提取工藝川桐皮中總黃酮的提取工藝研究

1、金 華 職 業(yè) 技 術(shù) 學(xué) 院JIN HUA COLLEGE OF PROFESSION AND TECHNOLOGY畢業(yè)教學(xué)環(huán)節(jié)成果(2012屆)題 目川桐皮中總黃酮的提取工藝研究學(xué) 院 制藥與材料工程學(xué)院 專 業(yè) 生物制藥技術(shù) 班 級 制藥 093 學(xué) 號 200931100380346 姓 名 羅超超 指導(dǎo)教師 鄭柏勤 2012年5月22日金華職業(yè)技術(shù)學(xué)院畢業(yè)教學(xué)環(huán)節(jié)成果目錄摘要11 材料與設(shè)備21.1 材料 2 實驗藥材2 1.1.2 化學(xué)試劑21.2 儀器與設(shè)備 2 2 方法與結(jié)果3 2.1總黃酮含量的測定103標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備32.1.2 樣品液制備與樣品總黃酮含量的測定32.2 提

2、取工藝研究4 2.2.1 提取溶劑對提取率的影響4 2.2.2 粉碎度對提取率的影響42.2.3 乙醇濃度對提取率的影響5 2.2.4 浸提時間對提取率的影響6 2.2.5 浸提溫度對提取率的影響 6 2.2.6 液料比對川桐皮黃酮類化合物提取的影響72.2.7 正交試驗83結(jié)果與討論9 參考文獻(xiàn) 10 謝辭11 川桐皮中總黃酮的提取工藝研究制藥與材料工程學(xué)院生物制藥技術(shù)專業(yè) 羅超超摘要：為充分利用川桐皮資源，對川桐皮中總黃酮的提取工藝進(jìn)行研究 ，對乙醇濃度、溫度、時間、料液比分別進(jìn)行了單因素試驗和正交試驗。結(jié)果表明，乙醇提取法的最佳工藝條件為：提取溫度 70 ，乙醇濃度 70，提取時間 12

3、0min，料液比1:25(g/mL)，該工藝條件下提取總黃酮含量為54.12 mg/g。關(guān)鍵詞：川桐皮 正交試驗 總黃酮 提取Study on Extraction Technology of Total Flavonoids from Cortex KalopanacisLUO Chao-chao( Major of Biopharmaceutical Technology, School of Pharmaceutical Science and Materials Engineering)Abstract：To make full use of Cortex Kalo

4、panacis resources, the extraction technology of total flavonoids from Cortex Kalopanacis was studied by single factor tests and orthogonal experiment design method. The optimized extraction technology was that the Cortex Kalopanacis were extracted by 70% ethanol at 70 with a material- liqu

5、id ratio of 1:25(g/mL) for 120 min. With this technological conditions, the concentration 54.12 mg/g of the total flavonoids extraction was obtained.Key words：Cortex Kalopanacis Orthogonal experiment Total flavonoids Extraction川桐皮為五加科植物刺楸 Kalopanaxsepteml- obus (Thunb.) Koidz.或毛刺楸 K. septem lob

6、us var. margni cus(Zabel) Hand-Mazz. 的干燥樹皮。刺楸為落葉喬木，枝有粗刺。生于山地疏林中。產(chǎn)于安徽、湖北、湖南、廣西。全年可采，以春季為好，曬干1。依照現(xiàn)行的四川省中藥材標(biāo)準(zhǔn)（1987 年版）收載了川桐皮的性狀、鑒別、炮制、性味、功能與主治、用法用量和貯藏的內(nèi)容。性狀為質(zhì)脆，斷面纖維性，略呈層片狀。性味為氣微，味微辛，略有麻舌感。功能與主治為具有祛風(fēng)濕，通絡(luò)，止痛作用。用于類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、腰膝疼痛、外用跌打損傷2。樹皮含黃酮、香豆素、樹酯、精油及少量生物堿;根皮含刺楸毒甙（kalotoxin）、刺楸皂甙3。生物總黃酮是指黃酮類化合物，是一大類天然產(chǎn)物。黃酮

