第三章植物組織與器官培養(yǎng)

1、細胞工程細胞工程細 胞 工 程 大理大學(xué)農(nóng)生學(xué)院細胞與分子生物學(xué)教研室 E-mail:2016.10.2016.10.2 25 5細胞工程細胞工程第三章 植物組織和器官培養(yǎng)一、一、 植物組織培養(yǎng)植物組織培養(yǎng)二、二、 植物胚胎培養(yǎng)植物胚胎培養(yǎng)三、三、 毛狀根培養(yǎng)毛狀根培養(yǎng)細胞工程細胞工程植物組織培養(yǎng)指對植物組織（分生組織、表皮組織、薄壁組織）及愈傷組織進行離體培養(yǎng)并誘導(dǎo)長成完整植株的技術(shù)。植物組織培養(yǎng)再生的植物稱之為試管植物，植物組織培養(yǎng)再生植物的理論基礎(chǔ)是細胞全能性。第一節(jié)第一節(jié) 植物組織培養(yǎng)植物組織培養(yǎng)細胞工程細胞工程植物組織培養(yǎng)的理論基礎(chǔ)植物組織培養(yǎng)的理論基礎(chǔ) 1. 1. 細胞全能性的定義

2、細胞全能性的定義 細胞全能性是指植物體的每一個細胞都攜帶有一套完整的基因組，并具有發(fā)育成為完整植株的潛在能力。2. 2. 細胞全能性的相對性細胞全能性的相對性 受精卵生殖細胞體細胞 不同種類植物或同種植物的不同基因型個體之間因遺傳性的差異，細胞全能性的表達程度大不相同。細胞工程細胞工程 植物組織培養(yǎng)技術(shù)的整個歷史可以追溯到19世紀(jì)末和20世紀(jì)初。它的發(fā)展過程大致可以分為三個階段：1. 探索階段 1839年：Schleidon和Schwann提出細胞學(xué)說 1902年：Haberlandt提出植物細胞全能學(xué)說 1904年：Hanning進行胚離體培養(yǎng)獲得成功 1922年：Kotte和Robbins

3、進行根尖和莖尖培養(yǎng)形成了缺綠的葉和根 植物組培發(fā)展簡史植物組培發(fā)展簡史細胞工程細胞工程2. 奠基階段奠基階段 1934年：White進行番茄根培養(yǎng)建立了第一個活躍生長的無性繁殖系 1937年：White建立了第一個由已知化合物組成的綜合培養(yǎng)基 1943年：White出版了植物組織培養(yǎng)手冊 1948年：Skoog和崔徵（zhng）發(fā)現(xiàn)腺嘌呤或腺苷可以解除IAA對芽形成的抑制細胞工程細胞工程 1952年：Morel和Miller通過莖尖培養(yǎng)獲得脫毒大麗花植株 1953年：Muir使單細胞培養(yǎng)獲得成功 1956年：Miller等人發(fā)現(xiàn)了細胞分裂素-激動素 1957年：Skoog和Miller提出植物

4、生長調(diào)節(jié)劑控制器官形成的概念。 1958年：Steward等將胡蘿卜根韌皮部的一些細胞進行培養(yǎng)，細胞分化而最終發(fā)育成完整的新植株，證實了Haberlandt的細胞全能性。細胞工程細胞工程3. 迅速發(fā)展階段迅速發(fā)展階段 1960年：Cocking等人用真菌纖維素酶分離植物原生質(zhì)體獲得成功。 1960年：Morel利用莖尖培養(yǎng)獲得脫毒蘭花,形成了”蘭花產(chǎn)業(yè)” 1962年：Murashibe和Skoog發(fā)表了MS培養(yǎng)基 1964年：Guha等在葉曼陀羅上由花粉誘導(dǎo)得到單倍體植株。 1971年：Takebe等在煙草上首次由原生質(zhì)體獲得了再生植株。細胞工程細胞工程 1972年：Carlson等在煙草上獲

