微生物菌種 高通量篩選技術(shù) 與裝置ppt課件

1、 國(guó)家生化工程技術(shù)研究中心國(guó)家生化工程技術(shù)研究中心()()2011.11.242011.11.24微生物菌種高通量篩選技術(shù)與裝置微生物菌種高通量篩選技術(shù)與裝置內(nèi)容提綱內(nèi)容提綱n 高通量篩選在微生物育種中的重要意義高通量篩選在微生物育種中的重要意義 n 菌種高通量篩選技術(shù)與裝備菌種高通量篩選技術(shù)與裝備國(guó)際進(jìn)展國(guó)際進(jìn)展n 高通量篩選技術(shù)應(yīng)用示范高通量篩選技術(shù)應(yīng)用示范高通量篩選在微生物育種中的重要意義高通量篩選在微生物育種中的重要意義 1、菌種是發(fā)酵技術(shù)的源頭菌種是發(fā)酵技術(shù)的源頭2、菌種是發(fā)酵技術(shù)的核心之核心、菌種是發(fā)酵技術(shù)的核心之核心3、菌種提高不增加設(shè)備材料投入、菌種提高不增加設(shè)備材料投入 菌種

2、發(fā)酵水平是企業(yè)產(chǎn)品市場(chǎng)競(jìng)爭(zhēng)力的體現(xiàn)菌種發(fā)酵水平是企業(yè)產(chǎn)品市場(chǎng)競(jìng)爭(zhēng)力的體現(xiàn)青霉素：5萬(wàn)12萬(wàn) u/ml（國(guó)內(nèi)） 8萬(wàn)20萬(wàn) u/ml（國(guó)外）紅霉素：50008000/10000 u/ml（國(guó)內(nèi)） 1000015000 u/ml（國(guó)外）阿維菌素：40008400 u/ml（國(guó)內(nèi)） 10000 u/ml 以上（國(guó)外）案案例例 育種工作中兩大任務(wù)：突變突變與與篩選篩選高通量篩選在微生物育種中的重要意義高通量篩選在微生物育種中的重要意義變異變異菌種庫(kù)篩選篩選目標(biāo)株自然選育人工誘變推理選育雜交育種基因工程代謝工程各種組學(xué)系統(tǒng)生物學(xué)合成生物學(xué)特異性模型篩選量突變僅是前提篩選才是關(guān)鍵 我國(guó)現(xiàn)有菌種篩選儀器裝備

3、與技術(shù)國(guó)際相比存在巨大差距 我國(guó)：傳統(tǒng)方法，篩選方式半個(gè)世紀(jì)沒(méi)有明顯改進(jìn) 國(guó)際：高通量篩選技術(shù)(High throughput screening, HTS) 高通量篩選在微生物育種中的重要意義高通量篩選在微生物育種中的重要意義 Traditional screeningHigh throughput screeningFlask/tube (single)Microtiter plate (12、24、48、96、384、1536)Volume (10-50 ml)Volume (10-500 l)Screen 20-50/week/labScreen 1000-10000/week/lab

4、Manual AutomaticLaborious Laborsaving Series Parallel 內(nèi)容提綱內(nèi)容提綱n 高通量篩選在微生物育種中的重要意義高通量篩選在微生物育種中的重要意義 n 菌種高通量篩選技術(shù)與裝備國(guó)際進(jìn)展菌種高通量篩選技術(shù)與裝備國(guó)際進(jìn)展n高通量篩選技術(shù)應(yīng)用示范高通量篩選技術(shù)應(yīng)用示范1929，1940s-1950sPfizer公司：土霉素的發(fā)現(xiàn)p56名科學(xué)家、10萬(wàn)份土樣、歷時(shí)1年p25%市場(chǎng)1984年，Pfizer提出Automation Project.1990年，在Nagoya, Japan實(shí)施p1萬(wàn)株份/周高通量篩選技術(shù)的起源高通量篩選技術(shù)的起源 微生物菌種

