蛋白質(zhì)與氨基酸的測(cè)定

1、蛋白質(zhì)與氨基酸的測(cè)定蛋白質(zhì)與氨基酸的測(cè)定蛋白質(zhì)含量低大頭娃娃蛋白質(zhì)含量低大頭娃娃蛋白質(zhì)含量蛋白質(zhì)含量“高高”，腎結(jié)石，腎結(jié)石為何測(cè)定蛋白質(zhì)為何測(cè)定蛋白質(zhì)1 1、重要的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)、重要的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì) 嬰幼兒配方乳粉嬰幼兒配方乳粉:蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)18%18%； （GB10765-1997GB10765-1997） 嬰幼兒配方乳粉嬰幼兒配方乳粉、 : :蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)12-18%12-18%； （GB10766-GB10766-19971997） 2椰子汁中蛋白加熱沉淀椰子汁中蛋白加熱沉淀黃酒貯藏中的沉淀大黃酒貯藏中的沉淀大部分為蛋白質(zhì)部分為蛋白質(zhì)2 2、影響食品色、香、味及結(jié)構(gòu)、影響食品色、香、味及結(jié)構(gòu)面筋

2、蛋白：面包粉面筋蛋白：面包粉33%；蛋糕粉；蛋糕粉: 22%饅饅頭粉頭粉25%-30%（ SB/T-93 ）3第一節(jié)第一節(jié) 蛋白質(zhì)的定量測(cè)定蛋白質(zhì)的定量測(cè)定 定量方法：凱氏定氮法及分光光度法。定量方法：凱氏定氮法及分光光度法。一、凱氏定氮法一、凱氏定氮法 奶粉中測(cè)得氮含量為奶粉中測(cè)得氮含量為2.12%,2.12%,蛋白質(zhì)含氮為蛋白質(zhì)含氮為16%16%，奶粉中蛋白質(zhì)含量奶粉中蛋白質(zhì)含量? ? 換算系數(shù)通常，牛乳及制品為，大豆及制品換算系數(shù)通常，牛乳及制品為，大豆及制品為等。為等。4脫水性：將脫水性：將H H、O O按按2 2：1 1比例脫去，剩下比例脫去，剩下C C、N N氧化性：氧化性： 2H

3、2H2 2SOSO4 4 + C + C 2SO2SO2 2+ 2H+ 2H2 2O + COO + CO2 2 3SO 3SO2 2+2N +3H+2N +3H2 2O=3SOO=3SO3 3 +2NH +2NH3 3H2SO4 酸性：酸性： H H2 2SOSO4 4 +2NH +2NH3 3= (NH= (NH4 4) )2 2SOSO4 4 丹麥化學(xué)家丹麥化學(xué)家Johan Kjeldahl（1883）發(fā)明的，當(dāng)時(shí)只用）發(fā)明的，當(dāng)時(shí)只用H2SO4分解試樣，分解試樣，需長(zhǎng)時(shí)間，后來(lái)需長(zhǎng)時(shí)間，后來(lái)Gunning改進(jìn)，在消化時(shí)加入改進(jìn)，在消化時(shí)加入K2SO4使沸點(diǎn)上升從而加快分使沸點(diǎn)上升從而加

4、快分解速度。后來(lái)解速度。后來(lái)51 1、原理、原理 樣品與硫酸、催化劑加熱消化，蛋白質(zhì)分解，樣品與硫酸、催化劑加熱消化，蛋白質(zhì)分解，其中的其中的C C、H H氧化為氧化為COCO2 2和和H H2 2O O蒸汽逸出，而氮轉(zhuǎn)化蒸汽逸出，而氮轉(zhuǎn)化為氨，與硫酸結(jié)合成硫酸銨，加堿蒸餾，使氨蒸為氨，與硫酸結(jié)合成硫酸銨，加堿蒸餾，使氨蒸出，用硼酸吸收后以鹽酸滴定。出，用硼酸吸收后以鹽酸滴定。硫酸鉀之目的：提高沸點(diǎn)，加快有機(jī)物分解；硫酸鉀之目的：提高沸點(diǎn)，加快有機(jī)物分解；硫酸銅之目的：催化劑、消化終點(diǎn)的指示劑硫酸銅之目的：催化劑、消化終點(diǎn)的指示劑（CuSOCuSO4 4藍(lán)綠色如果沒(méi)消化完全，則為藍(lán)綠色如果沒(méi)消