7、類化合物是指具有C6-C3-C6基本結(jié)構(gòu)的天然產(chǎn)物，大部分是色原酮的衍生物，根據(jù)兩端苯環(huán)與中間三碳的連接方式、位置、直連或環(huán)及其氧化水平，衍生而成的一大類化合物。黃酮類化合物具有抗菌、抗炎、抗病毒、抗腫瘤、保肝、止咳祛痰、抗氧化和雌激素樣的作用4-8。黃酮類化合物廣泛存在于植物中，主要有黃酮和黃酮醇、二氫黃酮和二氫黃酮醇、異黃酮和二氫異黃酮、查耳酮和二氫查耳酮類、橙酮類、花色素和黃烷醇類、其他黃酮類七大類9。由于人工合成的總黃酮存在著副作用大及價格昂貴等多方面缺陷，人們逐漸把注意力轉(zhuǎn)向從植物中提取總黃酮，從天然物質(zhì)中提取的總黃酮具有較好的藥理作用，且毒副作用小?？傸S酮的主要提取方法是有機(jī)溶劑提

8、取法、超聲波輔助提取法、微波提取法、超臨界 CO2萃取法、酶浸漬萃取法、超高壓輔助提取法等等。比較各提取方法的優(yōu)缺點和考慮到當(dāng)前的實驗室條件，本研究采用有機(jī)溶劑提取法。目前對于川桐皮的有關(guān)研究國內(nèi)報導(dǎo)的比較少。鑒于此，筆者探討川桐皮中的總黃酮提取工藝參數(shù)，旨在尋找一種提高川桐皮中總黃酮提取量的方法，也為全面開發(fā)利用川桐皮資源提供科學(xué)依據(jù)。1 材料與設(shè)備1.1 材料實驗藥材 川桐皮采自四川省成都市山區(qū)，經(jīng)成都中醫(yī)藥大學(xué)中藥鑒定和藥用植物教研室李敏教授鑒定，為五加科植物刺楸KaIopanax septemIobus(Thunb)Koidz或毛刺楸尼septem-lobus vatmargni，ic

9、us(Zabel)Hand-Mazz的干燥樹皮。1.1.2 化學(xué)試劑乙醇 甲醇 石油醚（3060）乙醚：廣東汕頭市西隴化工廠；乙酸乙酯：天津市北方化玻采購銷售中心；丙酮：成都市聯(lián)合化工試劑研究所；濃鹽酸：德陽市孝泉師范化學(xué)試劑廠；氫氧化鈉：重慶北碚精細(xì)化工廠；三氯化鋁 亞硝酸鈉：天津市科密化學(xué)試劑開發(fā)中心；硝酸鋁：天津市福晨化學(xué)試劑廠；以上試劑均為分析純。標(biāo)準(zhǔn)蘆丁（98.5 ）：成都超人植化有限責(zé)任公司。1.2 儀器與設(shè)備DFT一200型手提式高速中藥粉碎機(jī)：溫嶺市大德中藥機(jī)械有限公司；RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器：上海亞榮生華儀器有限公司；SHB-B95型循環(huán)水式多用真空泵：鄭州市長城科工貿(mào)有限

10、公司；HH-S4數(shù)顯恒溫水浴鍋：金壇醫(yī)療器械廠；UV-8紫外可見分光光度計：上海精密科學(xué)儀器有限公司；BPl21S電子天平：德國賽多利斯股份公司。2 方法與結(jié)果2.1總黃酮含量的測定10標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備準(zhǔn)確稱取以五氧化二磷為干燥劑減壓干燥（60 ，0.09 MPa）至恒重的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品0.077g，用60 %乙醇溶解，定容至250 mL，搖勻，得濃度為0.292 6 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)液，放置于低溫暗箱內(nèi)，及時檢測分別吸取標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)用液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 mL于25 mL容量瓶中，用60 %乙醇添至10 mL，加入5 %亞硝酸鈉溶液1.0 mL，搖勻，放置6 min，再加入1