5、篩選一般流程 概率事件菌種高通量篩選技術(shù)與裝備國(guó)際進(jìn)展菌種高通量篩選技術(shù)與裝備國(guó)際進(jìn)展通量限制步驟誘變等誘變等10倍稀釋倍稀釋涂平板涂平板單菌落單菌落初篩初篩復(fù)篩復(fù)篩驗(yàn)證驗(yàn)證工業(yè)應(yīng)用工業(yè)應(yīng)用接種到接種到多孔板多孔板倒平板倒平板培養(yǎng)基培養(yǎng)基保藏保藏活化活化前處理前處理檢測(cè)檢測(cè)出發(fā)菌株出發(fā)菌株微生物菌種篩選儀器裝備發(fā)展趨勢(shì)： 自動(dòng)化、微型化、高通量培養(yǎng)基滅菌、分裝；倒平板；挑取單菌落、接種；培養(yǎng)；目的產(chǎn)物抽提；測(cè)定；數(shù)據(jù)收集處理等過(guò)程 單元自動(dòng)化與系統(tǒng)集成自動(dòng)化（通量匹配）菌種高通量篩選技術(shù)與裝備國(guó)際進(jìn)展菌種高通量篩選技術(shù)與裝備國(guó)際進(jìn)展Filling Unit分裝速率：400 - 1200 dis

6、hes/h分裝量：4 - 45 ml/0.5 - 0.6 sec平動(dòng)規(guī)格：直徑92 - 98 mm可調(diào)高度15 - 21 mm可調(diào)滅菌方式：253.7 nm 紫外線滅菌尺寸重量：45 cm(L)*30 cm(D)*61cm(H),15 kg Stacking Unit堆疊速率：可調(diào)，與輸送機(jī)自動(dòng)配合。 堆疊高度：2 - 15板平皿，可調(diào)堆疊桌面：500 500 mm可擴(kuò)充尺寸重量：81cm(L)*49cm(D)*45cm(H),13kg誘變等誘變等10倍稀釋倍稀釋涂平板涂平板單菌落單菌落初篩初篩復(fù)篩復(fù)篩驗(yàn)證驗(yàn)證工業(yè)應(yīng)用工業(yè)應(yīng)用接種到接種到多孔板多孔板倒平板倒平板培養(yǎng)基培養(yǎng)基保藏保藏活化活化前處

7、理前處理檢測(cè)檢測(cè)出發(fā)菌株出發(fā)菌株全自動(dòng)培養(yǎng)基分裝系統(tǒng)全自動(dòng)培養(yǎng)基分裝系統(tǒng)750皿/小時(shí)自動(dòng)滅菌培養(yǎng)基制備機(jī)自動(dòng)滅菌培養(yǎng)基制備機(jī) 出發(fā)株出發(fā)株誘變等誘變等10倍稀釋倍稀釋涂平板涂平板單菌落單菌落初篩初篩復(fù)篩復(fù)篩工藝工藝放大放大接種接種倒平板倒平板培養(yǎng)基培養(yǎng)基保藏保藏活化活化前處理前處理檢測(cè)檢測(cè)自動(dòng)細(xì)菌平板稀釋儀自動(dòng)細(xì)菌平板稀釋儀 4600個(gè)克隆/小時(shí)誘變等誘變等10倍稀釋倍稀釋涂平板涂平板單菌落單菌落初篩初篩復(fù)篩復(fù)篩驗(yàn)證驗(yàn)證工業(yè)應(yīng)用工業(yè)應(yīng)用接種到接種到多孔板多孔板倒平板倒平板培養(yǎng)基培養(yǎng)基保藏保藏活化活化前處理前處理檢測(cè)檢測(cè)出發(fā)菌株出發(fā)菌株培養(yǎng)培養(yǎng)出發(fā)株出發(fā)株誘變等誘變等10倍稀釋倍稀釋涂平板涂平

8、板單菌落單菌落初篩初篩復(fù)篩復(fù)篩工藝工藝放大放大接種接種倒平板倒平板培養(yǎng)基培養(yǎng)基保藏保藏活化活化前處理前處理檢測(cè)檢測(cè)出發(fā)株出發(fā)株誘變等誘變等10倍稀釋倍稀釋涂平板涂平板單菌落單菌落初篩初篩復(fù)篩復(fù)篩工藝工藝放大放大接種接種倒平板倒平板培養(yǎng)基培養(yǎng)基保藏保藏活化活化前處理前處理檢測(cè)檢測(cè)培養(yǎng)基分裝培養(yǎng)基分裝傳統(tǒng)方法傳統(tǒng)方法誘變等誘變等10倍稀釋倍稀釋涂平板涂平板單菌落單菌落初篩初篩復(fù)篩復(fù)篩驗(yàn)證驗(yàn)證工業(yè)應(yīng)用工業(yè)應(yīng)用接種到接種到多孔板多孔板倒平板倒平板培養(yǎng)基培養(yǎng)基保藏保藏活化活化前處理前處理檢測(cè)檢測(cè)出發(fā)菌株出發(fā)菌株高通量方法：高通量方法：96、384、1536/min傳統(tǒng)方法：傳統(tǒng)方法：1-2/min（分光