5、化完全，則為CuCu2 2SOSO4 4）、）、蒸餾前加入堿量合適否的蒸餾前加入堿量合適否的指示劑。指示劑。2CuSO2CuSO4 4+C=+C=Cu2SO4+SO2+CO2 Cu2SO4+2H2SO4=2CuSO4+SO2+2H2O62、過(guò)程、過(guò)程消化、蒸餾、吸收、滴定消化、蒸餾、吸收、滴定 （1 1）消化）消化 小火至泡沫消失小火至泡沫消失加大火力至透明無(wú)黑粒，搖加大火力至透明無(wú)黑粒，搖動(dòng)使瓶壁炭粒溶于硫酸中動(dòng)使瓶壁炭粒溶于硫酸中繼續(xù)消化繼續(xù)消化30min30min綠綠色色7（2）蒸餾與吸收）蒸餾與吸收8常量凱氏定氮常量凱氏定氮微量凱氏定氮微量凱氏定氮改良微量凱氏定氮改良微量凱氏定氮A A

6、、蒸餾完全判斷、蒸餾完全判斷 經(jīng)驗(yàn)時(shí)間：常量凱氏定氮約經(jīng)驗(yàn)時(shí)間：常量凱氏定氮約30min30min，微量定，微量定氮裝置中是指示劑變色后，再蒸餾氮裝置中是指示劑變色后，再蒸餾10min10min，提離，提離液面，再蒸餾液面，再蒸餾1min1min； 萘氏試劑遇氨氣呈紅棕色。萘氏試劑遇氨氣呈紅棕色。 配制：配制：2 2 溶于溶于70ml70ml水，加水，加4mol/lNaOH 30ml4mol/lNaOH 30ml。B B、吸收、吸收 用用2%2%或或4%4%硼酸作為吸收液，應(yīng)注意接收管浸硼酸作為吸收液，應(yīng)注意接收管浸沒(méi)在吸收液中。沒(méi)在吸收液中。C C、常量、半微量、微量概念、常量、半微量、微量

7、概念9常量：，常量：，10mL10mL；半微量：半微量：0.01g-0.1g 0.01g-0.1g ， 1mL-10mL 1mL-10mL ；微量：，。微量：，。 eg:eg:稱(chēng)樣稱(chēng)樣0.85g,0.85g,消化后，直接蒸餾，取出消消化后，直接蒸餾，取出消化液，定容至化液，定容至100mL100mL，取其中的，取其中的10mL10mL蒸餾蒸餾常量凱氏定氮常量凱氏定氮改良微量凱氏定氮改良微量凱氏定氮10（3 3）滴定）滴定 (NH(NH4 4) )2 2B B4 4O O7 7+HCl+H+HCl+H2 200NH4Cl+H3BO3 用鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定吸收有氨氣的硼酸液。用鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定吸收有

8、氨氣的硼酸液。 指示劑：指示劑：0.1%0.1%甲基紅甲基紅+0.1%+0.1%溴甲酚綠溴甲酚綠終點(diǎn)判定終點(diǎn)判定 2%2%硼酸溶液，藍(lán)綠色硼酸溶液，藍(lán)綠色灰色灰色 4%4%硼酸溶液，藍(lán)綠色硼酸溶液，藍(lán)綠色酒紅色酒紅色 主要與混合指示劑的變色范圍有關(guān)：主要與混合指示劑的變色范圍有關(guān)： pHpH紅色紅色 灰色灰色 綠色綠色 11n樣品中被惡意添加硫酸銨、氯樣品中被惡意添加硫酸銨、氯化銨，？化銨，？n樣品中被惡意添加硝酸銨，？樣品中被惡意添加硝酸銨，？n樣品中被惡意添加碳酸銨，？樣品中被惡意添加碳酸銨，？n樣品中被惡意添加尿素、三聚樣品中被惡意添加尿素、三聚氰胺，？氰胺，？N含量含量66.67%12

