氣虛血瘀型Corti器毛細(xì)胞損傷動(dòng)物模型的建立

1、www.CRTER.org彭桂原，等. 氣虛血瘀型Corti器毛細(xì)胞損傷動(dòng)物模型的建立氣虛血瘀型Corti器毛細(xì)胞損傷動(dòng)物模型的建立彭桂原，李松鍵，楊 黎，楊朝杰，譚 串(廣東省中醫(yī)院耳鼻喉科，廣東省廣州市 510120)引用本文：彭桂原，李松鍵，楊黎，楊朝杰，譚串. 氣虛血瘀型Corti器毛細(xì)胞損傷動(dòng)物模型的建立J.中國(guó)組織工程研究，2016，20(49):7384-7390.DOI: 10.3969/j.issn.2095-4344.2016.49.013 ORCID: 0000-0003-3873-0845(彭桂原)文章快速閱讀：改良耗氣破氣加饑飽失常+光化學(xué)反應(yīng)法復(fù)制氣虛血瘀型Cort

2、i器毛細(xì)胞損傷豚鼠模型彭桂原，女，1973年生，廣西壯族自治區(qū)南寧市人，廣州中醫(yī)藥大學(xué)畢業(yè)，博士，碩士生導(dǎo)師，副教授，主要從事鼻咽癌的中西醫(yī)結(jié)合治療研究。中圖分類號(hào):R318文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:B文章編號(hào):2095-4344(2016)49-07384-07稿件接受：2016-09-07光化學(xué)反應(yīng)法再?gòu)?fù)制耳蝸微循環(huán)障礙模型正常對(duì)照組不干預(yù)造模組破氣加饑飽失常法處理15 d觀察指標(biāo)：(1)動(dòng)物外觀(2)血清D-木糖濃度(3)耳聲發(fā)射DPOAE測(cè)試幅值(4)耳蝸病理檢查文題釋義：氣虛血瘀：為虛實(shí)夾雜之中醫(yī)證型，以氣虛與血瘀證候同時(shí)并見(jiàn)為特點(diǎn)。其病因病機(jī)為各種原因?qū)е屡K腑氣機(jī)衰弱，氣虛無(wú)力推動(dòng)血行，血行不暢

3、而形成瘀滯?；颊叱Ｓ忻嫔祝砭敕α?，少氣懶言的氣虛之證；兼有瘀血內(nèi)阻，血行緩慢，瘀阻絡(luò)脈之表現(xiàn)，如疼痛、面色晦滯等，甚至出現(xiàn)臟器的微循環(huán)障礙。Corti器：又稱螺旋器，為聽(tīng)覺(jué)感受器，位于內(nèi)耳膜迷路蝸管基底膜上，其感覺(jué)細(xì)胞為內(nèi)、外毛細(xì)胞，支持細(xì)胞為柱細(xì)胞、內(nèi)指細(xì)胞、Deiter細(xì)胞、內(nèi)緣細(xì)胞、Hensen細(xì)胞和Claudius細(xì)胞等。其蓋膜附著在毛細(xì)胞和Hensen細(xì)胞上面，毛細(xì)胞底部有神經(jīng)纖維發(fā)出連接螺旋神經(jīng)節(jié)，Corti器將內(nèi)淋巴震動(dòng)的機(jī)械能轉(zhuǎn)化電能即神經(jīng)沖動(dòng)，通過(guò)神經(jīng)傳導(dǎo)通路上傳至大腦皮質(zhì)聽(tīng)覺(jué)中樞從而產(chǎn)生聽(tīng)覺(jué)。摘要背景：隨著中醫(yī)藥對(duì)耳鳴耳聾的療效越來(lái)越受到重視，但對(duì)其機(jī)制尚缺乏系統(tǒng)深入

4、的研究，利用動(dòng)物模型進(jìn)行中醫(yī)藥治療耳鳴耳聾的機(jī)制探索是非常有意義的研究方向。目的：建立一種氣虛血瘀證型的Corti器毛細(xì)胞損傷動(dòng)物(豚鼠)模型并評(píng)價(jià)其效果。方法：12只成年豚鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為正常對(duì)照組和造模組。造模組首先采用改良耗氣破氣加饑飽失常法處理15 d進(jìn)行氣虛造模，之后以光化學(xué)反應(yīng)法復(fù)制血瘀Corti器毛細(xì)胞損傷模型；正常對(duì)照組不干預(yù)。造模后檢測(cè)兩組豚鼠血清的D-木糖濃度，行耳聲發(fā)射DPOAE測(cè)試，并觀察光鏡下耳蝸組織形態(tài)。結(jié)果與結(jié)論：與正常對(duì)照組相比，造模組血清D-木糖濃度較低(P < 0.01)；耳聲發(fā)射DPOAE測(cè)試結(jié)果顯示，造模組1 560，3 125 Hz DPOA