9、光度計(jì)）（分光光度計(jì)）1/15-30min（HPLC）傳統(tǒng)方法傳統(tǒng)方法出發(fā)株出發(fā)株誘變等誘變等10倍稀釋倍稀釋涂平板涂平板單菌落單菌落初篩初篩復(fù)篩復(fù)篩驗(yàn)證驗(yàn)證放大放大接種接種倒平板倒平板培養(yǎng)基培養(yǎng)基保藏保藏活化活化前處理前處理檢測(cè)檢測(cè)培養(yǎng)基分裝培養(yǎng)基分裝1 微孔板式反應(yīng)器微孔板式反應(yīng)器2 微流控式芯片實(shí)驗(yàn)室微流控式芯片實(shí)驗(yàn)室3 搖瓶形式的微型反應(yīng)器搖瓶形式的微型反應(yīng)器1 232056 valves , 256 compartments containing bacterial expressing an enzyme24個(gè)，個(gè)，5ml12個(gè)，個(gè)，30ml24個(gè)，個(gè)，1ml多通道多參數(shù)多通道多參

10、數(shù)微型反應(yīng)器微型反應(yīng)器 動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)用微型反應(yīng)器左圖4.92.32.2 m，整個(gè)箱體有溫濕度控制，箱體內(nèi)，條形碼閱讀器、蓋板站、封板器、液體處理裝置、搖床、光度計(jì)、離心機(jī)、冷藏室等。平行地實(shí)現(xiàn)樣品準(zhǔn)備、運(yùn)行、監(jiān)控768個(gè)（16個(gè)48孔板）。系統(tǒng)集成自動(dòng)化：四個(gè)層次系統(tǒng)集成自動(dòng)化：四個(gè)層次OrbitorOrbitor工作站工作站n重量輕重量輕nonly 55 lbs. 只有25公斤n高可靠性高可靠性nCollision detection & recovery沖突檢測(cè)與恢復(fù)nPlate sensing in the gripper微孔板傳感器nServo gripper does not

11、 drop a plate when the power goes out!伺服抓板手- 即使停電也不會(huì)讓一個(gè)板子掉落n運(yùn)送一塊板子只需運(yùn)送一塊板子只需4秒鐘秒鐘nBi-directional telescoping arm雙向伸縮手nUnlimited 3600 rotation無(wú)限360度轉(zhuǎn)動(dòng)oNo hard stops無(wú)急停死角nMotion blending運(yùn)動(dòng)混合osmooth movements平穩(wěn)移動(dòng)Orbitor結(jié)構(gòu)剖解nBi-directional telescoping arm雙向伸縮抓板手nRotating base旋轉(zhuǎn)平臺(tái)nInternal re-grip內(nèi)部固定裝置n

12、Hotel mount x4 板子堆棧*41.4.3.2.操作靈活性nPC driven微機(jī)控制nNo controller required無(wú)需其它控制裝置nAdd-on storage capability可搭配存儲(chǔ)能力nSmall footprint小的占地空間和軌跡nFeed up to 4 instruments with ease可連接4臺(tái)儀器nFits within a wide variety of bio safety cabinets適應(yīng)多種型號(hào)的生物安全柜內(nèi)容提綱內(nèi)容提綱n 高通量篩選在微生物育種中的重要意義高通量篩選在微生物育種中的重要意義 n 菌種高通量篩選技術(shù)國(guó)際進(jìn)