9、策略一：甲醛法測(cè)定樣品消化前銨鹽含量策略一：甲醛法測(cè)定樣品消化前銨鹽含量 4 4NHNH4 4+ + 6HCHO =(CH+ 6HCHO =(CH2 2）6 6N N4 4 H+ + 3H + 3H+ + + 6H+ 6H2 2O O 六次甲基四胺（弱堿，）六次甲基四胺（弱堿，） (NH4+是極弱的酸，不能直接用是極弱的酸，不能直接用NaOH滴定）滴定）過(guò)程過(guò)程 ：樣品：樣品+適量蒸餾水適量蒸餾水NaOH中和游離酸中和游離酸（甲基紅指示劑，紅色變橙色，（甲基紅指示劑，紅色變橙色，pH為為6.2 ）加入甲醛加入甲醛充分搖勻充分搖勻, 靜置靜置5min用用NaOH標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行滴定（酚酞指示劑，準(zhǔn)

10、溶液進(jìn)行滴定（酚酞指示劑，pH為為9.6 ）13注意：注意：A、中和游離酸時(shí)只能用甲基紅指示劑，如果甲、中和游離酸時(shí)只能用甲基紅指示劑，如果甲醛中有甲酸，宜用醛中有甲酸，宜用NaOH先中和，此時(shí)指示劑先中和，此時(shí)指示劑用酚酞。用酚酞。B、但要注意，甲醛也能和氨基酸發(fā)生反應(yīng)，且、但要注意，甲醛也能和氨基酸發(fā)生反應(yīng)，且能使酸性相對(duì)凸顯。能使酸性相對(duì)凸顯。C、碳酸銨不能用這種方法測(cè)定，因?yàn)樯a(chǎn)的碳、碳酸銨不能用這種方法測(cè)定，因?yàn)樯a(chǎn)的碳酸為弱酸，不能用酸為弱酸，不能用NaOH滴定，況且滴定，況且CO2會(huì)揮發(fā)。會(huì)揮發(fā)。D、硝酸銨中、硝酸銨中NO3-中的中的N不能被直接測(cè)出，但可不能被直接測(cè)出，但可以通

11、過(guò)分子式中的定量關(guān)系求出。以通過(guò)分子式中的定量關(guān)系求出。14策略二：牛奶中銨鹽的定性檢測(cè)策略二：牛奶中銨鹽的定性檢測(cè)2NH4+ + 2I- + 2ClO- = NHI2 + NH3 + 2Cl- + 2H2O過(guò)程：奶樣過(guò)程：奶樣5ml，加入，加入KI約，緩慢逐滴加入含約，緩慢逐滴加入含NaClO5%的的NaOH混合試劑，并同時(shí)觀察奶樣與最后所加試劑兩混合試劑，并同時(shí)觀察奶樣與最后所加試劑兩者界面處的顏色變化，若出現(xiàn)棕灰至黑色渾濁，表明樣者界面處的顏色變化，若出現(xiàn)棕灰至黑色渾濁，表明樣品摻有銨鹽。品摻有銨鹽。 （于琴，董文賓，趙旭博，鄭（于琴，董文賓，趙旭博，鄭 丹丹. 鮮奶中銨鹽快速檢測(cè)新鮮奶