5、得了第一個體細胞種間雜種。 1974年：Kao等人建立原生質(zhì)體的高鈣高pH的PEG融合法。 1978年：Melchers獲得了第一個屬間雜種植株-馬鈴薯番茄。 1983年：Zambryski等采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)獲得首例轉(zhuǎn)基因植物。細胞工程細胞工程植物組織培養(yǎng)再生植株的兩大途徑：植物組織培養(yǎng)再生植株的兩大途徑： 器官發(fā)生途徑；體細胞胚發(fā)生途徑細胞工程細胞工程器官發(fā)生途徑：離體培養(yǎng)條件下的組織或細胞團（愈傷組織）分化形成不定根、不定芽等器官的過程。在自然界中，許多植物的無性繁殖（如插條，嫁接等）都屬于器官發(fā)生途徑。細胞工程細胞工程 愈傷組織：脫分化后的細胞經(jīng)過細胞分裂產(chǎn)生無特定組織結(jié)構(gòu)、無明顯極性的松

6、散的細胞團。愈傷組織誘導(dǎo)過程實質(zhì)是分化細胞進行脫分化的過程。 外植體：從植物體上取下來用以培養(yǎng)的部分組織或器官。細胞工程細胞工程小麥胚的愈傷組織細胞工程細胞工程 由外植體或單個細胞經(jīng)愈傷組織再生植株需要以下四個步驟1 啟動期-主要是誘導(dǎo)外植體細胞脫分化和分裂2 愈傷組織誘導(dǎo)3 擬分生組織的形成4 器官原基和器官的形成細胞工程細胞工程Three ways of organogenesis 細胞工程細胞工程體細胞胚發(fā)生途徑 離體培養(yǎng)條件下沒有經(jīng)過受精過程，但經(jīng)過了胚胎發(fā)育過程中所形成胚的類似物，統(tǒng)稱為體細胞胚或胚狀體。細胞工程細胞工程體細胞胚的發(fā)生途徑1.從器官外植體直接發(fā)生2.懸浮培養(yǎng)細胞發(fā)生（

7、成簇成團的體積小而細胞質(zhì)致密的細胞，這類細胞具有成胚能力，因而，把這類細胞團又稱為胚性細胞團）3.經(jīng)胚性愈傷組織發(fā)生4.單細胞發(fā)生途徑5.原生質(zhì)體發(fā)生途徑細胞工程細胞工程植物組織的培養(yǎng)基及其配制植物組織的培養(yǎng)基及其配制培養(yǎng)基的成分培養(yǎng)基的成分 一一配制培養(yǎng)基母液配制培養(yǎng)基母液二二三三 常用培養(yǎng)基的種類及其特點常用培養(yǎng)基的種類及其特點四四配制培養(yǎng)基并滅菌配制培養(yǎng)基并滅菌細胞工程細胞工程 大量元素1. 無機營養(yǎng)： 微量元素 鐵鹽 氨基酸 有機附加物 維生素2. 有機營養(yǎng)成分： 肌醇 糖類 生長素3. 植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)： 細胞分裂素 赤霉素等 一、培養(yǎng)基成分一、培養(yǎng)基成分細胞工程細胞工程4. 瓊脂5

8、. 活性炭6. pH7. 水 酵母提取物（YE）8. 天然物質(zhì)： 麥芽提取物（ME）細胞工程細胞工程1. 1. 無機營養(yǎng)元素?zé)o機營養(yǎng)元素（1）大量元素：指濃度大于0.5mmolL的元素C、H、O、N、P、K、Mg、S和Ca，大量元素占植物體干重的百分之幾十至萬分之幾的分量。N分硝態(tài)氮（NO3-）和銨態(tài)氮（NH4+），不同離體組織所需的含量不一致，單獨使用易導(dǎo)致培養(yǎng)基酸堿性漂移，兩者要保持適當(dāng)比例。細胞工程細胞工程（2）微量元素：指小于0.5mmolL的元素。鐵（Fe）、銅（Cu）、鋅（Zn）、錳（Mn）、鉬（Mo）、硼（B）、碘（I）、鈷（Co）、氯（Cl）、鈉（Na）等 Fe：易形成絮狀沉淀