13、展菌種高通量篩選技術(shù)國(guó)際進(jìn)展n 高通量篩選技術(shù)應(yīng)用示范高通量篩選技術(shù)應(yīng)用示范高通量篩選技術(shù)高通量篩選技術(shù)Scale upScale down微型化微型化高通量高通量標(biāo)準(zhǔn)化標(biāo)準(zhǔn)化對(duì)高通量篩選技術(shù)存在認(rèn)識(shí)上的誤區(qū)對(duì)高通量篩選技術(shù)存在認(rèn)識(shí)上的誤區(qū)n認(rèn)為微型化只要按比例縮小即可，忽略參數(shù)相關(guān)性問(wèn)題；對(duì)操作條件的平行性沒(méi)有足夠的認(rèn)識(shí)n僅注重培養(yǎng)環(huán)節(jié)高通量，忽略其他步驟匹配和瓶頸的轉(zhuǎn)移問(wèn)題n對(duì)標(biāo)準(zhǔn)化重于最優(yōu)化的認(rèn)識(shí)不足n高通量篩選是提高成功幾率的一種技術(shù)手段. .菌種高通量篩選技術(shù)組成菌種高通量篩選技術(shù)組成高通量高通量前處理技術(shù)前處理技術(shù)高通量高通量培養(yǎng)技術(shù)培養(yǎng)技術(shù)高通量液體高通量液體處理技術(shù)處理技術(shù)高通

14、量高通量轉(zhuǎn)接種技術(shù)轉(zhuǎn)接種技術(shù)高通量克隆高通量克隆制備技術(shù)制備技術(shù)菌種庫(kù)菌種庫(kù)管理技術(shù)管理技術(shù)高通量數(shù)據(jù)高通量數(shù)據(jù)管理技術(shù)管理技術(shù)高通量分析高通量分析檢測(cè)技術(shù)檢測(cè)技術(shù)菌種高通量菌種高通量篩選技術(shù)篩選技術(shù)分析測(cè)試分析測(cè)試高通量培養(yǎng)高通量培養(yǎng)菌種資源菌種資源菌種高通量篩選技術(shù)菌種高通量篩選技術(shù)通量匹配通量匹配限制瓶頸在不斷克服和轉(zhuǎn)移限制瓶頸在不斷克服和轉(zhuǎn)移菌種高通量篩選技術(shù)F菌種高通量篩選技術(shù)是一整套高通量技術(shù)的有機(jī)整合和合理匹配紅霉素生產(chǎn)菌株的微型化培養(yǎng)及分析紅霉素生產(chǎn)菌株的微型化培養(yǎng)及分析菌落庫(kù)菌落庫(kù)孔板培養(yǎng)孔板培養(yǎng)離心離心移液移液檢測(cè)檢測(cè)高通量高通量微型化培養(yǎng)n就搖瓶與微孔板之間的生理發(fā)酵參數(shù)

15、和動(dòng)力學(xué)參數(shù)進(jìn)行了研究，以證實(shí)微型化培養(yǎng)方法的可行性，為紅霉素產(chǎn)生菌高通量篩選奠定了基礎(chǔ)。微型化培養(yǎng)-動(dòng)力學(xué)參數(shù)比較動(dòng)力學(xué)參數(shù)比較t1t2t3t4t5t6搖瓶搖瓶3031282920342237283012孔板孔板(2.5ml)897861859911932887搖瓶搖瓶12孔微孔板孔微孔板kLa（h-1）10528842.1 氧氣傳遞系數(shù)氧氣傳遞系數(shù)2.2物料混合物料混合流場(chǎng)特性流場(chǎng)特性O(shè)TR 與混合三、三、國(guó)家生化工程中心的高通量篩選工作基礎(chǔ)國(guó)家生化工程中心的高通量篩選工作基礎(chǔ)微型化培養(yǎng)-發(fā)酵參數(shù)比較發(fā)酵參數(shù)比較 2.3 生物效價(jià)生物效價(jià)2.4 總糖的對(duì)應(yīng)性實(shí)驗(yàn)總糖的對(duì)應(yīng)性實(shí)驗(yàn) 微型化培養(yǎng)