5、E幅值較正常對(duì)照組及造模前降低(P < 0.01)；造模組耳蝸組織形態(tài)發(fā)生變化：螺旋韌帶、基底膜微血管及蝸軸毛細(xì)血管內(nèi)有血管擴(kuò)張、微血栓形成，血管紋水腫變性；Corti 器內(nèi)毛細(xì)胞變性、壞死或缺失；提示：模型成功模擬了豚鼠氣虛血瘀型Corti器毛細(xì)胞損傷的過(guò)程，未來(lái)可應(yīng)用于中醫(yī)藥治療耳鳴耳聾特別是突發(fā)性耳聾的機(jī)制研究。關(guān)鍵詞：實(shí)驗(yàn)動(dòng)物；細(xì)胞損傷與修復(fù)模型；氣虛血瘀；Corti器毛細(xì)胞損傷；豚鼠；動(dòng)物模型主題詞：毛細(xì)胞, 聽(tīng)覺(jué)；Corti器；耳鳴；豚鼠；模型，動(dòng)物；組織工程基金資助：廣東省科技廳項(xiàng)目(2013-163)3 P.O.Box 1200,Shenyang 110004 kf233

6、85083Establishing hair cell damage model in the animal Corti organ with Qi deficiency and blood stasisPeng Gui-yuan, Li Song-jian, Yang Li, Yang Chao-jie, Tan Chuan (Department of Otolaryngology, Traditional Chinese Medicine Hospital of Guangdong Province, Guangzhou 510120, Guangdong Province, China

7、)AbstractBACKGROUND: Traditional Chinese medicine holds therapeutic potential for deafness and tinnitus, but there is a lack of in-depth research about the underlying mechanism, so establishing an animal model maybe helpful to explore the mechanism.OBJECTIVE: To establish hair cell damage model in t

8、he Corti organ with Qi deficiency and blood stasis in guinea pigs, and to assess its effects. METHODS: Twelve adult guinea pigs were randomly divided into normal control and model groups by random number table method. Guinea pigs in the model group were firstly treated with the modified relieving st

9、agnated Qi and abnormal starvation for 15 days to model Qi deficiency, and then stimulated hair cell damage with blood stasis by photochemical induction. The controls received no intervention. Subsequently, the detection of serum D-xylose content and DPOAE test were performed, and the cochlea morpho

10、logy was observed under light microscope.RESULTS AND CONCLUSION: (1) The serum D-xylose content in the model group was significantly lower than that in the normal control group (P < 0.01). (2) DPOAE test revealed that the amplitudes of 1 560 and 3 125 Hz in the model group were lower than those i

11、n the normal control group and before modeling (P < 0.01). (3) In the model group, hemangiectasis and microthrombosis appeared in the spiral ligament, microvascular basement membrane and modiolus capillaries, and stria vascularis presented edema and degeneration; degeneration, necrosis or loss of

12、 hair cells were visible in the Corti organ. (4) To conclude, the model of hair cell damage in the guinea pig with Qi deficiency and blood stasis is established successfully, which will provide a research tool for figuring out the mechanism underlying the traditional Chinese medicine for treating de

13、afness and tinnitus, especially sudden hearing loss.Subject headings: Hair Cells, Auditory; Organ of Corti; Tinnitus; Guinea Pigs; Models, Animal; Tissue EngineeringFunding: the Project of Science and Technology Commission of Guangdong Province, China, No.2013-163Cite this article: Peng GY, Li SJ, Y

14、ang L, Yang CJ, Tan C. Establishing hair cell damage model in the animal Corti organ with Qi deficiency and blood stasis. Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu. 2016;20(49):7384-7390.Peng Gui-yuan, M.D., Masters supervisor, Associate professor, Department of Otolaryngology, Traditional Chinese Medicine Ho

15、spital of Guangdong Province, Guangzhou 510120, Guangdong Province, China7387ISSN 2095-4344 CN 21-1581/R CODEN: ZLKHAH0 引言 Introduction人們?cè)谔剿骷膊“l(fā)生發(fā)展規(guī)律及治療的過(guò)程中，很多試驗(yàn)在倫理和方法上會(huì)受到或多或少的限制，因此，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究中，越來(lái)越多的人借助動(dòng)物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ瓦M(jìn)行研究。耳鳴耳聾是耳鼻喉科的常見(jiàn)病及疑難病，在其機(jī)制及防治上尚存在著許多爭(zhēng)論。在耳聾動(dòng)物模型的研究中有多種造模的方法，較常用的方法為應(yīng)用具有耳毒性的藥物進(jìn)行造模，可選用慶大霉素1、新霉素2、環(huán)

16、磷酰胺3、順鉑等4。閆輝等5利用硫酸卡那霉素與呋塞米聯(lián)合用藥建立藥物快速致聾大鼠動(dòng)物模型，結(jié)果發(fā)現(xiàn)腹腔用藥24 h后大鼠ABR反應(yīng)閾明顯增高，大鼠耳蝸底回毛細(xì)胞的明顯缺失。此外，還有應(yīng)用噪聲致聾的方法造模6。隨著耳聾的遺傳學(xué)研究不斷深入，對(duì)遺傳性耳聾動(dòng)物模型的需求也不斷增多，段宏等7還應(yīng)用CRISPR/ Cas系統(tǒng)介導(dǎo)的基因靶向修飾技術(shù)建立了耳聾動(dòng)物模型。但這些常用的耳聾動(dòng)物模型從病因上來(lái)看并不是突發(fā)性耳聾的常見(jiàn)病因。突發(fā)性耳聾又稱特發(fā)性突聾，患者可出現(xiàn)不同程度的Corti器毛細(xì)胞損傷，就中醫(yī)病因病機(jī)而言，氣虛血瘀證為常見(jiàn)的證型之一8-9。中醫(yī)中藥在耳鳴耳聾方面有較好的療效，為進(jìn)一步研究中醫(yī)中

