菠蘿蛋白酶的提取、初步分離純化及活性測定

1、菠蘿蛋白酶的提取、初步分別純化及活性測定14食安（1）班 楊澤杰摘要：本文結(jié)合考馬斯亮藍(lán)G250染色法，爭辯了不同純化方法，包括硫酸銨沉淀法、透析法，對菠蘿蛋白酶活性的影響。試驗結(jié)果表明，兩種純化方法都能有效純化菠蘿蛋白酶，但是會對菠蘿蛋白酶的活性造成肯定的損失。關(guān)鍵詞：菠蘿蛋白酶 沉淀法 透析法 純化 酶活性前 言菠蘿蛋白酶（Bromelain，EC 3.4.22.3）簡稱菠蘿酶，是從鳳梨屬植物菠蘿中提取的一組復(fù)合的半胱氨酸巰基蛋白水解酶，它廣泛存在于菠蘿的果實、芽、葉、莖。菠蘿蛋白酶屬于糖蛋白，是由巰基蛋白酶和非蛋白酶組分構(gòu)成的簡單復(fù)合物，因含有一個不穩(wěn)定的游離巰基，所以菠蘿蛋白酶極易被氧

2、化而使其酶活下降。菠蘿蛋白酶的相對分子質(zhì)量大約為33 000，等電點 9.55，最適pH在7.1左右，在偏酸環(huán)境下酶活下降較快，堿性環(huán)境能延緩失活。菠蘿蛋白酶的溫度的最穩(wěn)定范圍是5565。金屬鹽離子中NaCl、KCl對酶活的影響不是很大，維生素C、半胱氨酸、硫代硫酸鈉、2-巰基乙醇是菠蘿蛋白酶的穩(wěn)定劑，EDTA能通過螯合對酶活有影響的金屬離子而愛護菠蘿蛋白酶，有機溶劑中甲醇、乙醇、乙二醇對酶活損失較大。在食品工業(yè)中菠蘿蛋白酶作為一種食品添加劑，能分解蛋白質(zhì)、肽、酯和酰胺等，可用于肉質(zhì)嫩化、水解蛋白、啤酒澄清、干酪生產(chǎn)等。在醫(yī)藥上它可以治療水腫及多種炎癥，它能掛念快速結(jié)痂，對正常組織無害，不影響

3、植皮，適用于中小面積深度燒傷的治療。1 試驗材料與儀器1.1 試驗材料與試劑1.1.1 試驗材料 新穎菠蘿（3個），透析袋1.1.2 試驗試劑（1）鹽析粗提液0.1mo1/L pH 7.8磷酸緩沖液配制（PBS）（配4 000mL），0.01mo1/L pH 7.8磷酸緩沖液配制（PBS）（配4 000mL）（2）酶活力測定試劑1酪蛋白（進口分裝）（配100mL），激活劑含20mmo1L半胱氨酸-鹽酸鹽、1mmo1/L EDTA-Na2 (乙二胺四乙酸二鈉) ，10三氯乙酸(TCA) 1.2 試驗儀器和用品1.2.1 試驗儀器HJ-6多頭磁力攪拌器：常州國華電器有限公司MC-H18S012多功

4、能紅外爐：廣東美的生活電器制造有限公司DS-1高速組織搗碎機：上海標(biāo)本模型廠GKC110R2可控硅恒溫水浴鍋：賞花錦屏儀器儀表有限公司TD5M低速離心機：長沙湘智離心機儀器有限公司TDL-60B臺式離心機：上海安亭科學(xué)儀器廠722型可見分光光度計：上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司UV5100B型紫外可見分光光度計：上海元析儀器有限公司PL1502-S電子天平：梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司BS110S分析天平北京賽多利斯天平有限公司BCD-539WT冰箱：青島海爾股份有限公司1.2.2 試驗用品（1）以組為單位的用品 大試管18mm×200 mm（10支）、試管架（2個）、燒杯（50

