第8章蛋白質(zhì)分析和膜泡轉(zhuǎn)運(yùn)

1、第8章 蛋白質(zhì)分選與膜泡運(yùn)輸主講：張東旭 副教授電話mail:第一節(jié) 細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的分選 細(xì)胞內(nèi)合成的蛋白質(zhì)之所以能夠定向的轉(zhuǎn)運(yùn)到特定的細(xì)胞器取決于蛋白質(zhì)中包含的特殊信號序列和細(xì)胞器上特定的信號識別裝置。一、信號假說與蛋白質(zhì)分選信號 蛋白質(zhì)的分選（protein sorting） 信號序列的發(fā)現(xiàn)和證實(shí)1972年Milstein等發(fā)現(xiàn)骨髓瘤細(xì)胞中提取的免疫球蛋白分子的N端要比分泌到細(xì)胞外的免疫球蛋白分子N端的氨基酸序列多出一截。1975年Blobel和Sabatini等提出了”信號假說信號假說“布洛貝爾因?yàn)榘l(fā)現(xiàn)“蛋白質(zhì)具有控制其在細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)移和定位的信號”而獲得1999年

2、度諾貝爾生理學(xué)/醫(yī)學(xué)獎。 G. Blobel1. 信號假說信號肽（signal peptide）信號識別顆粒（signal recognition particle，SRP）信號識別顆粒的受體（又稱停泊蛋白，docking protein，DP）（1）信號肽（signal peptide） 位于蛋白質(zhì)的N 端，一般由1626 個殘基組成 包括疏水核心區(qū)疏水核心區(qū)、信號肽的信號肽的C 端端和N 端端等3 部分 原核細(xì)胞某些分泌性蛋白的N 端也具有信號序列信號肽的一級結(jié)構(gòu)序列信號肽的一級結(jié)構(gòu)序列信號肽似乎沒有嚴(yán)格的專一性（2）信號識別顆粒（SRP） 由6 種不同的蛋白質(zhì)和一個由300 個核苷酸組成

3、的 7S RNA 結(jié)合組成的一種核糖核蛋白復(fù)合體蛋白質(zhì)翻譯過程與SRP、DP和微粒體的關(guān)系 體外非細(xì)胞系統(tǒng)（cell free system）進(jìn)行蛋白質(zhì)合成實(shí)驗(yàn)，證實(shí)分泌性蛋白向rER（微粒體）腔內(nèi)的轉(zhuǎn)運(yùn)是同蛋白質(zhì)翻譯過程偶聯(lián)進(jìn)行的，這種分泌蛋白在信號肽引導(dǎo)下邊翻譯邊跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)的過程稱為共翻譯轉(zhuǎn)運(yùn) （cotranslational translocation）（3）分泌性蛋白的合成與其共翻譯轉(zhuǎn)運(yùn)分泌性蛋白的合成與其跨越內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜的共翻譯轉(zhuǎn)運(yùn)圖解 圖示信號肽、SRP、DP 及移位子之間的相互作用（3）分泌性蛋白的合成與其共翻譯轉(zhuǎn)運(yùn)（3）分泌性蛋白的合成與其共翻譯轉(zhuǎn)運(yùn)（4）膜整合蛋白的信號序列 開始轉(zhuǎn)

4、移序列（start transfer sequence） 內(nèi)在停止轉(zhuǎn)移錨定序列（internal stop-transfer anchor sequence, STA） 內(nèi)在信號錨定序列（internal signal anchor sequence, SA）內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜整合蛋白的拓?fù)鋵W(xué)類型 2. 蛋白質(zhì)分選信號序列信號肽與信號斑二、蛋白質(zhì)分選轉(zhuǎn)運(yùn)的基本途徑與二、蛋白質(zhì)分選轉(zhuǎn)運(yùn)的基本途徑與類型類型 途徑途徑（1）后翻譯轉(zhuǎn)運(yùn)途徑（2）共翻譯轉(zhuǎn)運(yùn)途徑 類型類型（1）蛋白質(zhì)的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)（2）膜泡運(yùn)輸（3）選擇性的門控轉(zhuǎn)運(yùn)（4）細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)中蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn) 1. 翻譯后轉(zhuǎn)運(yùn)途徑：在細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)游離核糖體上完成多肽