17、藥治療耳鳴耳聾的作用機(jī)制，建立符合中醫(yī)證型的動(dòng)物模型尤為重要。相關(guān)的研究有：于秀華等10采用強(qiáng)迫游泳法復(fù)制氣虛血瘀證動(dòng)物模型；朱傳武等11應(yīng)用機(jī)械開(kāi)顱電凝+術(shù)后電脈沖刺激法復(fù)制氣虛血瘀證腦缺血大鼠動(dòng)物模型；楊碩等12采用冠狀動(dòng)脈結(jié)扎術(shù)配合饑餓、游泳等方法造成氣虛血瘀證慢性心衰的動(dòng)物模型；馮玄超等13也采用左冠狀動(dòng)脈前降支高位結(jié)扎法復(fù)制大鼠慢性心衰模型，并在術(shù)后分別進(jìn)行游泳力竭實(shí)驗(yàn)、曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)以建立氣虛血瘀證慢性心衰大鼠模型；楊衛(wèi)平等14以力竭游泳+皮下注射腎上腺素法復(fù)制心肌缺血大鼠氣虛血瘀證動(dòng)物模型；易亞喬等15利用“勞則傷氣”原理在對(duì)大鼠進(jìn)行力竭游泳訓(xùn)練后再行2-VO法以建立血管性癡呆氣虛血瘀

18、證大鼠模型；楊洪雁等16采用“饑餓+高脂+腎上腺素”復(fù)合多因素制備氣虛血瘀證模型；王鍵等17用饑餓、疲勞、寒濕、驚恐、高脂飲食等多因素復(fù)合方法建立氣虛血瘀證老年大鼠模型；王凈凈等18采用饑餓、高脂飼料、旋轉(zhuǎn)、頸椎旁注射硬化劑復(fù)合方法復(fù)制氣虛血瘀證血管性眩暈家兔模型；成映霞等19給大鼠飲用甲基硝基亞硝基胍溶液+饑飽失常喂養(yǎng)+鹽酸雷尼替丁灌胃建立氣虛血瘀型萎縮性胃炎大鼠模型。在中醫(yī)氣虛證研究方面，李軍蘭等20對(duì)1990年以來(lái)動(dòng)物模型中氣虛證的造模方法進(jìn)行了歸納，分析了多種造模方法，如疲勞法、限制日攝食量法、單純?yōu)a下法、耗氣破氣、苦寒瀉下加耗氣破氣降氣、偏食苦昧、食醋、煙熏法、化療藥物、X射線照射、

19、手術(shù)、失血等，結(jié)果發(fā)現(xiàn)造模方法多樣，總體上以疲勞法為主，“勞則耗氣”，此法符合中醫(yī)理論，在此基礎(chǔ)上加以限食、瀉下，可使氣更不足，氣虛證侯更顯著。近年來(lái)樊慧杰等21采用苦寒瀉下法制備脾氣虛動(dòng)物模型，祝婧等22采用大黃水灌胃、負(fù)重及控制飲食三因素復(fù)合法亦成功復(fù)制脾氣虛實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型。但以上造模法尚無(wú)針對(duì)氣虛血瘀型耳聾的動(dòng)物模型，因此，作者擬建立氣虛血瘀型Corti器毛細(xì)胞損傷的動(dòng)物模型，其對(duì)深入研究突發(fā)性耳聾的發(fā)病機(jī)制、中醫(yī)藥治療該病的療效評(píng)價(jià)及作用機(jī)制均具有重要的意義。作為聽(tīng)覺(jué)的重要器官，耳蝸往往被認(rèn)為是實(shí)驗(yàn)研究的重點(diǎn)。張學(xué)淵等23為建立微循環(huán)障礙的耳蝸模型，將四碘四氯熒光素二鈉注入豚鼠股靜脈中，

20、然后以波長(zhǎng)(50±20) nm的綠色光束照射豚鼠耳蝸，誘導(dǎo)耳蝸血管內(nèi)產(chǎn)生光化學(xué)反應(yīng)，造成血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷，而受損的內(nèi)皮細(xì)胞激活血小板，使其黏附、聚集于內(nèi)皮細(xì)胞表面或暴露的基膜上形成微血栓，從而導(dǎo)致豚鼠耳蝸的微循環(huán)障礙，進(jìn)而使耳蝸血管紋、Corti器、螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞等結(jié)構(gòu)出現(xiàn)不同程度的缺血性改變，類似于病理?xiàng)l件下的耳蝸微循環(huán)障礙，此法可為探討內(nèi)耳微循環(huán)障礙、缺血性損傷機(jī)制以及篩選治療藥物建立較理想的動(dòng)物模型。光化學(xué)法做為模擬微循環(huán)障礙的方法在多個(gè)領(lǐng)域被應(yīng)用：黃碩等24總結(jié)了光化學(xué)法建立大鼠腦梗死模型的研究進(jìn)展，認(rèn)為該法與人類腦梗死發(fā)生機(jī)制相似25，有創(chuàng)傷小、穩(wěn)定性好等優(yōu)點(diǎn)；盧寶全等26