5、mL×1，100mL×2， 200mL×1）、滴管（2支）、玻璃棒（2支）、移液管（5mL×1，1mL×2，0.1mL×1，0.2 mL×1）、漏斗（3個）、量筒 （100mL×1）、研缽、白瓷板、紗布、濾紙、蒸餾水瓶、洗耳球、標(biāo)簽紙、橡皮筋。（2）全班共用的用品試劑瓶（1000mL×7，250mL×3，60mL×20）、燒杯（1000mL×4）、塑料燒杯（2000mL×2）、量筒 （500mL×2，1000mL×2）、廣泛pH試紙、剪刀、電爐和

6、鍋、蒸餾水容器、透析袋（截留相對分子質(zhì)量8 00014 000）。2 試驗方法2.1 菠蘿蛋白酶的粗酶提取稱取菠蘿皮材料30g，將菠蘿皮在清水中洗凈，瀝干，切成小段后置于超高速攪拌機中，加入約60mL預(yù)冷的0.1mo1/L pH 7.8 PBS，持續(xù)攪拌1015min至粉碎，攪拌完成后用4層紗布過濾，得到濾液后，用冷凍離心機于4°C 3000rpm離心6min，棄沉淀，即得到菠蘿蛋白酶粗提液，測定粗提液的體積、蛋白質(zhì)含量和酶活性1。2.2 鹽析依據(jù)附錄的“硫酸銨飽和度計算表”，按30%硫酸銨飽和度計算在上述酶提取液中需添加的固體硫酸銨量，稱取固體硫酸銨于研缽中，研磨呈粉末，漸漸小量分

7、次向酶提取液中添加固體硫酸銨，邊加邊攪拌，使溶液最終硫酸銨飽和度為30%，放置于冰水混合物（4）30min 后，酶蛋白沉淀析出，4°C 4000rpm離心10min，收集沉淀， 加入0.1mo1/L pH 7.8 PBS約15mL至完全溶解，測定其體積、蛋白質(zhì)含量和酶活性2。2.3 透析 將溶解液裝入2.5 cm×8cm透析袋（預(yù)先將透析袋在蒸餾水中煮沸30min）中，于 500mL 燒杯中，在磁力攪拌器攪拌下用蒸餾水透析，15min換水一次，換水34次后，檢查SO42-是否已被除凈（檢查的方法是：取2mLBaCl2溶液放入一支試管，滴加23滴透析外液至試管中，若消滅白色沉

8、淀，表示SO42- 未除凈，若無沉淀消滅，表示透析完全）。若透析液有沉淀，將透析液用濾紙過濾，測定過濾液的體積、蛋白質(zhì)含量和酶活性3。2.4 酶活性測定方法取2支試管，設(shè)置一支為試驗對比，三支為平行樣品。取0.1mL酶液，加入0.9mL激活劑，加入37預(yù)熱的1%酪蛋白溶液1mL，精確反應(yīng)10min，加入10%三氯乙酸3mL反應(yīng)終止酶反應(yīng)。對比管先加入10%三氯乙酸溶液，后加酪蛋白溶液，其它與測定管相同。離心（3000r/min，5min）或過濾，清液于280nm波長下測定光吸取值。酶活單位定義：在上述條件下 ，每10min增加0.001個光吸取值為1個酶單位（U）。試驗步驟依據(jù)表格中完成。試劑

9、(ml)對比組平行樣品1平行樣品2平行樣品3TCA3酶液0.10.10.10.1激活劑0.90.90.90.9酪蛋白111137°C精確反應(yīng)10minTCA333A280nm OD值2.5 蛋白質(zhì)含量測定方法2.5.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制01000g/mL標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：另取6支試管編號，按下表加入試劑。管號1234 5 6 1000g/mL牛血清白蛋白（mL）蒸餾水（mL）蛋白質(zhì)濃度（g/mL）01.000. 20. 82000. 40. 64000. 6 0. 8 1.00. 4 0. 2 0 600 800 1000得到從1到6號管的牛血清白蛋白溶液濃度分別為0、200、400、6