16、-發(fā)酵參數(shù)比較發(fā)酵參數(shù)比較 2.5 還原糖的對(duì)應(yīng)性實(shí)驗(yàn)還原糖的對(duì)應(yīng)性實(shí)驗(yàn)2.6生物量生物量微型化培養(yǎng)-裝置圖種子（挖塊）種子（挖塊）發(fā)酵（孔徑發(fā)酵（孔徑2cm） 微型化分析n建立與微型化發(fā)酵培養(yǎng)配套的檢測(cè)方法，才能真正意義上實(shí)現(xiàn)篩選的高通量。n生物檢測(cè)法生物檢測(cè)法n化學(xué)檢測(cè)法化學(xué)檢測(cè)法生物檢測(cè)法生物檢測(cè)法n生物檢定法又分管碟法和比濁法兩種，管碟法是最常用的生物檢定法，也是我國(guó)2005版之前藥典收錄的唯一一種微生物檢定法。n與管碟法比較，比濁法具有快速(檢驗(yàn)僅需34 h) 、易于操作、采用液體培養(yǎng)法、無(wú)擴(kuò)散因素影響、靈敏度高和精密度較好等優(yōu)點(diǎn)，適用于絕大部分抗生素和含抗生素樣品的含量測(cè)定?；瘜W(xué)檢

17、測(cè)法化學(xué)檢測(cè)法n紅霉素分子在酸性條件下水解生成黃色絡(luò)合物，此顏色與含量成正比，符合朗格爾比色定律。紅霉素檢測(cè)方法紅霉素檢測(cè)方法微型化分析-生物檢測(cè)法生物檢測(cè)法微量比濁法測(cè)定紅霉素生物效價(jià)的可行性微量比濁法測(cè)定紅霉素生物效價(jià)的可行性 微型化分析-生物檢測(cè)法生物檢測(cè)法微型化分析-生物檢測(cè)法生物檢測(cè)法123456789101112A0.3300.3310.3310.3300.3310.3300.3310.3320.3310.3310.3310.330B0.3320.3330.3330.3320.3320.3330.3330.3330.3330.3330.3320.332C0.3310.3320.33

18、20.3320.3320.3320.3330.3330.3320.3320.3320.331D0.3320.3330.3340.3330.3330.3330.3340.3340.3330.3330.3330.332E0.3320.3330.3330.3330.3330.3330.3340.3330.3330.3340.3330.332F0.3330.3340.3340.3340.3330.3330.3340.3360.3340.3330.3330.333G0.3330.3330.3340.3340.3330.3330.3340.3340.3340.3340.3340.333H0.3330.33

19、30.3330.3330.3330.3330.3330.3330.3330.3330.3330.333準(zhǔn)確度：準(zhǔn)確度：1.5% 精密度：精密度：0.005 相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)：1.48%檢驗(yàn)檢驗(yàn)96孔板的準(zhǔn)確度與精密度孔板的準(zhǔn)確度與精密度 微型化分析-化學(xué)檢測(cè)法檢測(cè)法紅霉素化學(xué)效價(jià)測(cè)定結(jié)果比較紅霉素化學(xué)效價(jià)測(cè)定結(jié)果比較微型化分析-化學(xué)檢測(cè)法檢測(cè)法樣品前處理對(duì)紅霉素效價(jià)檢測(cè)的影響分析樣品前處理對(duì)紅霉素效價(jià)檢測(cè)的影響分析微型化分析-化學(xué)檢測(cè)法檢測(cè)法高通量化學(xué)檢測(cè)方法驗(yàn)證高通量化學(xué)檢測(cè)方法驗(yàn)證標(biāo)準(zhǔn)品加入法是在樣品溶液中加入一系列梯度標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行顯色測(cè)定，然后按照繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線的步驟測(cè)定

20、吸光度,繪制吸光度-加入濃度曲線,用外推法求得樣品溶液的濃度。兩條直線切入橫座標(biāo)上所間的距離，即是樣品中紅霉素的化學(xué)效價(jià)，為47.8 /ml，標(biāo)準(zhǔn)曲線法測(cè)定的結(jié)果為48.02/ml，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.00324Y1=0.0046X- 0.0164Y2=0.0046X+0.2202高通量（微型化）抗生素效價(jià)分析方法高通量（微型化）抗生素效價(jià)分析方法生物效價(jià)高通量分析方法：生物效價(jià)高通量分析方法： 基于比濁法原理設(shè)計(jì)生物效價(jià)高通量分析方法，使分析時(shí)間從20多小時(shí)縮短到4小時(shí)，分析樣品量從1ml降到10ul，鑒定菌培養(yǎng)基從30ml降到90ul，一次檢測(cè)樣品數(shù)量可達(dá)到成百上千份，而且僅需1人操作，傳統(tǒng)生物效價(jià)分析，每天每人