21、以手持激光器為光源建立了光化學(xué)法局灶性腦梗死動(dòng)物模型；郝春華等27亦用光化學(xué)法成功建立大鼠冠狀動(dòng)脈血栓模型；王熠釗等28利用光化學(xué)法誘導(dǎo)貓脊髓內(nèi)產(chǎn)生微血栓，從而使組織發(fā)生缺血性壞死；劉巖等29應(yīng)用倍頻532 nm激光通過(guò)光化學(xué)法建立了視網(wǎng)膜動(dòng)脈阻塞的動(dòng)物模型，認(rèn)為此法成功率高、安全性及重復(fù)性均較好。在關(guān)于耳聾的動(dòng)物模型實(shí)驗(yàn)中，近年來(lái)有越來(lái)越多對(duì)耳蝸標(biāo)本方面的研究。張文麗等30觀察大鼠顱腦創(chuàng)傷后對(duì)耳蝸功能的影響，發(fā)現(xiàn)創(chuàng)傷后耳蝸內(nèi)積血、充血水腫，內(nèi)、外毛細(xì)胞排列紊亂，胞漿萎縮、空化，細(xì)胞核萎縮或消失，尤以第三排外毛細(xì)胞損傷嚴(yán)重；王軍義等31發(fā)現(xiàn)噪聲對(duì)豚鼠耳蝸造成損傷，可導(dǎo)致耳蝸外毛細(xì)胞Presti

22、n蛋白的表達(dá)代償性增高。實(shí)驗(yàn)采用限制并減少豚鼠攝食量來(lái)復(fù)制中醫(yī)氣虛模型，然后用特定波長(zhǎng)的光照射豚鼠耳蝸，誘導(dǎo)豚鼠耳蝸血管內(nèi)發(fā)生光化學(xué)反應(yīng)，造成耳蝸微循環(huán)發(fā)生障礙，制作氣虛血瘀證耳蝸Corti器毛細(xì)胞損傷的豚鼠動(dòng)物模型。1 材料和方法 Materials and methods 1.1 造模動(dòng)物及材料1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、飼養(yǎng)及分組 選用健康成年純白色短毛紅目豚鼠12只，體質(zhì)量250-350 g，雌雄不限，由廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，來(lái)源于國(guó)家嚙齒類實(shí)驗(yàn)動(dòng)物種子中心。實(shí)驗(yàn)基地位于廣東省中醫(yī)藥科學(xué)院(中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院廣東分院)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心。豚鼠采用不銹鋼金屬籠飼養(yǎng)，每籠3只，飼養(yǎng)環(huán)境符合普通級(jí)標(biāo)準(zhǔn)

23、，飼養(yǎng)溫度(21±2) ，相對(duì)濕度30%-70%。墊料為玉米芯(由廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供)。飼料由廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，為普通繁殖料(4 mm顆粒)。12只豚鼠按隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分為2組，正常對(duì)照組6只，氣虛血瘀型Corti器毛細(xì)胞損傷組(造模組)6只。1.1.2 實(shí)驗(yàn)儀器和材料 美國(guó)Smart OAE耳聲發(fā)射系統(tǒng)；日本島津公司UV-2450紫外分光光度計(jì)；深圳奧盛翔電子科技有限公司AO-J11綠光激光筆；南京建成生物工程研究所D-木糖(D-xylose)ELISA試劑盒；山東鼎圣生物工程有限公司D-木糖、四碘四氯熒光素二鈉；江陰天江藥業(yè)有限公司中藥配方顆粒厚樸、枳實(shí)、大黃

24、。1.2 造模方法 建立氣虛血瘀型Corti器毛細(xì)胞損傷動(dòng)物模型。建立氣虛豚鼠模型：首先采用改良的耗氣破氣加饑飽失常法行氣虛造模。造模前豚鼠常規(guī)飼養(yǎng)3 d。造模初10 d，隔日給豚鼠破氣苦降藥灌胃，破氣苦降藥為小承氣湯，按厚樸枳實(shí)大黃=332 的比例，100%濃度，給藥劑量按10 mL/kg，給藥當(dāng)日禁食，次日自由進(jìn)食；造模后5 d，隔日給予豚鼠破氣苦降藥灌胃(藥物及比例同前，200%濃度，給藥劑量按10 mL/kg)，給藥當(dāng)日禁食，次日限制進(jìn)食，采取“足量給食-限量給食”的循環(huán)方法；自由飲水。建立氣虛血瘀型Corti器毛細(xì)胞損傷豚鼠模型：15 d后氣虛造模完成，在氣虛型豚鼠模型上用光化學(xué)反應(yīng)

25、法再?gòu)?fù)制耳蝸微循環(huán)障礙模型(即氣虛血瘀型Corti器毛細(xì)胞損傷動(dòng)物模型)。以10%的水合氯醛0.4 mL/kg腹腔注射進(jìn)行麻醉，于豚鼠頸靜脈內(nèi)注射四碘四氯熒光素二鈉(10 mg/kg)，暴露聽(tīng)泡，以波長(zhǎng)為532 nm綠色光束照射耳蝸，光照強(qiáng)度0.19 mW/cm2，光照時(shí)間20 min，光照部位為耳蝸底回。1.3 造模成功的檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn) 造模后豚鼠血清D-木糖水平降低，提示出現(xiàn)氣虛特征；耳聲發(fā)射DPOAE測(cè)試顯示DPOAE幅值降低，豚鼠耳蝸病理組織切片檢查發(fā)現(xiàn)耳蝸組織形態(tài)出現(xiàn)變化(螺旋韌帶、基底膜微血管及蝸軸毛細(xì)血管內(nèi)有血管擴(kuò)張、微血栓形成，血管紋水腫變性；Corti器內(nèi)毛細(xì)胞變性、壞死或缺失)，