9、，常以FeEDTA 的形式提供。FeSO47H2ONa2EDTA兩類元素雖然在培養(yǎng)基中含量差距很大，但都是不可少的營養(yǎng)成份。含量不足就造成缺素癥。 細胞工程細胞工程（1）碳水化合物最常用的碳源是蔗糖，葡萄糖和果糖也是較好的碳源，麥芽糖、半乳糖、甘露糖也有所應(yīng)用。使用濃度在1%5%，常用3%在大規(guī)模生產(chǎn)時，可用食用的白糖代替。 糖類作用：在組織培養(yǎng)中用作離體組織生長的碳源，維持培養(yǎng)基一定的滲透壓。培養(yǎng)效果有差異：葡萄糖果糖=蔗糖麥芽糖2. 2. 有機化合物有機化合物細胞工程細胞工程 在細胞里主要是以各種輔酶的形式參與多種代謝活動對離體組織的生長具有明顯的促進作用，主要為B族維生素 。 種類：種類

10、： VBl(鹽酸硫胺素)、VB3(泛酸)、VB6(鹽酸吡哆醇)、 Vpp(煙酸)、Vc(抗壞血酸）、 VH(生物素)、 VB11(葉酸)、 VB12(鈷胺素)等。 使用濃度：使用濃度： 一般用量為0.1-1.0mgL。Vc具有很強的還原能力，常用于防止組織褐變。（2 2）維生素）維生素(vitamin) (vitamin) 細胞工程細胞工程 又叫環(huán)己六醇，在糖類的相互轉(zhuǎn)化中起重要作用。 使用濃度：一般為lOOmgL。 作用：適當(dāng)使用肌醇，能促進愈傷組織的生長以及胚狀體和芽的形成。對組織和細胞的繁殖、分化有促進作用，對細胞壁的形成也有作用。 （3 3）肌醇）肌醇細胞工程細胞工程 作用：作用：蛋白

11、質(zhì)的組成部分，也是一種有機氮化合物，是很好的有機氮源，可直接被細胞吸收利用。 種類：種類：最常用的是甘氨酸，其他的如精氨酸、谷氨酸，谷酰胺、天冬氨酸、天冬酰胺、丙氨酸等半胱氨酸及多種氨基酸的混合物（水解酪蛋白、水解乳蛋白）等。 使用濃度：使用濃度：為10-200mgL。（4 4）氨基酸）氨基酸 細胞工程細胞工程 植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)是一些對植物生長發(fā)育及生理活動有特殊作用的生理活性物質(zhì)。 這類物質(zhì)極少量存在就對植物生命活動起到調(diào)節(jié)作用，有些可以刺激植物生長，而有些抑制植物生長。 在組織培養(yǎng)中，植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)對愈傷組織的誘導(dǎo)、器官分化的植株再生具有重要的作用。4. 4. 植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)植物生長調(diào)

12、節(jié)物質(zhì) 細胞工程細胞工程植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)主要包括：植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)主要包括：細胞工程細胞工程 概念：概念：指能引起完整組織中的細胞擴展的化合物，主要生理作用是促進細胞的縱向伸長，生長素包括內(nèi)源的（存在于植物體內(nèi)的）和人工合成的。組培中的作用：組培中的作用：主要被用于誘導(dǎo)愈傷組織形成，促進細胞伸長生長和促進生根。用量：mg/L，mg/L=ppm用法：溶于95乙醇或0.1mol/L NaOH（1 1）生長素類）生長素類 細胞工程細胞工程 吲哚乙酸：IAA 萘乙酸：NAA 吲哚丁酸：IBA 2,4-二氯苯氧乙酸：2,4D 另外：吲哚丙酸(IPA)、萘氧乙酸(NOA)等 NAA、IBA生根培養(yǎng) 2,4

13、-D 愈傷組織誘導(dǎo)與增殖 生長素種類：生長素種類：細胞工程細胞工程IAA(吲哚乙酸)NAA(萘乙酸)IBA(吲哚丁酸)2,4D(2,4二氯苯氧乙酸)生長素作用強弱順序：生長素作用強弱順序：強弱細胞工程細胞工程概念：概念：是一類具有促進細胞分裂和其他生理功能的物質(zhì)總稱。都為腺嘌呤的衍生物。在高等植物中普遍存在，特別是莖尖、根尖、未成熟的種子和生長著的果實等進行著細胞分裂的器官。（2 2）細胞分裂素類）細胞分裂素類細胞工程細胞工程細胞分裂素常用種類： 6-BA(6-芐基腺嘌呤) Kt (kinetin 激動素) Zt (zeatin 玉米素)細胞工程細胞工程Kt ( 激動素)6-BA(6-芐基腺嘌