5、鏈合成，然后轉(zhuǎn)運(yùn)至膜圍繞的細(xì)胞器，如線粒體、葉綠體、過氧化物酶體、細(xì)胞核及細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)的特定部位。 2. 共翻譯轉(zhuǎn)運(yùn)途徑：蛋白質(zhì)合成起始后轉(zhuǎn)移至粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，新生肽邊合成邊轉(zhuǎn)入粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔中，隨后經(jīng)高爾基體轉(zhuǎn)運(yùn)至溶酶體、細(xì)胞膜或分泌到細(xì)胞外，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)與高爾基體本身的蛋白也是通過這條途徑分選的。蛋白質(zhì)分選的基本途徑 跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)：主要指再細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)中合成的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、線粒體、質(zhì)體（包括葉綠體）和過氧化物酶體等細(xì)胞器。 膜泡運(yùn)輸：蛋白質(zhì)通過不同類型的轉(zhuǎn)運(yùn)小泡從糙面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)合成部位轉(zhuǎn)運(yùn)至高爾基體，進(jìn)而分選轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞的不同部位，其中涉及各種不同的運(yùn)輸小泡的定向轉(zhuǎn)運(yùn)，以及膜泡出芽與融合的過程。 選擇性的門控

6、轉(zhuǎn)運(yùn)：在細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)中合成的蛋白質(zhì)通過核孔復(fù)合體選擇性地完成核輸入或從細(xì)胞核返回細(xì)胞質(zhì)（核輸出）。 細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)中蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn)：可能與細(xì)胞骨架系統(tǒng)相關(guān)。蛋白質(zhì)分選轉(zhuǎn)運(yùn)的4種基本類型真核細(xì)胞蛋白質(zhì)分選的主要途徑與類型三、蛋白質(zhì)向線粒體、葉綠體和過氧化物酶體的分選信號肽導(dǎo)肽轉(zhuǎn)運(yùn)肽PTS1/PTS2核定位信號NLS（一）蛋白質(zhì)從細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)輸入到線粒體 蛋白質(zhì)從細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)輸入到線粒體基質(zhì) 蛋白質(zhì)從細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)輸入到線粒體內(nèi)膜 蛋白質(zhì)從細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)輸入到 線粒體膜間隙蛋白質(zhì)從細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)輸入到線粒體基質(zhì)線粒體蛋白通過3 種途徑從細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)輸入到線粒體內(nèi)膜線粒體蛋白通過兩種途徑從細(xì) 胞質(zhì)基質(zhì)輸入到線粒體膜間隙核基因

7、編碼的線粒體蛋白的轉(zhuǎn)運(yùn)（二）葉綠體基質(zhì)蛋白與類囊體蛋白的靶向輸入 外膜蛋白 內(nèi)膜蛋白 葉綠體基質(zhì)蛋白 類囊體膜蛋白 類囊體腔蛋白葉綠體蛋白從 細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)輸入到類囊體腔（三）過氧化物酶體蛋白的分選 C端SKL(Ser-Lys-Leu)靶向序列 可溶性細(xì)胞質(zhì)受體 過氧化物酶體膜受體 信號序列不被切除 ATP水解(?)第二節(jié) 膜泡轉(zhuǎn)運(yùn)細(xì)胞猶如繁忙而巨大的港口，將正確的貨物在正確的時間運(yùn)送細(xì)胞猶如繁忙而巨大的港口，將正確的貨物在正確的時間運(yùn)送到正確的地點(diǎn)是最為要緊的，囊泡就是港口的到正確的地點(diǎn)是最為要緊的，囊泡就是港口的“穿梭巴士穿梭巴士”。人們早已了解大量分子人們早已了解大量分子(即即“乘客乘客”)

8、是是“搭乘搭乘”囊泡在細(xì)胞內(nèi)囊泡在細(xì)胞內(nèi)外往來，卻一直不了解這輛巴士是如何確定自己的啟程時間及外往來，卻一直不了解這輛巴士是如何確定自己的啟程時間及目的地的。目的地的。 蘭迪謝克曼 早在上世紀(jì)早在上世紀(jì)70年代，蘭迪年代，蘭迪謝克曼便利用酵母作為模謝克曼便利用酵母作為模型，開始研究其遺傳學(xué)基礎(chǔ)。在基因篩選過程中，型，開始研究其遺傳學(xué)基礎(chǔ)。在基因篩選過程中，謝克曼分離出一類異常轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制的酵母細(xì)胞。這株謝克曼分離出一類異常轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制的酵母細(xì)胞。這株酵母的酵母的“運(yùn)輸狀況運(yùn)輸狀況”與混亂的公共交通系統(tǒng)類似，與混亂的公共交通系統(tǒng)類似，囊泡都堆積在細(xì)胞的某一個角落。隨后，謝克曼發(fā)囊泡都堆積在細(xì)胞的某一個角

