電磁波，波長(zhǎng)為0.1100 cm。微波加熱的主要原理是介質(zhì)材料的極性分子在微波高頻電場(chǎng)的作用下反復(fù)快速取向轉(zhuǎn)動(dòng)而摩擦生熱，是從物質(zhì)內(nèi)部開(kāi)始，瞬時(shí)達(dá)到需要的溫度。微波加熱具有許多傳統(tǒng)加熱不具備的優(yōu)點(diǎn)，包括：加熱迅速、均勻，不需要熱傳導(dǎo)過(guò)程，內(nèi)外同時(shí)加熱，加熱時(shí)間短；加熱質(zhì)量高，營(yíng)養(yǎng)破壞少；節(jié)能高效；易于控制功能等超聲波是指振動(dòng)頻率大于20 kHz以上的一種縱波，在介質(zhì)中傳播時(shí)，使介質(zhì)發(fā)生物理的和化學(xué)的變化，從而產(chǎn)生一系列超聲效應(yīng)，包括熱效應(yīng)、機(jī)械效應(yīng)、空化效應(yīng)和化學(xué)效應(yīng)10。研究認(rèn)為，超聲波對(duì)液體化學(xué)反應(yīng)速度和產(chǎn)率的影響主要是超聲波在液體介質(zhì)中的空化作用，超聲可使液體介質(zhì)中形成微泡，其破裂

13、伴隨能量的釋放，可以提高許多化學(xué)反應(yīng)的速度。到目前為止，超聲波技術(shù)對(duì)物質(zhì)提取，高分子降解，酶解反應(yīng)等都有很好的促進(jìn)作用。其中超聲波酶解反應(yīng)具有高效、廉價(jià)、無(wú)污染，可提高酶促反應(yīng)速度和有效成分的產(chǎn)率。3.2.2 無(wú)載體固定化交聯(lián)酶晶體（cross-linked enzyme crystals，CLECs）是指通過(guò)交聯(lián)劑，如：戊二醛，將在水溶液中的酶晶體交聯(lián)成一種穩(wěn)定結(jié)構(gòu)及性能的晶態(tài)物質(zhì)，其既具有酶的高活性、高選擇性、反應(yīng)條件溫和等特點(diǎn)，又具有固相催化劑的環(huán)境適應(yīng)性強(qiáng)、易回收等優(yōu)勢(shì)，從而使其在有機(jī)合成中應(yīng)有較廣。CLECs是一種無(wú)需載體、既有純蛋白的高度特異活性又對(duì)有機(jī)溶劑具有高度耐受性的生物催化

14、劑。由于CLECs需要高純度酶結(jié)晶，實(shí)驗(yàn)室難以實(shí)行，所以其發(fā)展受到很大限制。交聯(lián)酶聚集體(Cross-linked Enzyme Aggregates，CLEAs)技術(shù)是一種將蛋白質(zhì)先沉淀后交聯(lián)形成不溶性的、穩(wěn)定的固定化酶，是通過(guò)基本純化的、高濃度的蛋白質(zhì)樣品的共價(jià)交聯(lián)來(lái)實(shí)現(xiàn)的。具有對(duì)酶的純度要求不高、不需要結(jié)晶等復(fù)雜步驟、可可獲得穩(wěn)定性好、活性高、成本低、易于推廣、空間效率高等特點(diǎn)，因此是一個(gè)很有發(fā)掘潛力的固定化方法。4固定化酶的應(yīng)用固定化酶的研究和應(yīng)用不僅在化學(xué)生物學(xué)、生物工程醫(yī)學(xué)及生命科學(xué)等領(lǐng)域異常活躍，而且因?yàn)榫哂泄?jié)省能源與資源、減少污染的生態(tài)環(huán)境效應(yīng)而符合可持續(xù)發(fā)展的戰(zhàn)略要求，目前固

15、定化酶已被廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥領(lǐng)域、食品行業(yè)、化工行業(yè)、材料科學(xué)、環(huán)保領(lǐng)域、能源領(lǐng)域、蛋白質(zhì)組學(xué)等領(lǐng)域。4.4.1. 醫(yī)藥領(lǐng)域固定化脲酶：脲酶是專一性催化尿素水解的酶，應(yīng)用于尿素生產(chǎn)控制、產(chǎn)品檢驗(yàn)，也廣泛用于臨床醫(yī)學(xué)、醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)等，脲酶的固定化在血液透析中有著極佳的應(yīng)用前景。固定化磷酸酯酶：磷酸酯酶的作用是催化水解低密度脂蛋白上的磷脂的酶，加速體內(nèi)低密度脂蛋白的代謝。人體中的低密度脂蛋白是主要的血漿膽固醇載體，由于其在體內(nèi)代謝緩慢，易形成高血漿膽固醇，以至引起心血管疾病，因此磷酸酯酶的固定化可以應(yīng)用于心血管疾病的治療。固定化葡聚糖酶：葡聚糖酶常用于水解在血液替代品的制備過(guò)程中產(chǎn)生的右旋糖酐。4.2.

16、食品行業(yè)固定化酶應(yīng)用于食品檢測(cè)：固定化酶技術(shù)的發(fā)展使生物傳感器也得到相當(dāng)大的發(fā)展，它不僅使食品成分的高選擇性、快速、低成本分析測(cè)定成為可能，而且生物傳感器技術(shù)的持續(xù)發(fā)展將很快實(shí)現(xiàn)食品生產(chǎn)的在線質(zhì)量控制，降低食品生產(chǎn)成本，并可以保證安全可靠及高質(zhì)量的食品11。4.3. 生物傳感器方面的應(yīng)用在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，生物傳感器因快速、靈敏、專一、響應(yīng)快等優(yōu)點(diǎn)發(fā)揮著越來(lái)越重要的作用。目前，在檢測(cè)多種細(xì)菌、病毒及其毒素等多個(gè)方面生物傳感器已有較廣泛應(yīng)用。比如高精度血糖分析儀是采用固定化酶的生物傳感分析儀，其分析精度可以達(dá)到0. 5% 2%，比家用保健類生物傳感器幾乎高一個(gè)數(shù)量級(jí)，比目前醫(yī)用生化分析儀的精度也高2%

17、3%。這在血糖分析領(lǐng)域是非常重要的。酶電極現(xiàn)已用于測(cè)定各種糖類、抗生素、氨基酸、有機(jī)酸、脂肪、醇類、胺類以及尿素、尿酸等。4.4. 環(huán)境保護(hù)在環(huán)境監(jiān)測(cè)方面，固定化酶也可以用于測(cè)定有毒物質(zhì)含量以進(jìn)行環(huán)境監(jiān)測(cè)。楊雪梅等選用硅膠、活性炭、大孔樹(shù)脂，在一定條件下用物理吸附法固定蛋白酶，3種載體固定的蛋白酶對(duì)含高濃度蛋白質(zhì)的淀粉黃漿廢水進(jìn)行水解實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)大孔樹(shù)脂對(duì)蛋白酶的效果良好，并對(duì)含高濃度蛋白質(zhì)的廢水處理效果最好12。在廢水處理中，固定化酶也受到了越來(lái)越多科學(xué)家的關(guān)注。生活污水和工業(yè)廢水中有害成分主要是氯酚，將辣根過(guò)氧化物酶大量吸附在磁石上，可以保證其100%的活力，且凈化效果是粗酶的20多倍。4.5. 能源利用近年來(lái)不少學(xué)者為了解決能源緊缺問(wèn)題致力于利用固定化的脂肪酶催化合成生物柴油。高陽(yáng)等研究了利用多孔