14、呤)Zt (玉米素)細胞分裂素作用強弱順序細胞分裂素作用強弱順序強弱細胞工程細胞工程 GA3GA3（赤霉素）：（赤霉素）：最初從赤霉菌中提取到，能夠引起水稻等植株徒長。在組織培養(yǎng)中有時使用，如用于匍匐莖的誘導(dǎo)。 作用：作用：通過調(diào)節(jié)生長素的含量實現(xiàn)促進細胞伸長的。促進幼芽伸長生長，促進不定胚發(fā)育成小植株打破休眠。多用GA3。 赤霉素和生長素協(xié)同作用，對形成層的分化有影響：當(dāng)生長素/赤霉素比值高時有利于木質(zhì)部分化，比值低時有利于韌皮部分化。 用量：用量：mg/L級 用法：用法：易溶于水、乙醇，多用95乙醇溶解儲存。（3 3）赤霉素）赤霉素細胞工程細胞工程脫落酸（ABA）因物種不同，能促進或抑制愈

15、傷組織生長；乙烯有催熟作用，大量積累易影響生長、分化，導(dǎo)致培養(yǎng)物早衰、落葉和玻璃化苗，應(yīng)盡量排除之；5.5.另外：另外：細胞工程細胞工程6. 6. 抗生物質(zhì)抗生物質(zhì)種類：種類：青霉素、鏈霉素、慶大霉素等。濃度：濃度：5-20mg/L。作用：作用：可防止菌類污染，主要。多數(shù)需過濾滅菌細胞工程細胞工程7. 7. 活性炭活性炭 目的：目的：利用其吸附能力，減少一些有毒物質(zhì)的影響。 如：用于防止酚類物質(zhì)污染引起組織褐化死亡。也能使培養(yǎng)基變黑，有利于某些植物生根。 使用濃度：使用濃度：1- 5g/L。 它的顆粒大小決定著吸附能力：它的顆粒大小決定著吸附能力：粒度越小，吸附能力越大；溫度低吸附力強，溫度高

16、吸附力減弱，甚至不吸附。細胞工程細胞工程8. 8. 水水 作用：作用：是植物原生質(zhì)體的組成成分，也是一切代謝過程的介質(zhì)和溶媒。 ：用蒸餾水，最好是重蒸餾水；以保持培養(yǎng)基成分的精確性。 配制培養(yǎng)基母液時要用蒸餾水，大規(guī)模生產(chǎn)時可用自來水。但在少量研究上盡量用蒸餾水，以防成分的變化引起不良果。細胞工程細胞工程1.1. 母液的定義母液的定義將所用培養(yǎng)基配方的化學(xué)成分按一定的比例配成濃縮液。 2. 2. 母液的種類母液的種類（1）大量元素母液 （2）微量元素母液 （3）有機物母液（4）鐵鹽母液 （5）激素母液 二、配制培養(yǎng)基母液二、配制培養(yǎng)基母液細胞工程細胞工程（1 1）大量元素）大量元素 原則上可以

17、混在一起，但硫酸鎂與氯化鈣要單獨配制硫酸鎂與氯化鈣要單獨配制，因為高濃度的Ca2+與Mg2+與磷酸鹽混合，會產(chǎn)生不溶性沉淀。 3. 3. 母液的配制母液的配制 配制方法：用天平稱取藥品，分別加入600-700ml蒸餾水中，再用磁力攪拌器攪拌，待第一種藥品溶解，加入第二種藥品，最后定容?；蛎恳环N藥品分別溶解，然后混合，最后定溶。細胞工程細胞工程（2 2）微量元素）微量元素 用分析天平準(zhǔn)確稱取藥品，分別溶解，依次混合，最后定容。有時KI單獨配制。（3 3）鐵鹽母液）鐵鹽母液易沉淀，需單獨配制，一般配成硫酸亞鐵（FeSO47H2O）與乙二胺四乙酸二鈉(Na2-EDTA)的鐵鹽螯合劑。用少量蒸餾水將N