10、00、800、1000g/mL，精確吸取各管溶液0.lmL，加入5ml考馬斯亮藍(lán)溶液，搖勻，靜置2min，測定595nm吸光值，繪制0-1000g/mL標(biāo)準(zhǔn)曲線。2.5.2 樣品的測定精確吸取樣品溶液0.1mL放入具塞刻度試管中，與步驟 2.5.1 操作相同，測得樣品的光吸取值A(chǔ)595nm。3 試驗結(jié)果與分析3.1 蛋白質(zhì)含量計算由標(biāo)準(zhǔn)曲線可查出相應(yīng)的蛋白濃度（mg/mL），可按如下公式計算出樣品中蛋白含量。樣品蛋白含量(g/g鮮重)=查出的蛋白提取液濃度（g/mL）×定容體積(mL)樣品重量(g)3.2 酶活力計算最終酶活結(jié)果取3次重復(fù)試驗的平均值。酶液活力（U/mL）=A280n

11、m0.001×0.1×稀釋倍數(shù)3.3 酶比活的計算酶比活（U/mg·蛋白）=酶活力/酶蛋白質(zhì)含量3.4 酶純化過程中回收率計算回收率（%）=（純化酶總活力/粗酶液總活力）×100= （純化酶活力×純化酶液體積）/（粗酶活力×粗酶體積）×1003.5 酶純化倍數(shù)的計算純化倍數(shù)=純化酶比活力/粗酶比活力3.6 試驗結(jié)果3.6.1 蛋白質(zhì)含量3.6.1.1 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線測量數(shù)據(jù)管號1234 5 6 1000g/mL牛血清白蛋白（mL）蒸餾水（mL）蛋白質(zhì)濃度（g/mL）吸光度/A01.0000. 20. 82000.2

12、030. 40. 64000.3160. 6 0. 8 1.00. 4 0. 2 0 600 800 1000 0.491 0.631 0.633繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線如下：3.6.1.2 蛋白質(zhì)含量組別粗酶鹽析透析吸光度/A0.3610.2860.228蛋白質(zhì)濃度mg/mL0.4400.3520.272總體積/mL36.0017.0017.00蛋白質(zhì)含量/mg 15.8405.9844.624樣品蛋白含量=15.840mg20.00g=0.792mg/g(鮮重)3.6.2 酶活力組別對比組平行樣品1平行樣品2平行樣品3均值A(chǔ)280mm OD值粗酶00.4570.5870.6190.554A280mm

13、OD值鹽析00.8460.4880.5030.612A280mm OD值透析00.4610.4590.4730.464透析酶液活力(U/mL)=A280mm0.001×0.1×稀釋倍數(shù)=4640U/mL粗酶酶液活力(U/mL)=A280mm0.001×0.1×稀釋倍數(shù)=5540U/mL鹽析酶液活力(U/mL)=A280mm0.001×0.1×稀釋倍數(shù)=6120U/mL3.6.3 酶活比透析酶活比（U/mg·蛋白）=酶活力酶蛋白質(zhì)含量=46400.2295=20217.86(U/mg·蛋白)粗酶酶活比（U/mg

14、83;蛋白）=酶活力酶蛋白質(zhì)含量=55400.792=6994.95(U/mg·蛋白)鹽析酶活比（U/mg·蛋白）=酶活力酶蛋白質(zhì)含量=61200.2975=20571.43(U/mg·蛋白)3.6.4 酶純化回收率鹽析回收率（%）=（鹽析純化酶總活力/粗酶液總活力）×100= （鹽析純化酶活力×純化酶液體積）/（粗酶活力×粗酶體積）×100=（6120×17）/（5540×36）×100= 52.17%透析回收率（%）=（透析純化酶總活力/粗酶液總活力）×100= （透析純化酶活力&

15、#215;純化酶液體積）/（粗酶活力×粗酶體積）×100=（4640×17）/（5540×36）×100= 39.55%3.6.5 酶純化倍數(shù)鹽析純化倍數(shù)=鹽析純化酶比活力/粗酶比活力=20571.43÷6994.95=2.94透析純化倍數(shù)=透析純化酶比活力/粗酶比活力=20217.86÷6994.95=2.89菠蘿蛋白酶分別純化表步驟總體積（mL）總蛋白質(zhì)含量（mg）總活力（U）比活力（U/mg· 蛋白）回收率（%）純化倍數(shù)粗提取36.0015.8401994406994.95-鹽析17.005.98478880