26、提示造模組耳蝸Corti 器毛細(xì)胞損傷。1.4 檢測(cè)指標(biāo)1.4.1 血清D-木糖濃度 采血前當(dāng)天禁食，各組豚鼠給予5%D-木糖溶液灌胃，10 mL/kg，60 min后以10%的水合氯醛0.4 mL/kg腹腔注射進(jìn)行麻醉，心臟采血， 1 500 r/min，離心30 min，制備血清，紫外分光光度計(jì)檢測(cè)血清中D-木糖濃度。1.4.2 耳聲發(fā)射DPOAE測(cè)試 采用美國(guó)Smart OAE耳聲發(fā)射系統(tǒng)，實(shí)驗(yàn)前后測(cè)試豚鼠雙耳DPOAE，將豚鼠置于電聲和磁場(chǎng)的屏蔽室內(nèi)，將耳聲發(fā)射系統(tǒng)的聲源與接收器置入外耳道，選擇兩個(gè)初始純音f1和f2，兩純音的固定頻比為f2/f1=1.2；以2個(gè)初始音頻率的幾何均數(shù)f0

27、為測(cè)試頻率，疊加150次。刺激聲強(qiáng)度為L(zhǎng)1=65 dB SPL，L2=55 dB SPL；以f0分別為1 560，2 211，3 125，4 416，6 250，8 837 kHz 6個(gè)頻率點(diǎn)處進(jìn)行測(cè)試，以高于本底噪聲5 dB為反應(yīng)出現(xiàn)的確認(rèn)標(biāo)準(zhǔn)。1.4.3 耳蝸病理檢查 每組豚鼠DPOAE測(cè)試完畢后，以斷頭法處死取出聽(tīng)泡用于光鏡標(biāo)本制作。以三棱針打開(kāi)聽(tīng)泡暴露耳蝸，在蝸尖鉆一小孔，取出鐙骨并挑破圓窗膜與蝸窗膜，用40 g/L多聚甲醛(4 ，pH=7.4)緩慢灌注耳蝸5遍，然后置于固定液4-6 h，再以0.1 mol/L磷酸緩沖液清洗，10%EDTA脫鈣20 d，石蠟包埋，沿平行蝸軸方向做連續(xù)切

28、片，予蘇木精-伊紅染色后光鏡下觀察耳蝸組織。1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS Statistics 18.0統(tǒng)計(jì)分析軟件包建立數(shù)據(jù)庫(kù)，測(cè)量指標(biāo)計(jì)算，造模前后指標(biāo)比較采用配對(duì)符號(hào)秩和檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水平=0.05。2 結(jié)果 Results 2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物數(shù)量分析 12只豚鼠均進(jìn)入結(jié)果分析。造模流程圖見(jiàn)圖1。2.2 模型更接近人類的特點(diǎn) 豚鼠的耳蝸對(duì)聲波較敏感，其反應(yīng)與人類相似，常用于耳及聽(tīng)覺(jué)方面的研究；而豚鼠為哺乳類動(dòng)物，因此其制作出的動(dòng)物模型在生理及病理上更接近于人類。造模中使用的耗氣破氣及饑飽失常為臨床上引起患者氣虛的常見(jiàn)病因，光化學(xué)法模擬了血瘀的形成過(guò)程，與血瘀證的病機(jī)相符。造模后豚鼠表現(xiàn)出的

29、體質(zhì)量下降、精神萎靡，蜷臥，行動(dòng)遲緩等癥狀均為中醫(yī)氣虛證患者的典型癥狀表現(xiàn)。2.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物外觀形態(tài) 采用耗氣破氣加饑飽失常法處理15 d后，造模組6只豚鼠均出現(xiàn)不同程度的體質(zhì)量下降、精神萎靡，蜷臥，行動(dòng)遲緩等中醫(yī)氣虛證的典型癥狀表現(xiàn)(圖2)，被毛有不同程度的枯槁、脫落，大便稀爛。而對(duì)照組6只豚鼠體質(zhì)量逐漸增加，動(dòng)作靈活，皮毛始終光滑、潤(rùn)澤，大便正常。2.4 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物血清D-木糖濃度變化 結(jié)果表明，與正常對(duì)照組(5.094 8±0.980 6) mmol/L相比，造模組血清D-木糖濃度較低，為(3. 351 5±1.186 7) mmol/L，組間差異有非常顯著性意義(P

