銀染聚丙烯酰胺檢測牙鲆微衛(wèi)星DNA實(shí)驗(yàn)方法的分析探討

1、銀染聚丙烯酰胺檢測牙鲆微衛(wèi)星DNA實(shí)驗(yàn)方法的分析探討杜爽 楊磊 仇雪梅摘要：為了篩選和檢測牙鲆種群中具有較好表現(xiàn)的微衛(wèi)星多態(tài)性,對聚丙烯酰胺凝膠及銀染方法進(jìn)行了選擇。經(jīng)過反復(fù)的實(shí)驗(yàn)，總結(jié)出了一套適用于牙鲆微衛(wèi)星檢測的方法。該方法具有靈敏度高、背景淺、污染小、條帶清晰等突出特點(diǎn),能有效地控制染色背景,顯著提高檢測分辨率,整個(gè)染色過程所需時(shí)間短,具有廣泛的推廣價(jià)值。關(guān)鍵詞:銀染;微衛(wèi)星;聚丙烯酰胺凝膠微衛(wèi)星DNA(microsatellite ) 又稱簡單序列重復(fù)(Sample Sequence Repeats ,SSR) ，一般以16 個(gè)堿基為核心序列，經(jīng)過多次的串聯(lián)重復(fù)組成的長達(dá)幾十個(gè)核苷酸的

2、序列1。與其它分子標(biāo)記相比，微衛(wèi)星標(biāo)記具有的優(yōu)點(diǎn):微衛(wèi)星標(biāo)記具有座位數(shù)目巨大并隨機(jī)分布于基因組中(內(nèi)含子、外顯子、基因間序列)、多態(tài)性豐富、共顯性遺傳方式、分析方法簡單、重復(fù)性好和近緣種中引物通用性高等優(yōu)點(diǎn),在動(dòng)物的群體遺傳分析、親子鑒定、基因組作圖和遺傳育種中得到了廣泛的應(yīng)用2 3。微衛(wèi)星PCR 產(chǎn)物的檢測方法主要有熒光標(biāo)記引物的測序法,同位素標(biāo)記引物的聚丙烯酰胺電泳法,以及銀染變性或非變性聚丙烯酰胺凝膠方法。目前很多國內(nèi)外的實(shí)驗(yàn)室都是通過PAGE-銀染的方法來鑒定微衛(wèi)星產(chǎn)物。在魚類微衛(wèi)星PCR產(chǎn)物的鑒定中，變性或非變性聚丙烯酰胺凝膠方法都有所報(bào)道4 5。本次實(shí)驗(yàn)，我們在應(yīng)用微衛(wèi)星標(biāo)記對牙鲆

3、群體的檢測工作中,對銀染聚丙烯胺凝膠電泳技術(shù)的最適條件進(jìn)行了探索,經(jīng)過多次實(shí)驗(yàn),最終研究找到了其最適條件，可以對牙鲆微衛(wèi)星DNA擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行更為準(zhǔn)確、可靠的鑒定分析。1. 材料和方法1.1 材料1.1.1 樣本大連海域牙鲆群體30尾,取其肌肉加入70%乙醇后放入-20保存?zhèn)溆谩?.1.2 微衛(wèi)星引物從NCBI上下載牙鲆微衛(wèi)星序列，經(jīng)過Primer 5設(shè)計(jì)引物，由上海生物工程技術(shù)服務(wù)公司合成引物，并按照說明溶解引物。1.2 方法1.2.1 基因組DNA的提取采用文獻(xiàn)6 的酚、氯仿法抽提牙鲆的基因組DNA ,得到的DNA加TE溶解后置-20 冰箱中備用。1.2.2 PCR反應(yīng)PCR反應(yīng)總體積為25

4、ul，內(nèi)含100ng的模板DNA，0.4umol/L的dNTPs，1.5mmol/L的Mg2+，1×PCR反應(yīng)緩沖液，0.25ulTapDNA聚合酶（Promega）。反應(yīng)在Eppendorf Mastercycler PCR擴(kuò)增儀上進(jìn)行。PCR反應(yīng)為30個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)包括94變性35s，退火30s，72延伸40s；首次循環(huán)前預(yù)變性5min，最后一次循環(huán)結(jié)束后72再延伸5min。1.2.3 聚丙烯酰胺凝膠的配制1.2.3.1 變性聚丙烯酰胺凝膠的配制表一 不同濃度變性聚丙烯酰胺凝膠的配方藥品與試劑 濃度 6% 濃度 4%尿素 12.6 (g) 12.6 (g) 雙蒸水 14.5 m

