感覺和運動神經(jīng)來源的雪旺細胞p75受體表達

1、感覺和運動神經(jīng)來源的雪旺細胞p75受體表達淺談【摘要】目的研究感覺神經(jīng)和運動神經(jīng)來源的雪旺細胞(sc)表達低親和力受體(p75)的情況。方法結(jié)合酶消化、阿糖胞苷處理和s-100免疫熒光鑒定，從5d齡sd乳鼠背根神經(jīng)和股神經(jīng)得到感覺和運動神經(jīng)來源的sc。2種細胞分別進行普通培養(yǎng)基和添加高濃度白細胞介素(il)-1培養(yǎng)基的培養(yǎng)，檢測不同時間sc表面神經(jīng)生長因子p75的表達情況。結(jié)果感覺和運動sc普通培養(yǎng)基組p75受體表達方式明顯不同，前者在第5d迅速達到峰值(1086.39±535.16)，而后者在同期呈低水平(410.50±326.55，p0.05)；而添加il-1組2種細胞

2、的表達基本一致，均在第5d達到峰值(891.50±406.10、922.32±520.25，p0.05)后均迅速下降。結(jié)論2種神經(jīng)來源的sc表達p75受體存在差異，提示sc在再生過程中存在感覺性和運動性的差異。   【abstract】 objective to study the p75 expression of schwann cells (sc) derived from sensory and motor nerves.methods sc derived from dorsal root nerve or femoral nerve were take

3、n in 5 day old sd rats and cultured in dmem/f12, 10% fcs media with or without high-dosage interteukin (il)-1 added. the expression of p75 was detected by using immunofluorescent method at indicated time points.results without il-1 in media, the expression patterns of two groups of sc were different

4、. sensory sc displayed a peak expression at 5th day, and at the same time, the expression of motor sc was relatively lower (p0.05). in the prese nce of il-1 in media, the curves of p75 expression tended to be alike, and it reached the peak at 5th day (p0.05) and went downwards.conclusion there is a

5、biological difference between sensory and motor sc, indicating a difference in sensory and motor exists in specific regeneration of peripheral nerves. 【key words】 schwann cell; motor; sensory; interleukin-1; p75 receptor 在神經(jīng)損傷后雪旺細胞(sc)重新增殖、分化，重新包裹軸突的過程中，sc是否有感覺性雪旺細胞(ssc)和運動性雪旺細胞(msc)之分如果這樣，則有助于我們理解神

6、經(jīng)特異性再生。由于sc及神經(jīng)元表面均有低親和力(p75)受體表達1，那么在再生過程中，sc和神經(jīng)元可能同時受到來源于末端靶器官和自身分泌的神經(jīng)生長因子(ngf)的作用，研究p75的表達可以反映二者之間的作用關(guān)系。我們通過添加明顯高于病理水平的高濃度白細胞介素(il)-1 (10000u/l)公司觀察ssc和msc的p75表達的反應(yīng)性，旨在探索2種sc的p75受體表達的規(guī)律，為解釋特異性再生提供依據(jù)。 材料和方法 1.細胞培養(yǎng)2：無菌取5d齡sd乳鼠的背根神經(jīng)和股神經(jīng)運動支，解剖顯微鏡下剔除結(jié)締組織和神經(jīng)外膜，剪碎后加入質(zhì)量分數(shù)為0.25%胰蛋白酶(sigma公司)和質(zhì)量分數(shù)為0.25%膠原酶(

7、sigma公司)，37消化40min，細胞懸液接種于預(yù)先包被濃度為1g/l的多聚賴氨酸(sigma公司)的petri培養(yǎng)皿，孵育箱中培養(yǎng)(37，體積分數(shù)為5%co2)。培養(yǎng)基含有體積分數(shù)為90%dmem/f12(11)(gibco公司)、體積分數(shù)10%小牛血清、25mmol/l hepes(sigma公司)及青、鏈霉素。48h后加入10-5g/l的阿糖胞苷(ara-c)處理2d。 2.細胞免疫熒光、碘化丙啶雙重染色：細胞鑒定及受體檢測使用免疫熒光染色技術(shù)，用碘化丙啶雙重標(biāo)記目的是確定細胞輪廊，便于計算每個細胞的熒光值。以檢測p75受體步驟為例：傾去petri培養(yǎng)皿中的培養(yǎng)基，磷酸鹽緩沖溶液(p