30、< 0.01)。說(shuō)明造模后豚鼠的吸收消化能力下降，證實(shí)豚鼠出現(xiàn)類似中醫(yī)氣虛運(yùn)化無(wú)力表現(xiàn)。2.5 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物耳聲發(fā)射DPOAE測(cè)試結(jié)果 為證實(shí)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物耳蝸Corti器毛細(xì)胞的情況，在造模前后進(jìn)行耳聲發(fā)射DPOAE測(cè)試，造模后各頻率DPOAE幅值均有不同程度的降低，見(jiàn)圖3。表1，2顯示造模后耳聲發(fā)射DPOAE各頻率幅值及SNR值均下降(P < 0.01)，提示造模組豚鼠耳蝸Corti器毛細(xì)胞損傷，造模成功。 2.6 耳蝸病理檢查 造模組光鏡下耳蝸病理切片形態(tài)變化如下：耳蝸各回的螺旋韌帶、基底膜螺旋緣微血管及蝸軸毛細(xì)血管內(nèi)有血管擴(kuò)張、微血栓形成等現(xiàn)象，血管紋水腫變性；Corti器內(nèi)毛細(xì)胞變

31、性、壞死、缺失(圖4)。而正常對(duì)照組耳蝸可見(jiàn)螺旋器隧道正常，外毛細(xì)胞排列整齊，刷狀緣蓋膜清晰，基底膜處規(guī)則排列一排內(nèi)毛細(xì)胞和三排外毛細(xì)胞、柱細(xì)胞和耳蝸神經(jīng)。觀察指標(biāo)：(1)動(dòng)物外觀(2)血清D-木糖濃度(3)耳聲發(fā)射DPOAE測(cè)試幅值(4)耳蝸病理檢查光化學(xué)反應(yīng)法再?gòu)?fù)制耳蝸微循環(huán)障礙模型不干預(yù)耗氣破氣加饑飽失常法處理15 d圖1 造模流程圖Figure 1 The flow chart of modeling造模組6只豚鼠12只正常對(duì)照組6只AB圖2 氣虛豚鼠模型制備前后動(dòng)物外觀形態(tài)Figure 2 The appearance before and after modeling the ra

32、t with Qi deficiency圖注：圖中A顯示造模前豚鼠靈活有神，皮毛光滑潤(rùn)澤；B為氣虛造模后精神萎靡，毛發(fā)凌亂；C顯示氣虛造模后豚鼠腹部骯臟，下肢無(wú)力。CAB圖4 氣虛血瘀型Corti器毛細(xì)胞損傷豚鼠模型耳蝸病理變化Figure 4 Morphological changes of cochlea after establishing hair cell damage model in the Corti organ with Qi deficiency and blood stasis in guinea pigs圖注：圖中A顯示造模后外毛細(xì)胞排列紊亂，螺旋韌帶水腫；B顯示造模后

33、螺旋韌帶水腫變性，外毛細(xì)胞排列紊亂。圖3 氣虛血瘀型Corti器毛細(xì)胞損傷豚鼠模型制備前后耳聲發(fā)射DPOAE測(cè)試結(jié)果Figure 3 Results in the DPOAE test before and after establishing hair cell damage model in the Corti organ with Qi deficiency and blood stasis in guinea pigs圖注：圖中A為造模前；B為造模后。結(jié)果顯示造模后各頻率DPOAE幅值均有不同程度的降低。BA表1 氣虛血瘀型Corti器毛細(xì)胞損傷豚鼠模型制備前后DPOAE各頻率幅值 (

34、±s，n=6，dB SPL)Table 1 The amplitudes of each frequency in the DPOAE test before and after establishing hair cell damage model in the Corti organ with Qi deficiency and blood stasis in guinea pigs頻率造模前造模后t/ZPDP156014.67±4.974.33±4.186.521/-2.2070.001/0.027DP221119.00±4.568.17±

35、;3.5413.000/-2.2260.000/0.026DP312512.67±7.175.50±9.014.731/-2.2070.005/0.027DP44161.00±8.97-13.17±7.474.319/-2.2070.008/0.027DP625017.50±4.04-1.17±8.844.082/-2.2140.010/0.027DP883730.83±1.7217.33±2.1617.676/-2.2140.000/0.027表2 氣虛血瘀型Corti器毛細(xì)胞損傷豚鼠模型制備前后DPOAE各頻率

36、SNR值 (±s，n=6，dB SPL)Table 2 The signal noise ratios of each frequency in the DPOAE test before and after establishing hair cell damage model in the Corti organ with Qi deficiency and blood stasis in guinea pigs頻率造模前造模后t/ZPDP156026.17±9.13-0.50±3.736.815/-2.2010.001/0.028DP221136.17

37、77;7.63-1.50±4.049.911/-2.2010.000/0.028DP312531.67±6.350.17±4.7510.071/-2.2010.000/0.028DP441621.50±8.940.17±2.566.580/-2.2010.001/0.027DP625037.00±4.77-3.17±8.9812.560/-2.2010.000/0.028DP883747.83±2.403.50±9.2511.830/-2.2010.000/0.0283 討論 Discussion突發(fā)性耳

38、聾是耳鼻喉科的常見(jiàn)急癥，近年來(lái)發(fā)病有逐漸增加的趨勢(shì)，其病因復(fù)雜。臨床上一些患者單用活血藥物療效不佳，其中相當(dāng)一部分患者兼有氣虛證候?！皻鉃檠獛洝?，氣對(duì)血有推動(dòng)、統(tǒng)攝和化生的作用，氣虛則無(wú)力推動(dòng)血行而更易造成血液瘀滯，從而導(dǎo)致疾病的發(fā)生。臨床中氣虛血瘀導(dǎo)致突發(fā)性耳聾的患者并不少見(jiàn)。為深入研究突發(fā)性耳聾的發(fā)病機(jī)制，同時(shí)探討中醫(yī)藥治療本病的切入點(diǎn)及作用機(jī)制，有必要建立氣虛血瘀型Corti器毛細(xì)胞損傷的動(dòng)物模型進(jìn)行深入研究。靈樞·五味篇曰：“谷不入半日則氣衰，一日則氣少矣”。而過(guò)于利下亦會(huì)導(dǎo)致耗氣。脾氣虛弱，脾失健運(yùn)，不能運(yùn)化水谷精微，物質(zhì)代謝即會(huì)發(fā)生障礙。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明，給予耗氣破氣中藥灌胃