12、中銨鹽快速檢測(cè)新方法研究方法研究.中國(guó)乳品工業(yè)中國(guó)乳品工業(yè). 2004，32，8.）15策略三：非蛋白質(zhì)有機(jī)物物中的策略三：非蛋白質(zhì)有機(jī)物物中的N，改用別的方法來(lái)測(cè)，改用別的方法來(lái)測(cè)定蛋白質(zhì)或別的方法測(cè)定惡意添加物。定蛋白質(zhì)或別的方法測(cè)定惡意添加物。 三聚氰胺檢測(cè)（三聚氰胺檢測(cè)（GB/T22388-2008GB/T22388-2008）HPLCHPLC（高效液相色譜法）、（高效液相色譜法）、HPLC-MCHPLC-MC、GC-MSGC-MSHPLCHPLCA A、提取、提取 超聲波及振蕩下，三氯乙酸、乙腈混合提取，三氯乙酸沉淀超聲波及振蕩下，三氯乙酸、乙腈混合提取，三氯乙酸沉淀蛋白，離心除雜。

13、蛋白，離心除雜。B、凈化、凈化 陽(yáng)離子固相萃取柱，用水、陽(yáng)離子固相萃取柱，用水、甲醇洗脫除雜，氨化乙醇洗脫，甲醇洗脫除雜，氨化乙醇洗脫，收集洗脫液，備用。收集洗脫液，備用。16C、測(cè)定、測(cè)定 C8或或C18柱柱 流動(dòng)相：檸檬酸、辛烷磺酸鈉、乙腈組成流動(dòng)相：檸檬酸、辛烷磺酸鈉、乙腈組成 流速流速1mL/min，柱溫，柱溫40，進(jìn)樣量，進(jìn)樣量20L 波長(zhǎng)波長(zhǎng)240nm 。17二、分光光度法二、分光光度法18方法方法原理原理紫外吸收法紫外吸收法蛋白質(zhì)在蛋白質(zhì)在280nm280nm處有吸收。處有吸收。 考馬斯亮藍(lán)比色法考馬斯亮藍(lán)比色法考馬斯亮藍(lán)使蛋白質(zhì)染色，在考馬斯亮藍(lán)使蛋白質(zhì)染色，在620nm620

14、nm處有最大吸收（處有最大吸收（標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)：牛血清蛋白標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)：牛血清蛋白bovine serum albuminbovine serum albumin）。）。雙縮脲法雙縮脲法 雙縮脲與堿性銅生成紫紅色配合物，在雙縮脲與堿性銅生成紫紅色配合物，在560nm560nm處有最大吸收。（備注處有最大吸收。（備注1 1）lowrylowry法法 蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)- -銅絡(luò)合物中的酪氨酸及色氨酸殘銅絡(luò)合物中的酪氨酸及色氨酸殘基使磷鉬酸基使磷鉬酸- -磷鎢酸（磷鎢酸（Folin phenol Folin phenol reagentreagent）還原成藍(lán)色物質(zhì)。（備注）還原成藍(lán)色物質(zhì)。（備注2 2）備注備注

15、1：19雙縮脲法雙縮脲法備注備注2：（1）lowrylowry法的原理法的原理 色澤的變化主要緣于鉬、鎢化學(xué)價(jià)的降低，該物質(zhì)色澤的變化主要緣于鉬、鎢化學(xué)價(jià)的降低，該物質(zhì)的吸收波長(zhǎng)在的吸收波長(zhǎng)在550-750nm之間，當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)濃度在之間，當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)濃度在1-100g/ml時(shí)，用時(shí)，用750nm或或660nm，當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)含量更高，當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)含量更高時(shí)，用時(shí)，用550nm。 沒(méi)有銅離子時(shí)，色澤由蛋白質(zhì)中的酪氨酸及色氨酸沒(méi)有銅離子時(shí)，色澤由蛋白質(zhì)中的酪氨酸及色氨酸殘基含量決定，其次是半胱氨酸和組氨酸殘基含量決定，殘基含量決定，其次是半胱氨酸和組氨酸殘基含量決定，銅離子將肽鍵聚合在一起，從而加速了電子的傳遞。