18、a2-EDTA加熱溶解后，再緩緩倒入FeSO4溶液充分?jǐn)嚢璨⒓訜?分鐘，使其充分螯合。細胞工程細胞工程(4)(4)有機物母液有機物母液 分別稱取藥品，溶解，混合后加水定容。(5)(5)激素母液激素母液 必需單獨配制，儲存于冰箱。一般濃度為0.5-1mg/ml。IAA、NAA、IBA、2，4-D等，可先用0.1mol/L的NaOH或95%的酒精溶解，然后定容。KT、BA等細胞分裂素應(yīng)先溶于少量0.1mol/L的HCl，然后定容。細胞工程細胞工程配制倍數(shù)不宜過高，可避免浪費；也可避免倍數(shù)過高，吸取量相對少而影響準(zhǔn)確性。母液配制好后應(yīng)放在24冰箱內(nèi)保存。母液貯備時間不宜過長。過長時宜出現(xiàn)沉淀和微生物

19、污染配制母液注意幾點：配制母液注意幾點：細胞工程細胞工程1. 1. 培養(yǎng)基的配制培養(yǎng)基的配制（1）將母液按順序擺放（2）取適量的蒸餾水(所需培養(yǎng)基量的2/3)入容器（3）按需要量依次取母液（吸取量按需要量依次取母液（吸取量= =配制濃度配制濃度 體積體積 / / 母液濃度）及生長調(diào)節(jié)物質(zhì)母液濃度）及生長調(diào)節(jié)物質(zhì)（4）加入蔗糖(30-70g/L)溶解（5）加瓊脂(6-10g/L)，煮沸，2-3min（6）定容 （7）調(diào)PH值(pH=5.8)（8）分裝培養(yǎng)瓶，封口 （9）高壓滅菌三、配制培養(yǎng)基并滅菌三、配制培養(yǎng)基并滅菌細胞工程細胞工程2. 2. 培養(yǎng)基的滅菌培養(yǎng)基的滅菌濕熱滅菌法濕熱滅菌法 培養(yǎng)基

20、在制備后的24h內(nèi)完成滅菌工序。 高壓滅菌的原理：高壓滅菌的原理： 在密閉的蒸鍋內(nèi)，其中的蒸氣不能外溢，壓力不斷上升，使水的沸點不斷提高，從而鍋內(nèi)溫度也隨之增加。在108kPa108kPa的的壓力壓力下，鍋內(nèi)溫度達溫度達121121。在此蒸氣溫度下，可以很快殺死各種細菌及其高度耐熱的芽孢。細胞工程細胞工程過濾滅（除）菌（不耐熱的物質(zhì)過濾滅（除）菌（不耐熱的物質(zhì) ） 一些生長調(diào)節(jié)劑(赤霉素、玉米素)、某些維生素是不耐熱的，常用過濾滅菌過濾滅菌- -細菌過濾器細菌過濾器方法。 防細菌濾膜網(wǎng)孔的直徑為0.45m0.45m以下，可阻止細菌細胞和真菌的孢子通過。細胞工程細胞工程四、常用培養(yǎng)基的種類及其特

21、點四、常用培養(yǎng)基的種類及其特點1.1.MSMS培養(yǎng)基培養(yǎng)基 是Murashige和Skoog于1962年為煙草細胞培養(yǎng)設(shè)計的，無機鹽數(shù)量適宜，硝酸鹽、鉀和銨鹽的含量比其他培養(yǎng)高。應(yīng)用最廣泛。主要用于園藝植物、木本植物、花卉、蔬菜等的組織培養(yǎng)。2. B52. B5培養(yǎng)基培養(yǎng)基 銨的含量較低。在豆科植物上應(yīng)用最多。培養(yǎng)大豆細胞和組織培養(yǎng)設(shè)計。3. White3. White培養(yǎng)基培養(yǎng)基 成分比較簡單，無機鹽和糖的用量低。適于生根培養(yǎng)。細胞工程細胞工程植物組織培養(yǎng)問題分析植物組織培養(yǎng)問題分析1.1.試管玻璃化現(xiàn)象試管玻璃化現(xiàn)象 玻璃苗是植物組織培養(yǎng)中出現(xiàn)的半透明狀、畸形的試管植物，不能移栽成活。 原