39、及限制進(jìn)食后，經(jīng)過(guò)一段時(shí)間就會(huì)出現(xiàn)體重下降、精神萎靡，蜷臥，行動(dòng)遲緩，被毛有不同程度的枯槁、脫落，大便稀爛。 在糖代謝方面，則會(huì)出現(xiàn)小腸D-木糖吸收功能低下33、34，實(shí)驗(yàn)中造模后豚鼠血清D-木糖含量顯著下降，說(shuō)明其吸收功能減弱。因此耗氣破氣中藥灌胃加饑飽失常法減少進(jìn)食可用于復(fù)制氣虛動(dòng)物模型。研究中采用的光敏劑為四碘四氯熒光素，是迄今已知的最強(qiáng)的光敏染料，有報(bào)道手持式激光器(激光筆)可作為實(shí)驗(yàn)光源32。結(jié)果表明模型成功模擬了豚鼠氣虛血瘀型Corti器毛細(xì)胞損傷的過(guò)程，將來(lái)可用于研究中醫(yī)藥治療耳鳴耳聾特別是突發(fā)性耳聾的機(jī)制。實(shí)驗(yàn)中采用靜脈內(nèi)注射四碘四氯熒光素二鈉，以激光筆綠色光束照射耳蝸的方法，

40、誘導(dǎo)豚鼠耳蝸血管內(nèi)發(fā)生光化學(xué)反應(yīng)，從而損傷血管內(nèi)皮細(xì)胞，血小板被受損的內(nèi)皮細(xì)胞激活，黏附、聚集于內(nèi)皮細(xì)胞表面或基膜上形成微血栓，導(dǎo)致耳蝸微循環(huán)障礙18。造模組耳蝸病理切片提示耳蝸血管紋、Corti器等結(jié)構(gòu)出現(xiàn)不同程度的缺血性病變，說(shuō)明復(fù)制血瘀模型成功。DPOAE檢測(cè)快速靈敏， 可直接反映耳蝸毛細(xì)胞的功能。研究證明DPOAE 的產(chǎn)生與外毛細(xì)胞的功能有關(guān)，當(dāng)外毛細(xì)胞排列紊亂、數(shù)量減少或缺失時(shí)， DPOAE 的幅值可以下降35，張紀(jì)帥等36通過(guò)研究認(rèn)為畸變產(chǎn)物耳聲發(fā)射(DPOAE)可以很好地檢測(cè)噪聲暴露前后豚鼠聽(tīng)覺(jué)功能的變化，近年來(lái)不少研究者均將DPOAE作為衡量實(shí)驗(yàn)動(dòng)物聽(tīng)功能情況的一項(xiàng)重要的指標(biāo)3

41、7-39。此次實(shí)驗(yàn)中，耳聲發(fā)射結(jié)果顯示，造模后豚鼠各頻率DPOAE幅值降低，同造模組術(shù)前及對(duì)照組差異顯著，說(shuō)明其耳蝸毛細(xì)胞受損，對(duì)聽(tīng)力造成了影響。由于經(jīng)費(fèi)及時(shí)間限制，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的例數(shù)偏少，數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)結(jié)果可能存在一定的偏倚，在今后的研究中應(yīng)擴(kuò)大樣本量以減少統(tǒng)計(jì)學(xué)誤差。在未來(lái)的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，還可采用ABR(聽(tīng)性腦干反應(yīng))檢測(cè)以更客觀體現(xiàn)實(shí)驗(yàn)對(duì)象的聽(tīng)力情況。隨著現(xiàn)代科技的迅猛發(fā)展，組織病理學(xué)的研究已深入到亞細(xì)胞和分子水平，進(jìn)一步的研究可應(yīng)用掃描電鏡技術(shù)等相關(guān)方法40，以更直觀的體現(xiàn)耳蝸Corti 器內(nèi)毛細(xì)胞的微觀變化，為實(shí)驗(yàn)研究提供更有利的證據(jù)。根據(jù)研究的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，說(shuō)明耗氣破氣中藥加饑飽失常法，再采用光化