8、bs)洗滌，體積分數(shù)為1%多聚甲醛固定15min，pbs洗滌，150羊抗鼠p75受體抗體(武漢博士德)50l,90min(37)，pbs洗滌，150兔抗羊異硫氰酸熒光素標(biāo)記抗體(igg-fitc，武漢博士德) 50l，30min(37)，pbs洗滌，5mg/l 碘化丙啶50l，室溫20min，pbs洗滌后進行掃描。 3.受體檢測：按上述方法培養(yǎng)的2種sc，分別接種到8個petri培養(yǎng)皿，按隨機的方法記號為18號，將每組的4對培養(yǎng)皿規(guī)定單號加入常規(guī)培養(yǎng)基，雙號為添加10000u/l il-1(北京邦定公司)的培養(yǎng)基。在培養(yǎng)的第3、5、7、9d按順序各取1對進行p75受體免疫熒光和碘化丙啶雙重染色

9、，方法如上說明。 結(jié)果 1.雪旺細胞培養(yǎng)：光鏡下根據(jù)sc的典型形態(tài)判斷，ssc的純度達到79%，msc則達到90%；s-100是sc膜表面表達的特異性蛋白，通過熒光標(biāo)記的抗s-100單克隆抗體，利用抗原抗體特異性結(jié)合的原理，可以識別出 sc。操作方法類似以上p75的檢測，只需調(diào)整為相應(yīng)的一抗和二抗。用該法計算ssc的純度可達87%，msc可達95%?；祀s的細胞一般是成纖維細胞。 2.受體表達：普通培養(yǎng)條件下，ssc與msc第3d p75表達的平均水平是接近的，分別為217.63±235.95、252.54±263.91(p0.05)，第5d ssc的p75表達出現(xiàn)峰值，達1

10、086.39±535.16，高出同期msc 410.51±326.55 2倍以上(p0.05)，其后在第7d(964.46±441.70)、第9d(330.71±205.14)呈下降趨勢，而msc的p75表達曲線則表現(xiàn)較低水平的平直趨勢，在第9d(511.31±757.23)超過ssc。 在添加高濃度il-1的培養(yǎng)條件下，2種細胞p75表達呈現(xiàn)較一致的趨向，即在第3d均處于較低水平ssc:228.18±222.13、msc：355.09±312.72，在第5d出現(xiàn)峰值(891.54±406.10、922.32

11、77;520.25，p0.05)，其后表達下降，ssc下降較慢，觀察期內(nèi)降至625.75±453.53，msc則又降至253.80±254.81，p0.05。 討論 本實驗取自股神經(jīng)運動支和背根神經(jīng)組織，通過培養(yǎng)過程中觀察細胞形態(tài)，抗s-100免疫熒光標(biāo)記均確定為sc，因此可以確定我們得到的細胞是感覺神經(jīng)源和運動神經(jīng)源性sc。為探討二者是否存在差異性，我們進一步從生物學(xué)方面進行了研究。在再生過程中，神經(jīng)元和sc的作用是交互的。有研究表明，神經(jīng)離斷后3h近端即有軸芽長出，其生長不需要任何基質(zhì)成分，但延伸速度處于慢相期，方向隨機，2d之后，sc增殖遷出，沿已有的軸突迅速延伸，并

12、超過軸突，此時軸突的生長度進入快相期，而且其生長方向趨向一致3。sc表面的ngf受體主要是p75，這種受體的效應(yīng)與trk不同，它主要是促進細胞的分化和遷移1。 本實驗結(jié)果顯示，離體培養(yǎng)時，ssc與msc在常規(guī)培養(yǎng)基中p75受體表達的區(qū)別提示ssc在較低il-1濃度時即表現(xiàn)對損傷較高的反應(yīng)性。nikam等4的研究表明，sc的p75受體的表達與鋅指轉(zhuǎn)錄因子zif268的關(guān)系密切，而該轉(zhuǎn)錄因子則參與了使靜止的、形成髓鞘的sc轉(zhuǎn)化成易化神經(jīng)修復(fù)的增殖狀態(tài)的sc。結(jié)合kojun等3的研究，可以推測感覺性神經(jīng)纖維在再生時會較早接觸同性質(zhì)的膠質(zhì)細胞，這也與臨床病人的感覺恢復(fù)較早、較好現(xiàn)象相符；我們在本實驗使

13、用含有遠高于生理濃度的il-1的培養(yǎng)基5，2種細胞的表面曲線近乎一致，說明2種細胞存在共性，也說明對于msc，可能另有因素影響其p75的表達。本實驗的結(jié)果初步說明2種來源的sc在神經(jīng)再生過程中存在區(qū)別，為進一步研究sc促進神經(jīng)特異性再生的分子機制打下基礎(chǔ)。      參考文獻 1，anton es, weskamp g, reichardt lf, et al. nerve growth factor and its low-affinity receptor promote schwann cell migration. proc natl acad sci u

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