11、0 %硝酸鋁溶液1.0 mL，6 min后加入4 % NaOH10 mL，混勻，再用60 %的乙醇定容至刻度，搖勻，放置15 min后，在波長510 nm處測定吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，見圖1。圖1 蘆丁與吸光度的線性關(guān)系2.1.2 樣品液制備與樣品總黃酮含量的測定準(zhǔn)確稱取1.0 g川桐皮粉，放入索氏抽提器中，用40mL95%的乙醇，回流浸提至回流液呈無色,用乙醇洗滌接收瓶2次3次。合并提取液與洗滌液，定容為適當(dāng)濃度的樣品液30 mL。準(zhǔn)確吸取1.0 mL 樣品液置于25 mL 容量瓶中，用60 %乙醇添至10 mL，其它操作同，測得吸光度A。樣品的總黃酮濃度C=2.079×A+0.03

12、3樣品的總黃酮含量=C×V×25/M式中：M為樣品質(zhì)量，g；V為定容容積，mL ；C為樣品液的總黃酮濃度，（mg/mL）。2.2 提取工藝研究2.2.1 提取溶劑對提取率的影響精確稱取多份2.5g 粉碎度為100 目的川桐皮粉，分別加入水、甲醇、乙醇（95%）、丙酮、乙酸乙酯、石油醚（3060 ）各100 mL，在溶劑沸點溫度下，回流浸提3h，抽濾、洗滌、定容，測定總黃酮含量。結(jié)果見表1、圖2。表1 提取劑種類對提取率的影響溶液種類水甲醇乙醇丙酮乙酸乙酯石油醚總黃酮含量（mg/g)12.4157.8650.1620.399.981.25圖2 提取劑種類對提取率的影響由圖2可

13、見，實驗的幾種溶劑對川桐皮總黃酮提取能力的大小順序是：甲醇>乙醇>丙酮>水>乙酸乙酯>石油醚。2.2.2 粉碎度對提取率的影響 將川桐皮粉碎，篩得20、40、60、80、100、120、140目川桐皮粉備用。精確稱取2.5g不同粉碎度的川桐皮粉，用100 mL95%的乙醇，在溶劑沸點溫度條件下，回流浸提3h，抽濾、洗滌、定容，分別測定總黃酮的含量，結(jié)果見表2、圖3。表2 粉碎度對提取率的影響粉碎粒度/目20406080100120140總黃酮含量（mg/g)5.0513.8632.4237.2636.0238.3235.86圖3 粉碎度對提取率的影響由圖3可以看出

14、，粉碎度不同，川桐皮中總黃酮提取量有很大的差異。粉碎度在20目80目之間時，隨粉碎度的增加，總黃酮的浸提量增加；當(dāng)粉碎度超過80目后，進(jìn)一步提高粉碎度，總黃酮的提取量增加不明顯。2.2.3 乙醇濃度對提取率的影響精確稱取多份2.5g 的80目川桐皮粉，以不同濃度乙醇為提取劑，在沸點溫度條件下，回流浸提3h，抽濾、洗滌、定容，分別測定總黃酮的含量，結(jié)果見表3、圖4。表3 乙醇濃度對提取率的影響乙醇濃度/%（體積濃度）405060708095總黃酮含量/(mg/g)28.12 34.4242.2246.2345.4243.18圖4 乙醇濃度對提取率的影響從圖4可以看出，不同乙醇濃度（體積分?jǐn)?shù)）條件

15、下，川桐皮黃酮類化合物的浸提率差異較大。當(dāng)乙醇濃度為40%70%（體積分?jǐn)?shù)）時，黃酮類化合物的浸出率隨乙醇濃度的增加而提高；乙醇濃度70%（體積分?jǐn)?shù)）時，提取率最高；超過70%（體積分?jǐn)?shù)）時，隨乙醇濃度增加黃酮類化合物浸提率略有降低。2.2.4 浸提時間對提取率的影響精確稱取多份2.5g的80目川桐皮粉，以70%的乙醇溶液為提取劑，在沸點溫度下，分別回流浸提不同時間，抽濾、洗滌、定容，測定黃酮類化合物的含量，結(jié)果見表4、圖5。表4 浸提時間對提取率的影響浸提時間/min6090120150180210總黃酮含量/(mg/g)28.1236.2150.1451.2250.5449.82圖5 浸提