22、因：可能是不適應(yīng)培養(yǎng)基環(huán)境的一種生理變態(tài)。 控制和克服的措施 a適當(dāng)提高培養(yǎng)基中滲透壓。b適當(dāng)降低細胞分裂素和赤霉素的濃度。c增加自然光照。d改善氣體交換狀況，e在培養(yǎng)基中添加間苯三酚、根皮苷、聚乙烯醇、活性炭、青霉素G鉀等添加物，可有效地減輕或防治試管苗玻璃化。 細胞工程細胞工程細胞工程細胞工程2. 2. 褐變問題褐變問題(browning)(browning) 原因：完整植物體細胞中，酚類化合物與多酚氧化酶分隔存在，當(dāng)切取外植體后，多酚氧化酶氧化酚類化合物成為褐色的醌類物質(zhì)和水；醌類又被酪氨酸酶等作用使蛋白質(zhì)聚合，外植體生長停頓，導(dǎo)致死亡。 防止措施：a選擇適宜的外植體和培養(yǎng)條件。選擇最適

23、宜的細胞脫分化和再分化培養(yǎng)條件、強分生能力的外植體、適宜的溫度、全黑暗條件，使外植體處于旺盛的生長狀態(tài)，便可大大減輕褐變。b加入抗氧化劑減輕醌類物質(zhì)的毒害。Vc、血清白蛋白、檸檬酸、硫代硫酸鈉等。c使用吸附劑。細胞工程細胞工程細胞工程細胞工程3.3.微生物污染問題微生物污染問題外植體帶菌污染與外植體的種類，取材季節(jié)，部位，預(yù)處理及消毒方法密切相關(guān)。防治措施：1改進外植體消毒方法。2反復(fù)檢查培養(yǎng)物。3使用適當(dāng)種類和濃度的抗生素。細胞工程細胞工程第二節(jié)第二節(jié) 植物胚胎培養(yǎng)植物胚胎培養(yǎng) 主要內(nèi)容：主要內(nèi)容： 胚培養(yǎng) 胚乳培養(yǎng) 胚珠和子房培養(yǎng)細胞工程細胞工程植物胚胎培養(yǎng)植物胚胎培養(yǎng) 植物胚胎培養(yǎng)（Em

24、bryo Culture）概念: 指對植物的胚、子房、胚珠和胚乳進行離體培養(yǎng)，使其發(fā)育成完整植物的技術(shù)。包括胚培養(yǎng)(embryo culture)（成熟胚培養(yǎng)、幼胚培養(yǎng)）、胚珠培養(yǎng)(ovule culture)、子房培養(yǎng)(ovary culture)、胚乳培養(yǎng)(endosperm culture)等類型。細胞工程細胞工程細胞工程細胞工程細胞工程細胞工程細胞工程細胞工程一、胚培養(yǎng)一、胚培養(yǎng) 胚培養(yǎng)：指在無菌條件下將胚從胚珠或種子中分離出來，置于培養(yǎng)基上進行培養(yǎng)的技術(shù)。 胚的發(fā)育過程包括從合子分裂到幼胚形成直至發(fā)育為成熟胚的過程。細胞工程細胞工程 植物胚胎發(fā)生過程： 原胚球形胚心形胚魚雷胚子葉胚球

25、形胚前期球形胚前期心心形形胚胚前前期期魚雷胚魚雷胚球形胚球形胚細胞工程細胞工程魚雷胚細胞工程細胞工程1.胚培養(yǎng)的意義胚培養(yǎng)的意義 促使發(fā)育不良或中途敗育的胚發(fā)育成熟 縮短育種周期 獲得單倍體植株 打破休眠期促進胚萌發(fā) 建立高頻再生體系 可作為轉(zhuǎn)基因受體材料細胞工程細胞工程2.胚培養(yǎng)技術(shù)胚培養(yǎng)技術(shù) 胚的發(fā)育對營養(yǎng)的要求有2個階段，即： v 異養(yǎng)期：這一時期的幼小胚完全依賴胚乳和周圍的母體組織提供營養(yǎng)。 v 自養(yǎng)期：這一時期胚能吸收培養(yǎng)基中的無機鹽和糖，經(jīng)過自身的代謝作用合成其生長必需的物質(zhì)，在營養(yǎng)上已可以完全獨立。細胞工程細胞工程胚培養(yǎng)技術(shù)胚培養(yǎng)技術(shù) 依據(jù)所剝離胚的發(fā)育時期不同：依據(jù)所剝離胚的發(fā)