16、銅離子將肽鍵聚合在一起，從而加速了電子的傳遞。 干擾物質(zhì)較多：干擾物質(zhì)較多：檸檬酸，檸檬酸，tris，甘氨酸，組氨酸，谷氨酸，甘氨酸，組氨酸，谷氨酸，EDTA，葡萄糖，果糖，高濃度的尿素，硫酸銨等都有影響，葡萄糖，果糖，高濃度的尿素，硫酸銨等都有影響。20（2）試劑組成（）試劑組成（）Lowry A: 2% Na2CO3 in 0.1 M NaOH Lowry B: 1% CuSO4 in diH2O Lowry C: 2% sodium potassium tartrate (NaKC4H4O6 4H2O) Lowry stock reagent 49 ml Lowry A 0.5 ml L

17、owry B 0.5 ml Lowry C Folins Reagent: Phenol reagent - 2N (Folin - Ciocalteau reagent) 主要成分為：主要成分為：3H2OP2O513WO35MoO310H2O 3H2OxP2O514WO34MoO310H2O（ ） Folin phenol試劑還可以測(cè)定酚類(lèi)物質(zhì)的含量試劑還可以測(cè)定酚類(lèi)物質(zhì)的含量（鄭鄭鴻元鴻元 許光輝許光輝 李鳳珍等李鳳珍等 .土壤微生物分析方法手冊(cè)土壤微生物分析方法手冊(cè). 中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社，中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社，1986.）21（3）該法的歷史）該法的歷史 吳憲博士吳憲博士（18931959年）是國(guó)

18、際著名生物化學(xué)家、中國(guó)近代生年）是國(guó)際著名生物化學(xué)家、中國(guó)近代生物化學(xué)事業(yè)的開(kāi)拓者和奠基人物化學(xué)事業(yè)的開(kāi)拓者和奠基人于于1922年發(fā)現(xiàn)年發(fā)現(xiàn)Folin phenol reagent能測(cè)定蛋白質(zhì)能測(cè)定蛋白質(zhì) (Wu, H. (1922) J. Biol. Chem. 51, 3339) 。 Lowry發(fā)現(xiàn)，在此前，先讓蛋白質(zhì)與銅發(fā)生發(fā)現(xiàn)，在此前，先讓蛋白質(zhì)與銅發(fā)生發(fā)生絡(luò)合反應(yīng)（雙縮脲法發(fā)生絡(luò)合反應(yīng)（雙縮脲法 ），能提高反應(yīng)的靈敏），能提高反應(yīng)的靈敏度度(Lowry, O. H., Rosebrough, N. J., Farr, A. L. and Randall, R. J.(1951) J.

19、 Biol. Chem. 193, 265275）。）。22第二節(jié)第二節(jié) 蛋白質(zhì)定性（略）蛋白質(zhì)定性（略）定性蛋白質(zhì)主要是通過(guò)顯色反應(yīng)完成。定性蛋白質(zhì)主要是通過(guò)顯色反應(yīng)完成。 常用顯色劑：氨基黑常用顯色劑：氨基黑10B、溴酚藍(lán)、溴酚藍(lán)、考馬斯亮藍(lán)、酸性品紅、氨基萘酚磺酸?？捡R斯亮藍(lán)、酸性品紅、氨基萘酚磺酸。 另外對(duì)于糖蛋白及脂蛋白都有專(zhuān)門(mén)另外對(duì)于糖蛋白及脂蛋白都有專(zhuān)門(mén)的顯色劑。的顯色劑。 23第三節(jié)第三節(jié) 氨基酸定性氨基酸定性一、一般顯色反應(yīng)一、一般顯色反應(yīng)茚三酮法：藍(lán)紫色。茚三酮法：藍(lán)紫色。二、個(gè)別氨基酸的顯色反應(yīng)（略）二、個(gè)別氨基酸的顯色反應(yīng)（略）精氨酸的坂口反應(yīng)、胱氨酸和半胱精氨酸的坂口