16、時間對提取率的影響從圖5可以看出，浸提時間在120min以內(nèi)，隨提取時間的增加，總黃酮的浸出量也隨之增加。當(dāng)浸提時間超過120min后，川桐皮總黃酮的浸出量增加不明顯。浸提超過150min后，總黃酮量略有降低。2.2.5 浸提溫度對提取率的影響精確稱取多份2.5g的80目川桐皮粉，加入70%（體積分?jǐn)?shù)）乙醇為提取溶劑，分別在25（室溫）、40、50、60、70、80、90條件下回流浸提，抽濾、洗滌、定容，分別測定黃酮類化合物的含量，結(jié)果見表5、圖6。表5 浸提溫度對提取率的影響浸提溫度/25405060708090總黃酮含量/(mg/g)10.1422.2138.1250.4550.9849.

17、8647.16圖6 浸提溫度對提取率的影響從圖6可以看出，溫度低于70后，隨溫度的升高，黃酮類化合物的浸出率提高；25（室溫）時川桐皮黃酮類化合物浸出率最低，70 時黃酮類化合物的浸出率最高。當(dāng)溫度超過70后，其浸出率隨溫度升高而略有下降。2.2.6 液料比對提取率的影響精確稱取2.5g的80目川桐皮粉，分別按料液比/(g/mL)為1:10、1:15、1:20、1:25、1:30加入70%（體積分?jǐn)?shù)）乙醇，在70條件下回流浸提120min，抽濾、洗滌、定容，測定黃酮類化合物的含量，結(jié)果見表6、圖7。表6 液料比對提取率的影響料液比/(g/mL)1:101:151:201:251:30總黃酮含量

18、/(mg/g)28.1836.7650.5554.1256.34 圖7 液料比對提取率的影響從圖7可以看出，隨料液比/(g/mL)從1:10（g/mL）增加為1:25（g/mL），總黃酮的浸出率明顯增加；超過1:25（g/mL）后浸出率增加緩慢。2.2.7 正交試驗在乙醇濃度、液料比、浸提溫度、浸提時間的實驗結(jié)果中，選擇單因子試驗結(jié)果較好的參數(shù)，設(shè)計了正交試驗，結(jié)果見表7、表8。表7 四因素三水平表A料液比/(g/mL)B乙醇濃度/%C時間/minD溫度/11: 20601206021: 25701507031: 308018080表8 正交試驗結(jié)果試驗號A料液比/(g/mL)B乙醇濃度/%C

19、時間/minD溫度/黃酮含量/(mg/g)1111132.012122244.093133339.604212342.575223149.466231252.137313245.288321351.679332143.94K1115.70119.86135.81125.41/K2144.16145.22130.60141.50/K3140.89135.67134.34133.84/R9.4868.4541.7375.364/從正交試驗結(jié)果可以看出，極差RA>RB>RD>RC，液料比對川桐皮中總黃酮浸出率的影響最大，其次是乙醇的濃度,提取的溫度值，提取時間對總黃酮浸出率的影響最

20、小。乙醇回流浸提川桐皮中總黃酮的最佳浸提條件為A2B2C1D2 即料液比為1:25(g/mL)，提取溫度為70 ，提取時間為120 min，乙醇濃度為70 % 在此條件下，3次重復(fù)實驗，川桐皮中總黃酮的含量為54.12 mg/g。3結(jié)果與討論（1）提取溶劑對提取率的影響的實驗可以看出甲醇和乙醇是較好的川桐皮中總黃酮提取劑。分析原因可能與川桐皮中總黃酮的結(jié)構(gòu)及存在狀態(tài)有關(guān)。因為苷和苷元、單糖苷、雙糖苷或三糖苷等在不同的溶劑中有不同的溶解度。從川桐皮總黃酮在甲醇、乙醇中浸出率較高，在丙酮、乙酸乙酯、石油醚中浸出率較低的事實，結(jié)合黃酮、黃酮醇、查耳酮、二氫黃酮及二氫黃酮醇等的性質(zhì)，可以推測，川桐皮總