26、育時期不同：培養(yǎng)類型培養(yǎng)類型幼胚培養(yǎng)幼胚培養(yǎng)(immature embryo)成熟胚培養(yǎng)成熟胚培養(yǎng)(mature embryo)子葉形成之前子葉形成之前子葉形成之后子葉形成之后細胞工程細胞工程胚培養(yǎng)技術(shù)胚培養(yǎng)技術(shù) 成熟胚培養(yǎng)成熟胚培養(yǎng)成熟胚珠成熟胚珠合點合點珠心珠心珠被珠被珠柄珠柄珠孔珠孔胚囊胚囊細胞工程細胞工程胚培養(yǎng)技術(shù)胚培養(yǎng)技術(shù) 成熟胚培養(yǎng)：指子葉期至發(fā)育成熟的胚培養(yǎng)。成熟胚是自養(yǎng)的，培養(yǎng)基需要簡單。僅提供一定的溫度、濕度就可以發(fā)芽生成植物體。如種子的發(fā)育。 培養(yǎng)過程： 種子95%酒精消毒選取完好種子70%酒精浸數(shù)秒0.1%升汞或10%次氯酸鈉浸泡無菌水沖洗種子培養(yǎng)幾天剝離種胚接種在培養(yǎng)基

27、上。 成熟胚培養(yǎng)一般較易獲得成功。成熟胚培養(yǎng)一般較易獲得成功。細胞工程細胞工程胚培養(yǎng)技術(shù)胚培養(yǎng)技術(shù)-成熟胚培養(yǎng)成熟胚培養(yǎng)細胞工程細胞工程牡丹成熟胚的離體培養(yǎng)與快速繁殖牡丹成熟胚的離體培養(yǎng)與快速繁殖細胞工程細胞工程胚培養(yǎng)技術(shù)胚培養(yǎng)技術(shù)-幼胚培養(yǎng)：是指處于原胚期、球形期、心形期、魚雷期的胚培養(yǎng)；幼胚完全是異養(yǎng)的，離體條件下培養(yǎng)要求培養(yǎng)基成分復(fù)雜，培養(yǎng)不易成功。 幼胚培養(yǎng)的基本程序取子房常規(guī)表面消毒解剖鏡下，取胚珠、去珠被、取出完整幼胚固體培養(yǎng)細胞工程細胞工程黃瓜幼胚培養(yǎng)細胞工程細胞工程 影響幼胚培養(yǎng)成功的因素影響幼胚培養(yǎng)成功的因素 培養(yǎng)基：無機鹽、碳水化合物、激素等 環(huán)境條件(溫度：多數(shù)為25-3

28、0，因植物種類有所差別。光照：一般認(rèn)為黑暗或弱光條件較為合適。) 提高幼胚的成活率，可采用胚乳看護培養(yǎng)。細胞工程細胞工程 胚齡與胚性發(fā)育的關(guān)系胚齡與胚性發(fā)育的關(guān)系 胚齡越小，離體培養(yǎng)越困難； 胚的發(fā)育分為自養(yǎng)期和異養(yǎng)期；細胞工程細胞工程胚乳培養(yǎng)胚乳培養(yǎng) 胚乳培養(yǎng)（Endosperm culture）：是指將胚乳組織從母體上分離出來，通過離體培養(yǎng)，使其發(fā)育成完整植株的技術(shù)。 被子植物胚乳是由2個單倍的極核和1個單倍的精子結(jié)合而成的3倍體組織。由它可獲得無子結(jié)實的3倍體植株，進而可將它加倍成6倍體植株。細胞工程細胞工程 1.胚乳離體培養(yǎng)的意義胚乳離體培養(yǎng)的意義v胚乳培養(yǎng)再生植株證明了全能性理論；v