9、落。隨后，謝克曼發(fā)現(xiàn)了導(dǎo)致這一擁堵狀況的罪魁禍?zhǔn)赚F(xiàn)了導(dǎo)致這一擁堵狀況的罪魁禍?zhǔn)?類編碼調(diào)節(jié)類編碼調(diào)節(jié)囊泡運(yùn)輸關(guān)鍵蛋白的基因。囊泡運(yùn)輸關(guān)鍵蛋白的基因。 上世紀(jì)80年代90年代，詹姆斯羅斯曼在哺乳動物細(xì)胞研究中發(fā)現(xiàn)了囊泡與“乘客”精確對接的奧秘囊泡的膜及目的細(xì)胞器的膜上均有高度特異性的蛋白復(fù)合物，兩者能夠像拉鏈一樣緊密嵌合，從而使囊泡融合到細(xì)胞膜之中，由此解決了囊泡“釋放”問題，確保了“乘客”準(zhǔn)確、及時到達(dá)。更為重要的是，回顧蘭迪謝克曼發(fā)現(xiàn)的控制囊泡運(yùn)輸?shù)年P(guān)鍵基因中，含有編碼詹姆斯羅斯曼教授所發(fā)現(xiàn)的蛋白質(zhì)復(fù)合物的基因，說明囊泡運(yùn)輸在進(jìn)化上的保守性。從低等生物(酵母)到高等生物(哺乳動物)均存在囊泡

10、運(yùn)輸，說明它是生命活動的基本途徑。 如果說羅斯曼與謝克曼的發(fā)現(xiàn)可以解釋囊泡作為一輛“穿梭巴士”是如何準(zhǔn)確接送“乘客”的，那么祖德霍夫的研究成果則闡明細(xì)胞運(yùn)輸系統(tǒng)在時間上的精確性，并指出“乘客”須有指令方能下車的信號問題。上世紀(jì)90年代，祖德霍夫聚焦于神經(jīng)細(xì)胞中的鈣離子敏感蛋白，描摹出鈣離子流動的分子機(jī)制，并發(fā)現(xiàn)了突觸囊泡感受外界信號的關(guān)鍵因子和關(guān)鍵蛋白鈣離子和鈣結(jié)合蛋白，通過它們，突觸小泡接受信號，快速準(zhǔn)確地釋放，完成神經(jīng)信號的傳遞。 一、膜泡運(yùn)輸概觀一、膜泡運(yùn)輸概觀1. 蛋白質(zhì)在rER 合成，通過共翻譯轉(zhuǎn)運(yùn)途徑跨膜運(yùn)輸2. 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)出芽，形成轉(zhuǎn)運(yùn)膜泡并與高爾基體融合3. 從高爾基體順面膜囊和高

11、爾基體順面網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)到rER的逆向運(yùn)輸4. 高爾基體膜囊從順面反面成熟遞進(jìn)（非膜泡過程）5. 從高爾基體后期膜囊早期膜囊的逆向運(yùn)輸6. 組成型分泌7. 調(diào)節(jié)型分泌8. 分選到溶酶體9. 胞吞途徑蛋白質(zhì)的分泌與胞吞途徑概觀蛋白質(zhì)的分泌與胞吞途徑概觀三種包被的膜泡 COP（coat protein ） 包被膜泡 COP（coat protein）包被膜泡 網(wǎng)格蛋白/ 接頭蛋白（clathrin/ adaptor protein）包被膜泡三種包被膜泡特征比較二、二、COP 包被膜泡的裝配與運(yùn)輸包被膜泡的裝配與運(yùn)輸 COP包被蛋白組分 小分子GTP 結(jié)合蛋白Sar1 Sec23/Sec24 復(fù)合物 Se