20、反應(yīng)、胱氨酸和半胱氨酸的顯色反應(yīng)等。氨酸的顯色反應(yīng)等。24第四節(jié)第四節(jié) 氨基酸定量氨基酸定量25一、甲醛滴定法一、甲醛滴定法1 1、原理、原理 酸性的酸性的-COOH-COOH，堿性的，堿性的-NH-NH2 2，使氨基酸成為中，使氨基酸成為中性的內(nèi)鹽，加入甲醛溶液時(shí)，性的內(nèi)鹽，加入甲醛溶液時(shí)，-NH-NH2 2與甲醛結(jié)合，與甲醛結(jié)合，其堿性消失，用堿滴定其堿性消失，用堿滴定-COOH-COOH基，以間接方法測(cè)定基，以間接方法測(cè)定氨基酸的量。氨基酸的量。2 2、大約過(guò)程、大約過(guò)程 加堿中和酸（）、加入甲醛，加堿滴定。當(dāng)加堿中和酸（）、加入甲醛，加堿滴定。當(dāng)加入甲醛后，溶液的加入甲醛后，溶液的pH

21、pH值還在嗎？當(dāng)樣品中存在值還在嗎？當(dāng)樣品中存在4 4+ +時(shí)時(shí), , 則測(cè)定結(jié)果偏大偏?。咳绾闻懦@種則測(cè)定結(jié)果偏大偏?。咳绾闻懦@種影響？影響？阮富升阮富升. 銨鹽對(duì)甲醛法測(cè)定醬油氨基氮含量的影響銨鹽對(duì)甲醛法測(cè)定醬油氨基氮含量的影響. 中國(guó)調(diào)味品中國(guó)調(diào)味品. 第第8期期1999年年8月月. 甲醛不但與氨基酸的氨基起反應(yīng)甲醛不但與氨基酸的氨基起反應(yīng),同時(shí)也與同時(shí)也與4+起反應(yīng)，起反應(yīng)，增增加了反應(yīng)體系的酸性，這部分酸性不能代表氨基酸的羧基加了反應(yīng)體系的酸性，這部分酸性不能代表氨基酸的羧基的酸性。的酸性。因此，以氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定時(shí)，會(huì)消耗更多的氫氧化因此，以氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定時(shí)，會(huì)消耗更

22、多的氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液，使氨基氮計(jì)算結(jié)果升高。溶液，使氨基氮計(jì)算結(jié)果升高。264NH4+ 6HCHO =(CH2）6N4 H+ + 3H+ + 6H2O二、比色法二、比色法271、茚三酮法、茚三酮法氨基酸與茚三酮生成藍(lán)紫色化合物二酮茚胺，該物在氨基酸與茚三酮生成藍(lán)紫色化合物二酮茚胺，該物在570nm有最大吸收（但脯氨酸和羥脯氨酸由于有最大吸收（但脯氨酸和羥脯氨酸由于氨基被氨基被取代，生成物顯黃色取代，生成物顯黃色440nm有最大吸收）。有最大吸收）。 茚三酮反應(yīng)的適宜茚三酮反應(yīng)的適宜pH為為5-7 所有所有-氨基酸和蛋白質(zhì)都有此反應(yīng)，但有此反應(yīng)的氨基酸和蛋白質(zhì)都有此反應(yīng)，但有此反應(yīng)的不一定

23、都是不一定都是-氨基酸和蛋白質(zhì)，比如氨基酸和蛋白質(zhì)，比如-丙氨酸、氨、許丙氨酸、氨、許多一級(jí)胺與茚三酮都呈陽(yáng)性多一級(jí)胺與茚三酮都呈陽(yáng)性。（。（鄭繼平，湯華，陳銀華鄭繼平，湯華，陳銀華 .現(xiàn)代生現(xiàn)代生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)物學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo). 中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社，中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社，2007.）但色澤不一定一樣，比但色澤不一定一樣，比如，如，-氨基酸呈黃色，苯胺橙紅色。（氨基酸呈黃色，苯胺橙紅色。（楊桂法等楊桂法等. 有機(jī)化學(xué)分有機(jī)化學(xué)分析析. 湖南大學(xué)出版社，湖南大學(xué)出版社，1996. ）28 但課本但課本P140所談及的及所談及的及GB/T 8314-2002茶游離氨茶游離氨基酸總量測(cè)定時(shí)：基酸總量測(cè)定時(shí)：-氨基酸