21、黃酮中黃酮類、黃酮醇類、二氫黃酮醇類的含量相對較高。雖然甲醇的浸出率略高于乙醇，但由于甲醇有毒，考慮到試劑的價格和安全性，所以，本研究后續(xù)實驗選擇乙醇作為提取劑。（2）粉碎度對提取率的影響的實驗可以看出川桐皮粉碎到過80目篩是總黃酮提取時適宜的粉碎度。分析原因，可能與總黃酮存在于川桐皮的特定組織有關(guān)。隨粉碎度的增加，更多的組織結(jié)構(gòu)被破壞，其總黃酮能被溶劑更多地提取出來，但當(dāng)粉碎達(dá)到一定程度后，進(jìn)一步提高粉碎度，提取量不表現(xiàn)為繼續(xù)增加。（3）乙醇濃度對提取率的影響的實驗可以看出不同乙醇濃度（體積分?jǐn)?shù)）條件下，川桐皮總黃酮的浸提率差異較大。分析原因，可能與川桐皮黃酮類化合物中既含有苷，又含有一定量

22、的苷元有關(guān)。因為在不同濃度的乙醇溶液中水和乙醇的相對含量是不同的，苷和苷元在不同濃度的乙醇溶液中有不同的浸出特性；在乙醇濃度為 70%（體積分?jǐn)?shù)）左右時，苷和苷元被浸提出的總量較高。提高乙醇濃度，浸提率因苷的溶解度降低而降低。鑒于此，后續(xù)研究選擇了70%乙醇溶液為提取劑。（4）浸提時間對提取率的影響的實驗可以看出不同時間段下，川桐皮總黃酮的浸提率差異較大。分析原因可能與總黃酮中的某些組分在試驗溫度下分解損失，或與浸提時間延長，淀粉糊化量增加而阻礙了部分總黃酮被浸提出來有關(guān)。（5）浸提溫度對提取率的影響的實驗可以看出不同溫度范圍內(nèi)，川桐皮總黃酮的浸提率差異較大。分析原因，可能與在一定溫度范圍內(nèi)升

23、高溫度有利于提高總黃酮溶解度有關(guān)；但當(dāng)溫度超過70后，可能因淀粉部分糊化阻礙總黃酮浸出，或因部分熱不穩(wěn)定成分受熱被破壞有關(guān)。（6）料液比對提取率的影響的實驗可以看出不同料液比條件下，川桐皮總黃酮的浸提率差異較大。分析原因可能與川桐皮中總黃酮含量較高，而在溶劑內(nèi)的溶解度又有限有關(guān)。當(dāng)溶劑用量在一定范圍內(nèi)增加時，總黃酮的浸出量增大，浸出率增加。但當(dāng)溶劑用量增加到一定程度后，川桐皮中總黃酮幾乎已全部溶出，此時增加溶劑用量不能進(jìn)一步提高浸出率。因此，選擇適當(dāng)?shù)囊毫媳葘μ岣叽ㄍ┢S酮的浸出率和減少溶劑用量有著重要的意義。（7）在進(jìn)行正交試驗時，依照單因子試驗結(jié)果較好的參數(shù)：乙醇濃度、浸提時間、浸提溫度、

24、料液比。得出料液比對川桐皮總黃酮浸出率的影響最大，乙醇濃度、提取溫度次之，提取時間對總黃酮的浸出率影響最小。在溫度為70 條件下，以70 %（體積分?jǐn)?shù)）乙醇溶液為提取劑，料液比1:25(g/mL)，回流浸提120 min，川桐皮總黃酮提取量達(dá)到54.12 mg/g。參考文獻(xiàn)1 周長海刺楸資源的培育及開發(fā)利用林業(yè)科技開發(fā)，2005，19(2)，57-58.2 四川省衛(wèi)生廳四川省中藥材標(biāo)準(zhǔn) S19873 朱瑋，賈夏，張鞍靈，等刺楸屬植物化學(xué)成分及生物活性研究進(jìn)展 J，西北林學(xué)院學(xué)報 ,2004，19(3) ，119-124.4 匡海學(xué).中藥化學(xué)專論M.北京:人民衛(wèi)生出版社,2010:339-340.5 宋曉凱.天然藥物化學(xué)M.北京:化學(xué)工業(yè)