16、20571.4352.172.94透析17.004.62410404020217.8639.552.893.7 試驗結(jié)果與爭辯理論上，在蛋白質(zhì)濃度中，粗酶的蛋白質(zhì)濃度應(yīng)當(dāng)要比透析、鹽析的蛋白質(zhì)濃度低，但是結(jié)果是粗酶蛋白質(zhì)的濃度最高，緣由可能是后面鹽析以及透析時操作不當(dāng)導(dǎo)致菠蘿蛋白酶損失嚴(yán)峻，導(dǎo)致整體濃度降低和蛋白質(zhì)含量削減。鹽析時，鹽析出來的沉淀不能完全溶解也可能導(dǎo)致溶液中蛋白質(zhì)含量降低。鹽析以及透析后的酶活力比粗酶的高。Fe3+、Fe2+、Cu2+存在對浸提液中菠蘿蛋白酶活性的影響較大,可能是與它們具有氧化還原性性有關(guān)4，在未鹽析透析之前，菠蘿蛋白酶受金屬離子影響，導(dǎo)致粗酶的酶活力和酶比活較

17、鹽析和透析低。鹽析回收率不高，可能是由于加入的固體硫酸銨并沒有完全溶解，或者提取液中，部分區(qū)域的硫酸銨濃度過高導(dǎo)致菠蘿蛋白酶失活，從而導(dǎo)致回收率低5。鹽析純化倍數(shù)比透析純化倍數(shù)高，這是由于鹽析后酶的濃度比透析的要高，所以鹽析的酶比活比透析的高，鹽析的單位酶活力比透析的高。因此，鹽析的純化倍數(shù)會更高。思考題：1. 如何防止酶在分別純化過程中發(fā)生變性失活。答：酶變性失活主要由于金屬離子、高溫、有機溶劑等不行逆因素的影響所以在純化的時候要做到：1.不使用自來水做透析液；2.不靠近紅外電爐；3.不使用不潔凈的儀器。2. 常見的酶活性表示方法有那些（如：U/mL酶液；U/mg蛋白質(zhì); U/g干重或鮮重；

18、U/g 酶粉 等）？它們各有什么含義，適用哪些場合？答：U/mL酶液：表示每單位體積樣液中酶活力的狀況，適用于表示液體酶中的酶活大小。U/mg蛋白質(zhì)：表示每單位質(zhì)量樣品中酶活力的狀況，適用于含一種或多種蛋白質(zhì)的樣品中的酶活大小。U/g鮮重或干重：表示每g原始樣品中的酶活力的狀況，適用于原始樣品的酶活力表示。U/g酶粉：表示每g酶粉中的酶活力狀況，適用于酶制劑的酶活力測定或者酶制劑的相應(yīng)濃度配制。3. 蛋白質(zhì)的沉淀作用還有哪些方法？哪些變性了？哪些沒有變性？ 答：變性：重金屬法，有機溶劑法，生物堿法6未變性：鹽析法4. 試驗中硫酸銨鹽析為什么要選擇0%30%飽和度？答：依據(jù)易元龍7的文獻(xiàn)，可以知道，在0-40%的飽和度范圍之內(nèi)，菠蘿蛋白酶的酶活回收率隨著飽和度的增大而增大，當(dāng)飽和度大于40%時，菠蘿蛋白酶的酶活回收率隨著飽和度的增大而削減。因此，選擇了該飽和度進行試驗。參 考 文 獻(xiàn)1 李建武，蕭能，余瑞元等，生物化學(xué)試驗原理和方法，北京，北京高校出版社，19942 余冰賓生物化學(xué)試驗指導(dǎo)北京：清華高校出版社，20033 趙亞華，高向陽生物化學(xué)與分子生物學(xué)試驗技術(shù)教程北京：高等教育出版社，20054 易元龍,李媚,謝濤,藍(lán)麗紅,廖安平,廣西民族高校學(xué)報,2008,12，Vol