5、l 16 ml 10×TBE 1.5ml 1.5 ml40%丙烯酰胺溶液(38:2) 4.5ml 3ml 10%過硫酸胺溶液 200l 200l TEMED 15l 15l 總體積 30ml 30 ml1.2.3.2 非變性聚丙烯酰胺凝膠的配制表二 不同濃度非變性聚丙烯酰胺凝膠的配方藥品與試劑 濃度 8% 濃度 10% 濃度12%30%丙烯酰胺溶液(29:1) 8ml 10ml 12 ml5×TBE 6ml 6 ml 6ml雙蒸水 16ml 14ml 12 ml10%過硫酸胺溶液 200l 200l 200lTEMED 15l 15l 15l總體積 30ml 30 ml 3

6、0ml1.2.4 銀染液的配制固定液: 10%的乙醇溶液染色液:0. 1%AgNO3溶液和0.2% AgNO3溶液, 對比效果顯色液: 為對比效果,采用兩種顯色液配方第一種配方: 2g NaOH, 0.1g Na2CO3,加雙蒸水到250ml, 在加入800l 甲醛7第二種配方: 30g Na2CO3、1.5mL 37%甲醛、0.2mL Na2S2O3(10mg/mL),加雙蒸水至1000mL81.2.5 銀染法的操作步驟固定10min 水洗2次(每次30秒) 染色15min 水洗3次(每次不超過30s) 顯色(條帶清晰即可) 終止。2.結(jié)果2.1 非變性膠與變性PAGE膠的對比在凝膠電泳鑒定

7、微衛(wèi)星產(chǎn)物的過程中,變性與非變性聚丙烯酰胺凝膠法都有使用。雖然兩種PAGE膠檢測基因型結(jié)果完全一致,但有實(shí)驗(yàn)表明，兩種PAGE膠在條帶分離效果上略有區(qū)別9。本次實(shí)驗(yàn)對這兩種PAGE膠做了選擇比較，結(jié)果如圖一、二M 1 2 3 4非特異性帶非特異性帶目標(biāo)帶圖一 10%非變性PAGE膠M 1 2 3 4非特異性帶非特異性帶目標(biāo)帶圖二 6%變性PAGE膠從圖中可以看出，非變性PAGE膠和變性PAGE膠都能清楚的顯示目標(biāo)帶，且基因型相同。但是非變性PAGE膠帶型要比變性PAGE膠好，更清楚。而且變性PAGE膠制膠過程比非變性PAGE膠復(fù)雜，操作繁瑣。2.2 不同濃度的非變性PAGE膠的對比按照表二分別

8、配制8%、10%、12%的非變性PAGE膠用相同的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物分別點(diǎn)到三板不同濃度的膠上, 上樣量為6ul (其中上樣buffer 5l, PCR擴(kuò)增產(chǎn)物1l)，1×TBE，140V恒壓電泳5個(gè)小時(shí)(如圖三,四)。5， 4， 3， 2， 1， M 1 2 3 4 5 圖三 12%非變性PAGE膠 圖四 8%非變性PAGE膠從圖中可以看出濃度為12%的PAGE膠條帶較8%的清楚，10%、12%的沒有什么明顯差別。但由于12%的濃度大，電泳時(shí)間長，所以選擇濃度10%的聚丙烯酰胺膠。2.3 銀染方法的比較2.3.1 染色液的選擇將一板聚丙烯酰胺膠的點(diǎn)樣孔左右兩部分分別點(diǎn)上相同的PCR擴(kuò)增

9、產(chǎn)物，固定后將膠一分為二，分別放入0.1%和0.2 %的AgNO3溶液中，染色15分鐘，加入相同顯色液后，觀察其結(jié)果。結(jié)果顯示，0.2 %的AgNO3溶液反應(yīng)靈敏，5分鐘就會(huì)顯現(xiàn)條帶，但是背景較深，略帶墨綠色；0.1%AgNO3溶液12分鐘顯帶，雖然顯色時(shí)間比0.2 %的長，但背景較淺，呈現(xiàn)淡黃色。2.3.2 顯色液的選擇將一板聚丙烯酰胺膠的點(diǎn)樣孔左右兩部分分別點(diǎn)上相同的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，經(jīng)過固定、染色后，將膠一分為二，分別放入兩種不同的顯色液中（顯色液配方見1.2.4）。經(jīng)過反復(fù)的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，兩種顯色液都能顯現(xiàn)清晰的條帶，但第一種染色液靈敏度高，顏色略淺一些，而且所用試劑價(jià)格比較便宜。3討論3.