24、在的條件下與茚三酮共熱，氨基酸在的條件下與茚三酮共熱，形成紫色絡(luò)合物，用分光光度法在特定的波長(zhǎng)下測(cè)定其形成紫色絡(luò)合物，用分光光度法在特定的波長(zhǎng)下測(cè)定其含量。含量。 茚三酮受陽(yáng)光、空氣、溫度、濕度等影響而被氧化，茚三酮受陽(yáng)光、空氣、溫度、濕度等影響而被氧化，使用前用活性炭吸附被氧化物而純化。使用前用活性炭吸附被氧化物而純化。292、鄰苯二甲醛法（、鄰苯二甲醛法（O-Phthalic aldehyde ,OPT)鄰苯二甲醛在鄰苯二甲醛在2-巰基乙醇存在下，堿性溶液中，與氨基巰基乙醇存在下，堿性溶液中，與氨基酸產(chǎn)生熒光物質(zhì)，激發(fā)光波長(zhǎng)為酸產(chǎn)生熒光物質(zhì)，激發(fā)光波長(zhǎng)為340nm，發(fā)射光波長(zhǎng)，發(fā)射光波長(zhǎng)為

25、為455nm。n靈敏度比茚三酮高，但熒光強(qiáng)度與氨基酸種類(lèi)有關(guān)，靈敏度比茚三酮高，但熒光強(qiáng)度與氨基酸種類(lèi)有關(guān)，對(duì)半胱氨酸、胱氨酸和賴(lài)氨酸等的熒光值偏低，和脯對(duì)半胱氨酸、胱氨酸和賴(lài)氨酸等的熒光值偏低，和脯氨酸和羥脯氨酸不反應(yīng)，尿素、尿酸及氨等不發(fā)生類(lèi)氨酸和羥脯氨酸不反應(yīng)，尿素、尿酸及氨等不發(fā)生類(lèi)似反應(yīng)。似反應(yīng)。303、三硝基苯磺酸法（、三硝基苯磺酸法（TriNitroBenzene Sulfonic acid ）31n與茚三酮相比：靈敏度相當(dāng)，且不受與茚三酮相比：靈敏度相當(dāng)，且不受NH4+的影響，但的影響，但不能與不能與Pro反應(yīng)，可以和反應(yīng)，可以和Cys的的-SH反應(yīng)，為此，反應(yīng)，為此，TNBS

26、前，堿性條件下前，堿性條件下30保溫?cái)?shù)小時(shí)，使保溫?cái)?shù)小時(shí)，使-SH都氧化成都氧化成-S-S-后，再測(cè)定。后，再測(cè)定。n堿性條件下測(cè)定的優(yōu)勢(shì)是可以用堿性條件下測(cè)定的優(yōu)勢(shì)是可以用420nm，在可見(jiàn)光范，在可見(jiàn)光范圍內(nèi)，劣勢(shì)是每種氨基酸的消光系數(shù)不同；酸性條件下圍內(nèi)，劣勢(shì)是每種氨基酸的消光系數(shù)不同；酸性條件下的優(yōu)勢(shì)是每種氨基酸的消光系數(shù)同，但需紫外光。的優(yōu)勢(shì)是每種氨基酸的消光系數(shù)同，但需紫外光。324、丹磺酰氯法（、丹磺酰氯法（dansyl chloride）丹磺酰氯是丹磺酰氯是5-二甲基氨基萘二甲基氨基萘-1-磺酰氯（磺酰氯（5-dimethylaminonaphthalene-1 -sulfon