29、研究胚和胚乳的關(guān)系及胚乳組織的功能；v再生植株多為三倍體，產(chǎn)生無籽果實；v可以從胚乳愈傷中分離和篩選各種類型的非整倍體植株。v胚乳細胞是研究淀粉、蛋白質(zhì)和脂類天然產(chǎn)物代謝途徑的理想系統(tǒng)。細胞工程細胞工程2.胚乳培養(yǎng)技術(shù)胚乳培養(yǎng)技術(shù)胚乳培養(yǎng)過程胚乳培養(yǎng)過程 含胚乳的果實或種子表面消毒無菌條件下胚乳的剝離接種培養(yǎng)基培養(yǎng) 培養(yǎng)室溫度25-27，黑暗或弱光下細胞工程細胞工程 影響植物胚乳培養(yǎng)的主要因素影響植物胚乳培養(yǎng)的主要因素 基因型：基因型： 胚乳是一種獨特的組織，在被子植物中它是雙受精的產(chǎn)物，在倍性上屬于三倍體，事實上我們培養(yǎng)胚乳的首要目的也是為了直接獲得三倍體植株。 胚乳的發(fā)生類型和發(fā)育程度：胚

30、乳的發(fā)生類型和發(fā)育程度：胚乳處于細胞形成期并仍保持旺盛分生能力。（游離胚乳核時期和成熟胚乳時期均不適合）。 培養(yǎng)基培養(yǎng)基細胞工程細胞工程胚乳培養(yǎng)技術(shù)胚乳培養(yǎng)技術(shù) 胚乳培養(yǎng)的器官發(fā)生胚乳培養(yǎng)的器官發(fā)生 愈傷組織形成、器官發(fā)生 （1）愈傷組織的誘導(dǎo) （2）愈傷組織的再分化 （3）胚乳苗的生根培養(yǎng)細胞工程細胞工程胚珠和子房培養(yǎng)胚珠和子房培養(yǎng)柱頭柱頭花柱花柱子房子房花梗花?；ㄍ谢ㄍ谢ńM成花組成胚囊胚囊卵細胞卵細胞株心株心珠珠 孔孔反足細胞反足細胞珠珠 被被胚珠胚珠極核極核 株柄株柄細胞工程細胞工程細胞工程細胞工程1.胚珠培養(yǎng)和子房培養(yǎng)的意義胚珠培養(yǎng)和子房培養(yǎng)的意義 胚珠培養(yǎng)的意義:u防止雜種胚早期敗育

31、，獲得雜種植株；u受精前胚珠培養(yǎng)，可作為試管受精的基礎(chǔ)；u未受精胚珠培養(yǎng)，能培養(yǎng)獲得單倍體植株，用于單倍體育種 子房培養(yǎng)的意義:u獲得雜種植株；u未授精子房培養(yǎng)為試管受精提供技術(shù)基礎(chǔ)；u未受精子房培養(yǎng)能獲得獲得單倍體植株，用于單倍體育種細胞工程細胞工程2.胚珠培養(yǎng)和子房培養(yǎng)的技術(shù)胚珠培養(yǎng)和子房培養(yǎng)的技術(shù) 胚珠培養(yǎng)：將胚珠從母株中分離出來，放在無菌的人工環(huán)境條件下，讓其進一步生長發(fā)育，以致形成幼苗的過程。 根據(jù)胚珠是否受精分為兩類： 受精胚珠的培養(yǎng) 未受精胚珠的培養(yǎng)細胞工程細胞工程胚珠培養(yǎng)胚珠培養(yǎng)胚珠培養(yǎng)的方法胚珠培養(yǎng)的方法 培養(yǎng)受精胚珠，摘取授粉時間合適的子房，如培養(yǎng)未受精胚珠，則在授粉前摘取子房表面滅菌剖開子房壁，取出胚珠或帶胚珠的胎座接種培養(yǎng)。影響胚珠培養(yǎng)成功的因素影響胚珠培養(yǎng)成功的因素 材料的選擇 發(fā)育時期 胎座組織 培養(yǎng)基 細胞工程細胞工程 子房培養(yǎng)：將子房從母株上摘下，放在無菌的人工環(huán)境條件下，讓其進一步生長發(fā)育，以至形成幼苗的過程。包括授粉子房和未授粉子房培養(yǎng)。 受精后的子房仍需進行表面消毒后再接種。而未受精子房可將花被表面消毒后，在無菌條件下直接剝?nèi)∽臃拷臃N。 子房培養(yǎng)只需較簡單的培養(yǎng)基即可形成果實，并含成熟種子。 授粉或授粉后