12、c13/Sec31 復(fù)合物 大的纖維蛋白Sec16細(xì)胞質(zhì)中可溶性 Sar1- GDP 與ER 膜蛋白Sec12（鳥苷酸交換因子）相互作用， 催化GTP 置換GDP 形成Sar1-GTP，GTP 的結(jié)合引發(fā) Sar1 構(gòu)象改變暴露出疏水N 端并插入ER 膜，膜結(jié)合Sar1 對包被蛋白進(jìn)一步裝配起募集者作用小分子GTP 結(jié)合蛋白Sar11. Sar1與膜結(jié)合與膜結(jié)合GTP交換交換 2. COP包被裝配包被裝配 3. GTP水解水解 4. COP包被去裝配包被去裝配Sar1 蛋白在Cop包被膜泡裝配與去裝配中作用在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)與高爾基體之間，分別由COP和COP膜泡介導(dǎo)蛋白質(zhì)順向和逆向轉(zhuǎn)運(yùn)不同類型的膜泡運(yùn)

13、輸 KDEL 受體在從高爾基體回收內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔駐留蛋白中的作用不同類型的膜泡運(yùn)輸 在供體膜內(nèi)質(zhì)網(wǎng)出芽及其轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的包裝示意圖不同類型的膜泡運(yùn)輸 三、三、COP 包被膜泡的裝配與運(yùn)輸包被膜泡的裝配與運(yùn)輸COP包被含有7 種不同的蛋白質(zhì)亞基和一種調(diào)節(jié)膜泡轉(zhuǎn)運(yùn)的 GTP 結(jié)合蛋白ARF。ARF 也是一種結(jié)合 GDP/GTP 轉(zhuǎn)換的分子開關(guān)調(diào)控蛋白。包被蛋白復(fù)合物 的裝配與去裝配依賴于ARF 所結(jié)合的核苷酸交換與水解過程KDEL 的受體主要定位在高 爾 基 體 T G N 區(qū) 、COP和COP包被膜泡的膜上，它們能識別并 結(jié)合KDEL 分選信號。如果在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)發(fā) 生錯誤包裝和轉(zhuǎn)運(yùn)，由于COP膜泡上也有KDE

14、L 受體，所以也能保證逃逸蛋白被內(nèi)質(zhì)網(wǎng)回收KDEL 的受體四、網(wǎng)格蛋白四、網(wǎng)格蛋白/接頭蛋白包被膜泡的接頭蛋白包被膜泡的裝配與運(yùn)輸裝配與運(yùn)輸 網(wǎng)格蛋白/ 接頭蛋白包被膜泡介導(dǎo)的蛋白質(zhì)分選途徑 從高爾基體TGN向胞內(nèi)體或向溶酶體、 黑（色）素體、血小板囊泡和液泡的運(yùn)輸 受體介導(dǎo)的胞吞途徑中負(fù)責(zé)將物質(zhì)從細(xì)胞表面運(yùn)往胞內(nèi)體轉(zhuǎn)而到溶酶體的運(yùn)輸網(wǎng)格蛋白及其包被膜泡的形成五、轉(zhuǎn)運(yùn)膜泡與靶膜的錨定與融合五、轉(zhuǎn)運(yùn)膜泡與靶膜的錨定與融合 供體膜的出芽、裝配和斷裂，形成不同的包被轉(zhuǎn)運(yùn)膜泡 在細(xì)胞內(nèi)由馬達(dá)蛋白驅(qū)動、以微管為軌道的膜泡運(yùn)輸 轉(zhuǎn)運(yùn)膜泡與特定靶膜的錨定和融合過過 程程胞質(zhì)中Rab 蛋白在特異性鳥苷酸交換因子（GEF）催化下，Rab-GDP 轉(zhuǎn)換為Rab-GTP，構(gòu)象改變致使其通過類異戊二烯基團(tuán)插入轉(zhuǎn)運(yùn)膜泡表面，與靶膜上Rab 效應(yīng)器結(jié)合蛋白相互作用，從而使轉(zhuǎn)運(yùn)膜泡被錨定在靶膜上Rab 蛋白參與膜泡的錨定供體膜和靶膜之間膜泡的錨定與融合模式六、細(xì)胞結(jié)構(gòu)體系的組裝六、細(xì)胞結(jié)構(gòu)體