27、yl chloride）的）的簡(jiǎn)稱(chēng)。丹磺酰氯與氨基酸反應(yīng)生成熒光性質(zhì)強(qiáng)和穩(wěn)定的簡(jiǎn)稱(chēng)。丹磺酰氯與氨基酸反應(yīng)生成熒光性質(zhì)強(qiáng)和穩(wěn)定的磺胺衍生物磺胺衍生物(激發(fā)波長(zhǎng)激發(fā)波長(zhǎng)298nm，發(fā)射波長(zhǎng)，發(fā)射波長(zhǎng)546nm），也），也常用于多肽鏈的常用于多肽鏈的N末端氨基酸的鑒定。末端氨基酸的鑒定。335、 2,4-二硝基氟苯（二硝基氟苯（2,4-dinitrofluorobenzene, DNFB）法）法DNFB也叫做也叫做Sanger試劑，試劑，DNFB在弱堿性溶液中與氨基酸發(fā)生在弱堿性溶液中與氨基酸發(fā)生取代反應(yīng)，生成黃色化合物二硝基苯基氨基酸（取代反應(yīng)，生成黃色化合物二硝基苯基氨基酸（dinitro ph

28、enyl amino acid, DNP氨基酸）氨基酸）34351.0 mL 的的0.2 mol/L NaHCO3,1.0 mL 的的 1% DNFB (1.0mL 溶解溶解在在100mL的的1,4-dioxane) ，1.0 mL 樣品液樣品液, 黑暗處黑暗處60 ，40min, 加入加入0.5 mL of 1 mol/L HCl終止反應(yīng)，加入終止反應(yīng)，加入5mL乙酸乙乙酸乙酯萃取，靜置酯萃取，靜置10min,420nm測(cè)定，氨基酸濃度測(cè)定，氨基酸濃度0.021.00 mg/mL有良好的線性關(guān)系有良好的線性關(guān)系（Lin Chen，et al. A novel colorimetric det

29、ermination of free amino acids content in tea infusions with 2,4-dinitrofluorobenzene. Journal of Food Composition and Analysis 22 (2009) 137141）。）。方法方法靈敏度靈敏度脯氨酸、羥脯氨脯氨酸、羥脯氨酸酸受氨的影受氨的影響響茚三酮茚三酮能反應(yīng)能反應(yīng)有影響有影響鄰苯二甲醛鄰苯二甲醛比茚三酮比茚三酮高高不反應(yīng)不反應(yīng)不影響不影響三硝基苯磺酸三硝基苯磺酸與茚三酮與茚三酮同同不反應(yīng)不反應(yīng)不影響不影響丹磺酰氯丹磺酰氯比茚三酮比茚三酮高高反應(yīng)反應(yīng)未知未知2,4-二硝

30、基氟二硝基氟苯苯比茚三酮比茚三酮高高反應(yīng)反應(yīng)未知未知36幾種比色法的比較幾種比色法的比較第五節(jié)第五節(jié) 氨基酸分離及測(cè)定氨基酸分離及測(cè)定一、蛋白質(zhì)的水解一、蛋白質(zhì)的水解n酸水解：酸水解：鹽酸，密封的水解管中，鹽酸，密封的水解管中，105-115水解水解20h以上。以上。鹽酸水解后，鹽酸水解后，色氨酸全部被破壞。色氨酸全部被破壞。n堿水解：堿水解：5mol/L NaOH，充氮?dú)夂筇畛涔?，充氮?dú)夂筇畛涔埽?10水解水解22h，測(cè)定時(shí)，用測(cè)定時(shí)，用6mol/L鹽酸中和至鹽酸中和至pH6-7后測(cè)定，堿水解時(shí)，多數(shù)氨后測(cè)定，堿水解時(shí)，多數(shù)氨基酸破壞，基酸破壞，僅色氨酸穩(wěn)定，僅色氨酸穩(wěn)定，因此專(zhuān)用于色氨酸的測(cè)定。因此專(zhuān)用于色氨酸的測(cè)定。n磺酸水解：磺酸水解：4mol/L甲基磺酸，并加入色氨酸保護(hù)劑，