42、學(xué)反應(yīng)法復(fù)制模擬氣虛血瘀型Corti器毛細(xì)胞損傷動(dòng)物模型是可行的，其方法簡(jiǎn)單易行，重復(fù)性好，為研究突發(fā)性耳聾的發(fā)病機(jī)理及治療作用機(jī)制提供了客觀有效的手段。作者貢獻(xiàn)：彭桂原進(jìn)行實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，彭桂原、楊黎、譚串進(jìn)行實(shí)驗(yàn)實(shí)施，李松鍵、楊朝杰進(jìn)行實(shí)驗(yàn)評(píng)估。利益沖突：所有作者共同認(rèn)可文章內(nèi)容不涉及相關(guān)利益沖突。倫理問(wèn)題：實(shí)驗(yàn)過(guò)程中對(duì)動(dòng)物處置符合動(dòng)物倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)。文章查重：文章出版前已經(jīng)過(guò)CNKI反剽竊文獻(xiàn)檢測(cè)系統(tǒng)進(jìn)行3次查重。文章外審：文章經(jīng)國(guó)內(nèi)小同行外審專家雙盲外審，符合本刊發(fā)稿宗旨。作者聲明：第一作者對(duì)研究和撰寫的論文中出現(xiàn)的不端行為承擔(dān)責(zé)任。論文中涉及的原始圖片、數(shù)據(jù)(包括計(jì)算機(jī)數(shù)據(jù)庫(kù))記錄及樣本已按照

43、有關(guān)規(guī)定保存、分享和銷毀，可接受核查。文章版權(quán)：文章出版前雜志已與全體作者授權(quán)人簽署了版權(quán)相關(guān)協(xié)議。4 參考文獻(xiàn) References1 趙烏蘭,王楓.金匱腎氣丸對(duì)慶大霉素致聾豚鼠血清IL-2的影響J. 浙江中醫(yī)雜志,2015,(9):647-648.2 胡凌翔,吳皓,石復(fù)辛.內(nèi)耳注射藥物建立新生鼠耳聾動(dòng)物模型J. 聽(tīng)力學(xué)及言語(yǔ)疾病雜志,2013,21(1):61-65.3 汪銀鳳,王亞林,高煒.環(huán)磷酰胺對(duì)豚鼠自身免疫性感音神經(jīng)性聾聽(tīng)功能的影響J.中華耳科學(xué)雜志,2014,12(2): 328-330.4 何景春,阮清偉,韓淼淼,等.應(yīng)用順鉑建立C57小鼠感音神經(jīng)性聾模型的實(shí)驗(yàn)研究J. 山東大

44、學(xué)耳鼻喉眼學(xué)報(bào), 2014,28(1):1-5.5 閆輝,邢蔚,宋勇莉,等. 硫酸卡那霉素聯(lián)合呋塞米快速致聾大鼠模型的研究J.聽(tīng)力學(xué)及言語(yǔ)疾病雜志, 2014, 22(3):277-281.6 石峰,李冬梅,楊銳睿,等. 內(nèi)皮祖細(xì)胞在噪聲性耳聾耳蝸損傷中的變化J.中國(guó)醫(yī)藥導(dǎo)報(bào),2015,12(31):30-34.7 段宏,袁慧軍. CRISPR/Cas靶向編輯技術(shù)系統(tǒng)與耳聾動(dòng)物模型的建立J.中華耳科學(xué)雜志,2015,13(1):171-175.8 于文艷,李新.中西醫(yī)結(jié)合治療氣虛血瘀型突發(fā)性耳聾66例J.北京中醫(yī),2002,21(4):235-236.9 彭桂原,李云英,楊黎,等. 金針聯(lián)合藥

45、物治療氣虛血瘀證突發(fā)性耳聾36例臨床觀察J.中醫(yī)雜志,2015,56(23): 2036-2038.10 于秀華,歐喜燕.人參花提取物對(duì)氣虛血瘀模型大鼠血液流變學(xué)指標(biāo)的影響J.遼寧中醫(yī)雜志,2012,39(10): 2071-2072.11 朱傳武,彭康,許文學(xué).中風(fēng)后遺癥氣虛血瘀大鼠模型能量代謝的研究J.中醫(yī)藥學(xué)刊,2004,22(4):602-604.12 楊碩,張艷,王思尹,等.參草通脈顆粒逆轉(zhuǎn)慢性心衰氣虛血瘀證大鼠模型療效分析J.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào),2015, 17(5):50-53.13 馮玄超,郭淑貞,武志黔,等.慢性心力衰竭模型大鼠氣虛血瘀證相關(guān)信息的評(píng)價(jià)J.中華中醫(yī)藥雜志, 2

46、014,29(5): 1563-1567.14 楊衛(wèi)平,詹亞梅,邱德文,等.人參湯對(duì)實(shí)驗(yàn)性氣虛血瘀證心肌缺血大鼠的血液流變學(xué)的影響J.四川中醫(yī), 2005, 23(8): 26-27.15 易亞喬,劉林,肖碧躍,等.血管性癡呆氣虛血瘀證大鼠模型研究J.中國(guó)中醫(yī)藥現(xiàn)代遠(yuǎn)程教育,2014,(9):152-153.16 楊洪雁,張香東,崔梓揚(yáng),等.復(fù)合因素致氣虛血瘀證模型的制備J.中藥藥理與臨床,2013,29(2):192-194.17 王鍵,趙輝,李凈,等.多因素復(fù)合制作氣虛血瘀證腦缺血?jiǎng)游锬Ｐ偷膶?shí)驗(yàn)研究J.中國(guó)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)報(bào),2001,9(4): 216-220.18 王凈凈,黃云峰,劉春華,等.眩暈定方對(duì)兔血管性眩暈氣虛血瘀證模型血液流變學(xué)和腦血流圖的影響J.湖南中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào),2007,27(4):26-29.19 成映霞,段永強(qiáng),楊曉軼,等