10、1 對非特異性條帶的思考聚丙烯酰胺凝膠的分辨率高，理論上能分開長度相差0.1%的DNA分子，但實(shí)際操作中，受到很多因素的影響。在銀染后的凝膠上除看到主帶外,還常伴隨著出現(xiàn)一些顯色較淺的非特異性帶,且不同的引物產(chǎn)生的非特異性帶不同。關(guān)于其的機(jī)制,Murray10等認(rèn)為是DNA 鏈復(fù)制過程中的滑動(dòng)錯(cuò)配造成的。非特異性帶的產(chǎn)生與模板和引物質(zhì)量、退火溫度、dNTP濃度、Taq DNA聚合酶的量、循環(huán)次數(shù)等諸多因素有關(guān)。本人通過多方面的摸索, 覺得減少循環(huán)次數(shù)，相對升高一些退火溫度和減少Taq DNA聚合酶的量是最有效的辦法。通過改變這些條件，取得了良好的效果,有時(shí)非特異性帶不能完全消除,但是它不會(huì)影響

11、等位基因的判定,因?yàn)樵谀程囟ǖ奈稽c(diǎn)上, 非特異性帶的帶型通常是固定的,并且銀染后主帶比非特異性帶清晰、易讀。3.2 非變性膠與變性PAGE膠的選擇曲魯江等9在對雞的研究中發(fā)現(xiàn)，變性與非變性聚丙烯酰胺凝膠對微衛(wèi)星產(chǎn)物進(jìn)行電泳時(shí)，二者對同一微衛(wèi)星PCR 產(chǎn)物的電泳結(jié)果有較大的差別,在非變性凝膠中條帶過于復(fù)雜,出現(xiàn)的非特異性條帶極大的影響了分析帶形的準(zhǔn)確性,從而使實(shí)驗(yàn)結(jié)果的誤差大大加大。但是在本研究中，對同一微衛(wèi)星PCR產(chǎn)物進(jìn)行了比較，并沒有發(fā)現(xiàn)較大的差別，都存在非特異性條帶。而且非變性PAGE膠顯示條帶的結(jié)果比變性PAGE膠的效果好。分析原因可能是研究對象不同，所以在分析結(jié)果上有所區(qū)別。3.3 染

12、色方法的探討聚丙烯酰胺凝膠電泳后，可以用溴化乙錠（EB）染色。由于EB染色的靈敏度不夠高，對微量DNA片段的分析不太適用。另外，EB是致癌物，給實(shí)驗(yàn)操作帶來很多不必要的麻煩。因此，本次研究采用銀染的方法。該法既經(jīng)濟(jì)、簡便、快速、靈敏,又具有無污染、分辨率高、結(jié)果可永久保存等優(yōu)點(diǎn)，是一種檢測微量DNA的理想方法11。在實(shí)驗(yàn)中有時(shí)也會(huì)遇到條帶不清楚、背景發(fā)黃，顏色過深等問題。這與AgNO3溶液的濃度，顯色液的配制，清洗水的質(zhì)量、染色時(shí)間的長短等有關(guān)。在實(shí)際進(jìn)行實(shí)驗(yàn)時(shí)，要摸索條件，使其達(dá)到最佳狀態(tài)。4結(jié)論本人經(jīng)過多次實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，采用10%的非變性聚丙烯酰胺膠，0.1%的AgNO3溶液染色15分鐘,2g

13、 NaOH, 0.1g Na2CO3,加雙蒸水到250ml, 在加入800l 甲醛作為顯色液，這種方法對于牙鲆微衛(wèi)星的分離最為有效。5參考文獻(xiàn)1 Beckmann J S , Soller M. Toward a Unified approach to genetic mapping of evkaryotes based on sequence tagged microsatellite sites J . Bio Technology , 1990 , 8 : 930 - 932.2 Pang , Ritland , Carlson , et al . Japanese quail mic

14、rosatellite loci amplified with chicken-specific primers J . Animal Genetics , 1999 , 30 : 195 - 199.3 OConnell M , Wright J M. Microsatellite DNA in fishes J . Reviews in Fish Biology and Fisheries , 1997-7 : 331-363. 4 朱彩艷 , 葉衛(wèi), 夏軍紅,鯪微衛(wèi)星引物的鑒定及其適用性檢驗(yàn)，南方水產(chǎn)，2007，3（2），15-195 匡友誼,佟廣香,尹家勝, 呼瑪河哲羅魚遺傳多樣性的A

15、FLP 分析，中國水產(chǎn)科學(xué)，2007，14（4）：615-6216J . 薩姆布魯克,D. W. 拉塞爾著1 黃培堂等譯. 分子克隆實(shí)驗(yàn)指南 M . 第3 版. 北京:科學(xué)出版社,2002. 467 - 470.7 SANGUINETTI C J,DIAS NETO E,SIMPSON A J. Rapid silver staining and recovery of PCR products separated on polyacrylamide gels J. Biotechniques, 1994, 17(5):914- 921.8 BASSAM B J, CAETANO- ANOLLES G,GRESSHOFF P M. Fast and sensitive silver staining of DNA in polyacryamid gels J. Anal Biochem, 1991, 196:80- 83.9 曲魯江，李顯耀,杜志強(qiáng)，微衛(wèi)星PCR產(chǎn)物變性與非變性PAGE銀染檢測方法的比較，遺傳， 2004，26 (4) :522524 10 MURR